免疫缺陷动物复习资料

第一章 基因突变动物

一、基因突变

“基因突变”是指基因结构的改变，包括DNA碱基对的增添、缺失或改变，包括自发性突变、诱发性突变，根据基因突变的表现型效应分类，形态突变、致死突变、生化突变 利用模式动物研究基因功能的基本思路

1.正向遗传学（Forward genetics）：从表型到基因：

通过随机诱变技术制备特定表型的突变动物，通过遗传学分析、染色体定位、分子克隆等手段，最终克隆导致突变表型的突变基因。 优点：可获得较完整的遗传信息

缺点：遗传分析与相关基因克隆是一繁琐过程 2.反向遗传学（reverse genetics）：从基因到表型：

从特定基因的改造到整体动物表型分析：通过向动物基因组增加一个基因（转基因）或删除一个基因（基因敲出），观察动物表型变化，进而分析基因与表型的关系，研究基因功能 优点：

能深入、系统地研究特定基因功能，能在较短时间获得详实的研究资料 缺点：

动物表型往往受多基因调控，一个基因改变不能反应生物学机制的全貌 单纯的表型分析往往会“漏掉”一些主要信息 基因突变产生的结果

1. 多数基因突变并不引起性状改变2. 少数基因突变可引起性状改变 基因突变的意义

突变是生物进化、分化的分子基础，突变是某些疾病的病变基础，人类疾病动物模型 二、基因突变动物 (一)概念：

基因突变动物（genic mutant animals）是指在动物的繁育生产中，遗传基因发生突变而使动物具有了原性状外的某种特殊性状的动物。将这些突变动物按照科学研究的要求进行定向培育，使育成的动物符合实验要求，称其为“突变系”动物（mutant strain animals）

第二章 免疫缺陷动物

一、免疫缺陷(immunodeficiency diseases)： (一)概念：

是指因免疫系统中任何一个环节或其组份因先天发育不全或后天因各种因素所致损害而使免疫活性细胞的发生发展、分化增殖和代谢异常并引起免疫功能不全所出现的临床综合征。 (二)免疫缺陷分类大体分为两类

先天（或原发）性免疫缺陷。遗传性缺陷病可以导致对病原微生物的高度易感性

获得（或继发）性免疫缺陷可继发于营养不良、恶性肿瘤、免疫抑制药物治疗或免疫活性细胞受到病毒的感染，如HIV，是AIDS的病原体 (三)抗体从母体到幼体的传递

存在两种传递方式：① 出生前在胎盘、卵黄囊或羊膜内完成 ② 出生后从初乳获得。 二、免疫缺陷动物 (一)概念：

免疫缺陷动物（Immunodeficient animal）是指由于先天性遗传突变或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。 (二)分类

自发性突变spontaneously mutant 诱发突变mutagen exposed lines 遗传工程或转基因genetically engineered deleted or transgenic

第三章 T淋巴细胞免疫缺陷动物

一、裸小鼠特征

全身无毛、裸体、胸腺缺乏、雌裸鼠母性差、抵抗力低下、生长发育迟缓、细胞免疫力低下，B淋巴细胞正常，但功能欠正常、毛呈弯曲或卷曲状，不能到达表皮

患T淋巴细胞缺乏的动物有：裸小鼠、裸大鼠、豚鼠、丹麦黑白花牛。

第四章 裸鼠的应用

一、裸小鼠（Foxn1nu）在生物医学研究中的应用

（一）组织移植（人类肿瘤移植）研究（二）肿瘤药物治疗和肿瘤免疫研究（三）免疫和遗传研究（四）病毒、细菌、寄生虫感染机制的

研究（五）生物制品的检定（六）内分泌和老年医学上的应用 二、裸大鼠 (一)基本介绍

基因符号（突变基因）为rnu，以裸大鼠代替裸小鼠，具有移植瘤大、取血量多、可行某些外科小手术等优点 (二)特点

1．免疫器官及血细胞特性： 1）免疫器官的组织学，与裸小鼠近似

2）在3周龄裸大鼠纵膈的连续切片中，只见胸腺残体，内有未分化的上皮细胞及小囊肿，而未见淋巴细胞

3）裸大鼠的白细胞总数在正常鼠范围之内，但分类计数却有明显不同。纯合子（nznu/nznu）的中性白细胞较杂合子（nznu/+）高4倍，而杂合子的淋巴细胞较纯合子高2.5倍。

4）纯合子裸大鼠（rnu/rnu）肠系膜及腘淋巴结相对小于杂合子（rnu/+）。 2． 免疫功能特性

T细胞功能：先天性无胸腺，T细胞功能明显有丧失、对T细胞有丝分裂原（植物血凝素、刀豆球蛋白和美洲商陆）的淋巴细胞转化试验呈

阴性反应

B细胞功能正常：用抗Ig及抗T细胞抗体对rnu/rnu及rnu/+大鼠脾和淋巴结细胞行免疫荧光染色检查，发现在rnu裸大鼠，Ig+标记的细

胞比例增加，而大多数Ig+标记细胞被认为是B淋巴细胞

NK细胞活力增强：裸大鼠NK细胞活力高于胸腺大鼠、小于3周龄者未能测及NK细胞活力、用干扰素诱导剂可以提高NK细胞活力、NK

细胞活力的加强与干扰素的水平有关 3. 其它特征

（1）体毛稀少：裸大鼠并非象裸小鼠那样完全无毛，而是体毛稀少，有时暂时完全消失，以后又复现。年龄较大的雄裸大鼠的尾根往往多毛

（2）发育相对迟缓：与裸小鼠一样，rnu裸大鼠发育相对缓慢。其生长期体重仅相当于正常大鼠的60%一80%！ （3）易患呼吸道疾病 (三)应用

裸大鼠目前主要应用于人癌的移植研究。因裸大鼠无胸腺，缺少T细胞，故能成功地移植异种皮肤和异种肿瘤，包括小鼠肿瘤及人肿瘤 Festing首先报告了裸大鼠异种肿瘤移植（人结肠癌及小鼠浆细胞瘤），但移植瘤生长后自发消退。此后陆续见到有关人癌细胞株及手术标本移植于裸大鼠的报导。 三、Digeorge综合征

迪格奥尔格综合征是一种先天性T细胞缺陷，由先天畸形导致第三、四对咽囊发育缺陷造成。严重低钙和主动脉弓畸形。胸腺发育不全造成T淋巴细胞成熟障碍，外周血T淋巴细胞缺乏，数目明显减少。阻碍胚胎发育的Ash2l蛋白

第五章 其他免疫缺陷动物的基本特性及应用

一、B淋巴细胞免疫缺陷动物

(一)抗体缺陷病Deficiency of B Lymphocytes

B细胞缺陷可导致体液免疫应答缺陷，抗体减少甚至缺无。临床表现为反复的胞外寄生菌感染, 一系列Ig不同水平的减少。 (二)人类B细胞缺陷病

Ｘ 连锁无丙种球蛋白血症，又称Bruton无丙种球蛋白血症。 Bruton(1952年)首次报道。前Ｂ淋巴细胞数量正常，Ｔ淋巴细胞数量及功能正常。80%-90%临床诊断病例可检出相关致病基因BTK发生突变，BTK 属于非受体酪氨酸蛋白激酶。XLA发生的原因是由前B细胞发育为成熟B细胞的过程中发生障碍所造成的，通过剔除（knockout）btk基因研究发现：突变发生在Btk的不同结构域，其病变的轻重程度也表现不同。

在人类Btk自然发生的突变，是X-染色体连锁的无丙球蛋白血症（XLA）形成的原因，而在小鼠有一个相关的缺陷称为xid。 BTK 的遗传学特性：单基因遗传，Ｘ连锁隐性遗传。大多数情况男性发病，女性携带。 二、性连锁免疫缺陷小鼠（X-linked immune deficiency mice，XID） (一)品系免疫学特征

对Ｔ细胞非依赖性2型抗原无抗体应答：血中IgM及IgG3减少、脾脏中的B淋巴细胞数目减少、巨噬细胞活性异常、中性粒细胞活性异常、急性炎症减少、中性白细胞数减少、骨髓细胞生成受损

寿命：（SPF环境）J亚系雌雄寿命527天 Ca亚系雄性短486 天，雌性长825天。雄性寿命短与高的血胸发生率有关，SPF环境下对维生素K缺乏高度敏感

高肿瘤发生率 对高脂肪高胆固醇饲料诱导动脉粥样硬化有抵抗性，与C57BL/6J对照出生后有轻度听觉损伤 三、NK细胞免疫缺陷动物

（一） Beige小鼠：

为NK细胞缺陷的突变系小鼠bg基因为隐性，位于第13号染色体上，纯合子（bg/bg）被毛完整，但毛色变浅，常用亚系为C57BL/6J。细胞表型：“溶酶体酶分泌减少。色素沉着表型：虹膜色素异常 虹膜色素非常深且散在分布 四、SCID免疫缺陷小鼠

（一）严重联合免疫缺陷小鼠（Severe combined immunodeficiency mice,SCID小鼠）

Scid小鼠的突变基因符号为scid，是隐性突变基因；发现于CB-17/ICR品系，带有严重联合免疫缺陷基因。位于第16号染色体；纯合scid基因导致淋巴细胞的发育过程严重受阻，所以这种小鼠几乎完全丧失T和B淋巴细胞免疫功能

纯合scid基因导致淋巴细胞的发育过程严重受阻，所以这种小鼠几乎完全丧失T和B淋巴细胞免疫功能，造成低免疫球蛋白血症 （二） SCID小鼠的免疫生物学特性

外观与正常小鼠无异，生长发育正常，但胸腺、脾、淋巴结的重量一般为正常小鼠的30%；胸腺没有皮质结构，仅留残迹；脾小，无淋巴细胞聚集；淋巴结无明显皮质区，副皮质区缺失，呈淋巴细胞脱空状；所有T、B细胞功能测试均为阴性。巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、NK细胞及淋巴激活因子（LAK）正常。 (三)SCID小鼠在医学生物学中的应用

免疫功能更低，应用于肿瘤，（肿瘤生长更迅速，生长更快），免疫重建等（人淋巴细胞） 缺点：NK 活性高于正常鼠，产生免疫球蛋白渗漏现象

裸鼠有2个主要缺点：① 繁殖力低下（♀） ② 异种移植成功率差异大

第六章 免疫缺陷动物的选育及制备

一、医学实验动物的遗传标准化及育种方法 （一）实验动物标准化的意义

是实验结果准确性的保证、是实验结果可靠性的保证、是实验结果重复性的保证 （二）实验动物标准化的研究内容 1.实验动物遗传学质量控制

近交系(Inbred strain) 全同胞兄妹交配或亲子交配，连续繁殖20代以上而培育出来的品系动物，基因纯合度高，基因型相同。重复性好、相容性高、品系间的特异性，但生产饲养成本高，不耐受剧烈实验处理

杂交群(Hybrid strain) 由不同品系或种群之间杂交产生的后代。两个近交系杂交后生育的第一代动物，即杂交F1动物，重复性，稳定性；杂交优势；但F2出现遗传上的性状分离。

封闭群(Closed colony) 非近亲交配方式繁殖，不从其外部引入新个体，繁殖4代以上。 遗传组成的杂合性和相对稳定性；繁殖力强，生产饲养成本低。

突变系(Mutant strain) 基因发生了变异的动物。不是一个单独的遗传类别。关键在于是否携带突变基因。包括自发突变和诱发突变两大类。

自发性突变：基因组育种，即通过某些技术手段培育特定的动物模型，建立基因库，提升优良基因的频率，使优良性状通过遗传稳定地传递给所有后代

诱发性突变：利用物理因素改变染色体和基因（如X射线、r射线、紫外线、激光等）利用化学因素突变基因（亚硝酸、硫酸二乙脂等）利用生物学技术破坏基因的结构和表达（反转录病毒插入、转座子插入等、锌指核酸酶等） 二、转基因动物育种

（一）胚胎工程（embryo engineering）

涵盖了所有对配子和胚胎进行操作的技术方法，它的研究重点是在雌、雄生殖细胞到囊胚的各个发育阶段上实施体外操作技术 （二）超速排卵(superovulation)

促卵泡激素（FSH）促黄体激素（LH）孕马血清促性腺激素（PMSG）人绒毛膜促性腺激素（HCG） （三）体外受精(in vitro fertilization，IVF) 步骤1：精子与卵子的获取

精子来源：大、中型实验动物：一般通过人工按摩采精或假阴道采精；小型实验动物：通过手术，从附睾头部内取得成熟的精子。 卵子来源：大中型动物可通过腹腔镜吸取卵泡中的成熟卵子；在小动物中（如小鼠、大鼠和地鼠等），经过超排后可通过手术从卵巢或输卵管中取得。

步骤2：卵子成熟

在成熟培养液（M199或NCSU-23）中，将收集的未成熟卵培养至成熟期 步骤3：精子获能

让精子在体外获的受精的能力：采集精子，用培养液（如SP-TALP）洗涤精子，除去精清 ，然后在获能液中（20 µg/ml Heparin的mDM液 ）获能，标志：顶体反应 步骤4：受精

将成熟的卵子与获能的精子共培养，实现精卵结合。标志：第二极体的排除。

（四）胚胎移植（Embryo transfer）

1.结扎公鼠的制备2.超数排卵3.受体同期发情4.胚胎收集和预处理5、胚胎移植,找到输卵管膨大壶腹部 三、转基因动物 （一）概念

1.转基因动物（transgenic animals）：通过实验手段将新的遗传物质导入到动物胚胎细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基因动物

（二）转基因动物的常用方法：

显微注射法、核移植、逆转录病毒法、精子载体法、胚胎干细胞法 1. 基因显微注射法

（1）原理：又称DNA显微注射法，即通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵，使外源基因整合到基因组DNA中，发育成转基因动物 2、核移植技术

制备转基因克隆动物的方法及步骤（以猪为例）

卵巢的收集 、卵母细胞的采集 、卵母细胞的体外成熟培养、卵母细胞的核移植、核移植重构胚的激活 、手术移植 3. 逆转录病毒感染法

（1） 原理：利用逆转录病毒高效感染和高度整合的特性，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移

技术流程：逆转录病毒载体的构建、包装细胞为逆转录病毒载体提供包装蛋白、重组逆转录病毒感染早期胚胎 4. 精子载体导入法 （1） 步骤：

外源目的基因导入精子。方法：DNA与精子共育法、电穿孔导入法脂质体转染法；含外源目基因的精子与卵子受精。方法：人工授精、壶腹部手术授精、体外授精 四、免疫缺陷动物的选育与制备 （一）裸小鼠

指先天性无胸腺的裸小鼠。导致无胸腺的原因是由于位于11号染色体的隐性突变基因裸基因（nu）的作用。由于定向的遗传育种，目前裸基因已经回交到不同的小鼠品系中，因而具备不同的遗传背景。比如有NIH-nu、BALB/C-nu、C57BL/6-nu等不同遗传因子的裸鼠品系 （二）裸大鼠

雄纯合鼠（rnu/rnu）与雌杂合鼠（rnu/+）交配繁方法。新生仔鼠中纯合体与杂合体的鉴别，主要以触须的多少为据 （三）BNX小鼠的鉴定

bg、nu、xid为隐性突变基因。只有当这些基因纯合时才能表现出其基因的功能，因此必须对初次培育成功的纯合

子BNX小鼠进行鉴定，nu基因位于11号染色体上，最易鉴定，bg基因位于13号染色体上，测定NK细胞活性的方法来鉴定，xid基因是性连锁突变基因，对血清中IgG3和IgM 浓度分别进行定性与定量测定

BNX小鼠的应用

血液学研究：BNX小鼠为重度联合免疫缺陷动物，免疫排异反应弱，可以广泛地用于造血干细胞的异种移植实验，BNX小鼠已在血细胞的生成和以人造血干细胞为靶点的先天遗传性疾病的基因治疗研究中得到了应用。病毒学研究：BNX小鼠是研究病毒感染机制极好的动物模型，丙肝病毒(HCV)可以感染BNX小鼠，感染两周后即可在血清中检测到HCV 病毒，并能维持到实验结束(两个月)，出现与人丙肝相似的组织病理变化

BNX小鼠建立的肿瘤动物模型具有以下优点

成瘤率高，一般可以达到100％ ，成瘤时间早，一致性好，几乎同时成瘤，肿瘤大小个体差异小，便于实验分组，成瘤实验重复性好：一些即使在裸鼠和SCID小鼠体内重复性差的肿瘤，在BNX 小鼠体内也能得到较好的重复性 BNX小鼠已应用于人淋巴瘤、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的动物模型研究 五、免疫缺陷动物的饲养

1、饲养于SPF、GF、GN环境下 2、温度 室内温度：21.1℃ ~23.3℃，26～28℃ 3、饲料 灭菌 4、饮水 酸化水(pH2.5~2.8) 有效抑菌 5、垫料 碎玉米芯、硬木屑（孕鼠提供柔软铺垫物作窝用）