在小鼠体细胞中利用谱系特化因子诱导多能性

SUMMARY

诱导多能性的重编程因子主要是从促胚胎干细胞（ESC）生长的，与多能性有关的各种因子中识别出来的。在本文中，我们要报导的是，在小鼠体细胞重编程期间，谱系特化因子可以诱导其出现多能性，这类因子可以竞争性抑制从ESC中识别出的那一类提取物，这类因子中的大多数在ESC中含量并不高。我们发现在中内胚层（ME）特化过程和外胚层（ECT）特化过程中起作用的谱系特化因子可以分别代替多能性的核心调控物质OCT4和SOX2。OCT4及其替代物可以让已经高表达的一组ECT基因的表达程度衰减下来，SOX2及其替代物则可以减少重编程期间ME基因组的表达程度。令人惊奇的是，在OCT4和SOX2都不存在时，两种作用相反的谱系特化因子却可以协同诱导多能性。我们的研究提示可能存在一种“翘翘板模型”，在这个模型中，按固有模式应用多能性因子和/或其拮抗性谱系特化因子所形成的一种平衡，可以促进对细胞重编程的诱导。

INTRODUCTION

弄清楚在编程和重编程过程中细胞身份识别的机制是现代生物学的一个主要目标。过去数年中，人们一般认为多能性相关因子及其竞争物质谱系特化因子分别决定着多能性细胞和分化细胞的身份识别（Jaenisch and Young,2008;Young,2011）。与之相应，诱导多能性的重编程因子主要是从促胚胎干细胞（ESC）生长的，与多能性有关的各种因子，或者母系因子，像Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog，PRDM14，Sall4，Esrrb，Utf1，Tet2，以及Glis1，中识别出来的（Aoi et al.,2008; Buganim et al.,2012; Chia et al.,2010; Doege et al.,2012; Maekawa et al.,2011; Maherali et al.,2008; Takahashi and Yamanaka,2006; Yu et al.,2007）。同样地，人们也成功地用一些谱系特化因子，像Gata4和Hnf4a，实现了细胞从一种分化类型直接重编程成为另一种分化类型（Vierbuchen and Wernig,2011）。因此，那种“将细胞从A类型直接转变为B类型，应当通过一套B类型细胞中主要的调控因子来实现”的观点曾是主流方法（Graf and Enver,2009; Jopling et al.,2011）。但是，这种办法是不是改变细胞命运的唯一方法尚不清楚。

最近的一些研究数据表明，最关键的重编程因子，即能抑制ESC中分化相关基因表达的Oct4（Kim et al.,2008; Pardo et al.,2010），也足以将体细胞直接重编程为受诱导的多能干细胞（iPSCs）（Li et al.,2011; Zhu et al.,2010）。因此，找到Oct4的替代物以便弄清楚它的生理学作用，并深化对重编程机制的理解就显得非常重要，重编程的机制还有很多未知的地方。人们已经发现了一种Oct4的替代物，促ESC生长因子Nr5a2（Heng et al.,2010）。但Oct4的生理学机制仍不清楚，这是因为Nr5a2直接调控Oct4，并与其上游的启动子区域结合（Gu et al.,2005；Guo and Smith,2010）。因此，在包括但不限于ESC相关类因子的各种因子中广泛筛选新的Oct4替代物，可能会给人们理解重编程和多能性的分子机制带来新的曙光，从而促进更安全和更有效的重编程方法的出现。

本文中，我们发现8种谱系特化因子可以作为OCT4的替代物，其中包括GATA3，GATA6，以及SOX7，这些因子涉及到中内胚层（ME）的谱系特化过程。OCT4及其替代物可以让已经高表达的一组ECT基因，比如ECT谱系特化因子Dlx3，的表达程度衰减下来，SOX2和KLF4，以及c-MYC（SKM）则可联合启动ECT谱系特化因子的生成。缺乏OCT4或SOX2时，去除Dlx3可以增强细胞的重编程，在前一种情况下增强效果更大。另外，SOX2可以被在ECT谱系特化过程中起作用的ECT谱系特化因子，比如GMNN，所取代。令人惊奇的是，在OCT4和SOX2都不存在时，两种作用相反的谱系特化因子却可以协同诱导多能性。我们的研究提示可能存在一种“翘翘板模型”，在这个模型中，按固有模式应用多能性因子和/或其拮抗性谱系特化因子所形成的一种平衡，可以促进对细胞重编程的诱导。关于编程和重编程期间细胞身份识别机制这一基础性问题，翘翘板模型可以为其打开一种突破口。

RESULT

在小鼠体细胞中用GATA3诱导多能性

本研究中，我们对含10080个人类基因的原始质粒库（initial plasmid library）进行了筛查，以了解它们替代OCT4的能力，我们将其与表达SKM的病毒载体一起导入到小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）以进行重编程，MEFs含有一种绿色的荧光蛋白（GFP）指示剂，这种指示剂能够指示Oct4的启动子和增强子。通过测定能指示Oct4的 GFP呈阳性的克隆的数量，来评价重编程的效率。在第一次实验中，我们发现GATA3效率最显著（Figure1A and Table S1）。有趣的是，GATA3在ESC中含量并不高，它是细胞生长和分化的一种重要的调控物质（Figure S1D and Table 4）（Ting et al.,1996）。

我们用病毒载体进一步证实了在MEFs，小鼠成年皮肤成纤维细胞（MDFs），小鼠胃上皮细胞（GECs）以及小鼠角化细胞重编程过程中GATA3替代OCT4的能力（Figure1B,S1A,and S1B）。外源性基因的表达得到了确认（Figure S1E）。我们发现GATA3在重编程效率方面可与OCT4相比，甚至更甚一筹。我们接着评估了在缺乏SOX2，KLF4或c-MYC的时候GATA3对重编程的增强作用。我们观察到GATA3在缺乏c-MYC时也能增强重编程，但在SOX2或KLF4缺乏时它就不能增强重编程（Figure 1B）。接着，我们监测了GATA3诱导性重编程和OCT4诱导性重编程过程中的动态变化。我们发现在GATA3诱导性和OCT4诱导性重编程中，感染后（dpi）6~7天，都出现了Oct4-GFP阳性的细胞群（Figure 1C）。我们发现GATA3可能主要在感染后（dpi）4~7天起作用（Figure 1D），这段时期是细胞的多能性线路（pluripotency circuitry）正在重建的时候（Polo et al.,2012）。

由GATA3诱导产生的iPSCs具有多能性

由GATA3，SOX2，KLF4以及c-MYC（G3SKM）诱导产生的iPSCs与小鼠胚胎干细胞（ESCs）在形态学上相似（Figure 1E and S2A）。G3SKM诱导的iPSCs经过

长期传代后保持稳定，碱性磷酸酶（AP），SSEA-1，UTF-1以及NANOG染色阳性（Figure 1E, S2A,and S2B）。细胞中Nanog和Oct4启动子的甲基化水平与小鼠ESCs中的甲基化水平一样（Figure S2C）。病毒载体上的基因已经被整合到嵌合小鼠的iPSCs，畸胎瘤以及组织的基因组DNA中，并且没有表现出OCT4转基因整合的迹象（Figure S2D）。在这些细胞中，与多能性相关的内源性基因的表达被激活，而外源性GATA3，SOX2，KLF4以及c-MYC基因则沉默（Figure S2E），表明这些细胞已经完全重编程。G3SKM诱导的iPSCs能产生具有生殖能力的嵌合体（Figure 1F and 1G），并且通过畸胎瘤的构成特点，基因表达情况，以及其它化验结果，进一步确认了这些iPSCs（Figure S2F and S2G and Table S2）。

GATA3在以往的研究结果中作用很小 为了找出GATA3能够代替OCT4的潜在机制，我们检验了曾经报道过的几条能够促进或抑制重编程的路径。为了检测导入基因后GATA3是否使内源性Oct4的表达短暂升高，从而活跃表达的内源性Oct4与SKM一起诱导了多能性，我们使用了可被多西环素（doxycycline）诱导的，继用G3SKM（G3SKM-secondary）的MEFs（Wernig et al.,2008），监测其内源性Oct4的表达水平，其中20~40%可以被重编程。我们没有发现Oct4明显活化，直到Oct4-GFP阳性细胞开始出现（Figure 1H）。我们也没有发现与多能性有关的因子Nanog的明显活化，直到Oct4-GFP阳性细胞开始出现。

我们发现GATA3在间充质上皮转化（MET）中作用甚小（Li et al.,2010; Samavarchi-Tehrani et al.,2010）。另外，p53和p21的表达不受GATA3影响（Figure 2A）（Zhao et al.,2008）。此外，我们没有发现细胞增殖方面有任何明显改变（Figure 2B），这提示GATA3不是通过加速细胞增殖来诱导重编程的。这些结果提示，GATA3的作用是通过一种新的机制实现的，这种机制与以往研究中发现的那些促进重编程的机制不同。

OCT4和GATA3抑制了与ECT有关的基因，这些基因的表达能被SKM增强 为了进一步确定OCT4和GATA3在诱导多能性方面起的作用，感染后第7天，我们在动态监测（Figure 1C and 1D）的基础上做了RNA测序。根据基因本体论（GO）功能强化分析，其中属于OCT4和GATA3的那些共有的目标基因（shared targets）涉及到数种重要的过程，比如细胞黏附和调控转录（Figure 2C and 2D）。有趣的是，我们发现，导入SKM后，与MEFs相比，那些表达程度上升最大的上调基因与外胚层和表皮层的发育有关。而当OCT4和GATA3也随SKM一起导入后，表达程度上升最大的下调基因也是与外胚层和表皮层的发育有关（Figure 2E and 2F）。这一结果提示SKM可能具有引导细胞转变为ECT状态的潜能，而OCT4和GATA3对ECT相关性基因的抑制则可能促进诱导多能性。

在其它的谱系特化因子中筛检OCT4的替代物

现有的模型认为ESCs是通过一些多能性保护因子的作用来维持存在的，这些多能性保护因子共同阻止了细胞向任何一个谱系分化，从而维持未分化状态（Boyer et al.,2005; Silva et al.,2009）。更近期且更具有争议的观点认为多能性因子是像经典的谱系特化因子那样发挥作用，引导ESCs分化成一种特殊的谱系，同时使得它不能定型成为各种相互排斥的谱系（Loh and Lim,2011）。在ESCs中，OCT4促进了ME和原始内胚层的分化，并抑制了ECT的分化（Niwa et al.,2000；Thomson et al.,2011；Wang et al.,2012）。有趣的是，Gata3在ESCs中过度表达会使细胞向原始内胚层分化，而与Oct4类似，Gata3也在某些ME谱系中发挥作用（Nishyama et al.,2009）。OCT4和GATA3在谱系特化过程中的相似性提示可能还有其它的谱系特化因子能够替代OCT4。为了验证这种可能性，我们利用病毒过度表达来测试了数种其它的谱系特化因子（Table S3）。结果表明，GATA6，SOX7，PAX1，GATA4，CEBPa，HNF4a，以及GRB2可以替代OCT4来诱导多能性（Figure 3A,3B,and S1E）。已经发现这些谱系特化因子主要是在ME分化过程中的多能阶段（multiple stage），以及胚胎早期图式形成阶段起作用（Table S4）。这些能替代OCT4的谱系特化因子绝大多数在ESCs中含量不高（Figure S1D）。但是，那些主要在外胚层谱系特化过程中起作用的谱系特化因子（比如SOX1和ASCL1）不能替代OCT4（Table S3）。

其它OCT4替代物也能抑制那些被SKM增强的ECT相关性基因

由于OCT4和GATA3都减弱了能被SKM协同增强的ECT基因群的表达，我们便怀疑OCT4的其它替代物是否也能削弱这类基因群的表达。我们进行了微阵列检测，以分析其它OCT4替代物所起的作用。另外，我们分析了另一种谱系特化因子，MIXL1，作为一种阴性对照组，这种谱系特化因子虽然也参与ME的谱系特化，但不能取代OCT4。结果与我们的预期一致，除MIXL1以外的其它OCT4替代物，削弱了由SKM造成的ECT基因的上调（Figure 3C）。GO分析也显示，在引入除MIXL1外的其它OCT4替代物后，表达程度增高最显著的下调基因与外胚层及表皮层的发育，以及其它ECT特化关联性过程是有相关的（Figure S3）。

下一步，为了确认RNA测序和微阵列分析中所表现出来的这种可能性（Figure 2F and 3C），我们又做了实时定量PCR（RT-qPCR）检测。我们发现典型的ECT标志基因，比如Dlx3和Lhx5，受SKM上调，并且在引入OCT4及其替代物后显著下调（Figure 3D）。为了进一步确认这些发现，我们又进行了单克隆检测。我们获得了不同条件下的AP-阳性，Oct4-GFP-阴性的克隆，其中包括控制组SKM条件下获取的克隆。然后，我们将每个克隆机械性地分成两个亚克隆。我们分析其中一个亚克隆的基因表达情况，同时跟踪培养中的另一半亚克隆，观察其是否能成为Oct4-GFP-阳性及不依赖dox的细胞群（Figure S4）。在这种情况下，我们能分析这些有能力重编程的，被导向多能性的克隆。在SKM环境下生长的AP-阳性克隆不能表现出Oct4-GFP-阳性，提示它们不能重编程。我们发现在引入了OCT4及其替代物后，Dlx3和Lhx5相继下调（Figure 3E）。这一结果与混合细胞群中的

结果一致，支持了在大样本中观察到的谱系特化趋势。这些结果提示OCT4及其替代物可以抑制ECT-相关性基因的表达，这类基因能被SKM诱导表达。

在SKM存在的情况下，抑制一种主要的ECT相关基因，Dlx3，能促进重编程

为了检验OCT4及其替代物对ECT相关基因的抑制是否与促进重编程有关，我们进一步观察了在缺乏OCT4的情况下，降低主要的ECT谱系特化基因的表达是否也能促进重编程，这些ECT谱系特化基因能被SKM上调。我们发现在缺乏OCT4或SOX2时，降低关键的ECT标志基因Dlx3的表达，可以引发数种其它的ECT基因下调，从而促进重编程，缺乏OCT4时重编程的促进程度大于缺乏SOX2时（Figure 4 and S5），这一点从功能上支持了借助基因分析所得出的那些数据（Figure 2E,2F, and 3C-3E）。此外，通过有力的特性检验，已经证明了那些伴有Dlx3的shRNA的iPSCs具有多能性（Figure 4E,4F, and Table S2）。从来自“hmChIP”的已经发表的ChIP数据中，我们没有发现Oct4和Gata3明显地结合到Dlx3的启动子区域，这表明Oct4和Gata3可能是间接地调控Dlx3（Figure S5D）。总而言之，我们的数据表明OCT4及其替代物能减弱由SKM联合启动的对ECT相关基因的上调；这种抑制作用与其诱导多能性的作用相关。

SOX2及其替代物弱化了由OKM提高的ME相关基因的表达程度

类似于Oct4，Sox2也调控ESCs中的谱系特化。Sox2抑制中内胚层的分化，并促进神经内胚层分化（Thomson et al.,2011; Wang et al.,2012）。我们自然会问，重编程期间，在ECT谱系特化过程中起作用的那些谱系特化因子是否可以替代SOX2。甚至可以问，以前已经发现的那些SOX2的替代物，Sox1，Sox3以及RCOR2，是ECT发育过程的调控者呢，还是仅在神经组织中表达（Nagakawa et al.,2008; Tontsch et al.,2001; Yang et al.,2011; Zeng et al.,2010）。另外，我们证明了ECT谱系特化过程中涉及到的GMNN可以替代SOX2来促进重编程（Figure 5A, 5B, S1E, and Table S4）。

为了弄清楚SOX2及其替代物是否弱化了由OCT4，KLF4以及c-MYC（OKM）诱导的ME相关基因的表达程度，我们进行了微阵列和RT-qPCR分析。在引入了OKM后，一群经典ME标志物的表达程度得到了提高；这种表达程度的升高被SOX2及其替代物弱化（Figure 5C and 5D）。此外，我们做了与上文所述类似的单克隆检测，以检验具有重编程能力的细胞中的这种倾向。我们观察到SOX2及其替代物抑制了这些克隆中T和Eomes的表达（Figure 5E）。这些数据提示，在重编程过程中，SOX2及其替代物弱化了由OKM诱导的ME相关基因的表达。

“跷跷板模型”，提示相反力量的平衡能促进诱导多能性

一些不同的多能干细胞或祖细胞研究中，细胞经历了两次细胞命运决定，根据这些研究的结果，有人提出了细胞命运决定过程的双节点模型（例如，GATA1

和PU.1，PUNX2和PPARg）（Huang,2009）。这种模式图已经暗含“平衡的多能性状态”这一观念（Figure S6A and S6B）。为了更好地理解谱系特化因子引起的多能性诱导过程，我们在以往研究（Hanna et al.,2009; Loh and Lim,2011; Niakan et al.,2010;Niwa et al.,2000; Polo et al.,2011; Wang et al.,2012）和我们现有数据（Figure 2,3,4,5,S3,S4,and S5）的基础上提出一种“翘翘板模型”（Figure 6A and 7）。这一模型由两个模块组成，多能性模块和分化模块。多能性模块是由Oct4和Sox2共同活化而表现出来的，分化模块则是通过ME和ECT基因的共同抑制来完成的（Figure 6A）。

按该模型进行模拟，可以产生三种细胞状态：多能状态，ME状态，ECT状态（Figure 6B and S6C）。在体细胞状态下，是不能形成多能状态的（Figure 6C,box i）。但是，KLF4和c-MYC（KM）的过度表达可能充当一种驱动力量，减少重编程的障碍（Polo et al.,2012），从而多能状态成为了一个局限性的吸引子，如果有适当的干扰，体细胞状态就可以变成多能状态（Figure 6C,box ii）。注意，如果ME和ECT基因的表达力量被强行压制到蓝色区域，也就是如果它们处于平衡的话，多能状态是最容易达到的（高多能性潜能）。

这一模型得出的一个关键性的结果就是，多能性和重编程都可以通过对这个系统进行不同的干扰来实现，正如Figure 6D所阐述的那样。举个例子，SOX2单独过度表达，会使ECT基因开放，依次将细胞转变成ECT状态，而不管细胞初始状态如何（Figure 6D, boxi, S6I, and S6N）。OCT4与SOX2联合过度表达，则会拮抗ECT基因对多能性模块的抑制，从而允许细胞移向多能性吸引子区域（Figure 6D, boxii and iii, S6D, and S6E）。如该模型所提示的，保留多能性的更多途径请见Figure6D，S6，以及Table S5和S6。

从我们的模型中得出的某些结果，与以前的研究成果一致（Table S6）。多能性平衡均势被打破会使细胞进入各种分化状态。举例来说，加强OCT4的表达会使细胞横向分化成中内胚层造血细胞（Szabo et al.,2010）。SOX2，SKM加神经谱系特化因子，以及减少OSKM混合物中Oct4的表达，可以使成纤维细胞横向分化成为神经内胚层谱系（Han et al.,2012; Ring et al.,2012; Thier et al.,2012）。我们的模型发现的其它策略还有待进一步研究，以证实或证伪这个模型。

基于这个模型所作出的一个引人注目的预测就是当一种ME特化因子和ECT特化因子在OCT4和SOX2都缺乏的情况下共同表达时，它们可以协同增强重编程。不同分化模块之间相互拮抗的性质使得这个系统的行为可以形象地称之为“跷跷板”；当这个系统转向进入ME或ECT状态时，也就抑制了多能性模块，细胞便不再有机会进入多能状态。但是，当外源性表达的ME和ECT特化因子都处在合适的水平上时，由于它们相互抑制，所以它们的外源性表达可能不足以代偿其内源性表达的下降。分化模块可能终止于平衡区域，在这一区域，无论是ME特化因子还是ECT特化因子，其浓度水平都没有高到可以抑制多能性模块的水平。因此，一个自激活的多能性模块就会自动地开启，诱导多能性网络中的一系列活化，成功地实现重编程（Figure 6D, box v, S6G, and S6R-S6T）。

为了检验这一想法的可行性，我们筛检了不同的谱系特化因子组合。我们发现有两种组合可以在两种最关键的多能性因子，OCT4和SOX2，缺乏的情况下，促使细胞成功地重编程。这两种组合是：（1）GATA3，GATA6，PAX1，以及SOX1或SOX3；（2）GATA6外加GMNN（Figures 6E,6F,and S1E）。此外，已证明这些iPSCs具有多能性（Figure S7）。这些谱系特化因子在ESC中含量并不高（Figure S1D），暗示多能性的诱导和维持可能是两种不同的方案。

DISCUSSION

我们的数据展示出了这样一些证据，表明通常被认为拮抗多能性的那些谱系特化因子，GATA3，GATA6，SOX7，PAX1，GATA4，CEBPa，HNF4a，GRB2，以及GMNN，可以出人意料地刺激细胞重编程，并替代相应的谱系特化潜能因子。我们提出一种“跷跷板模型”，在这一模型中，当相互排斥的谱系特化因子之间取得平衡时，谱系特化因子可以促进重编程。有多种途径可以实现多能状态，所有途径都涉及到力量的平衡，若没有平衡，那些力量会使细胞进入分化过程。偏离平衡会将细胞导向不同的分化状态，降低细胞保留多能性的可能性。之前有研究发现某些谱系特化因子，比如Nanog的阻遏物Gata6，对重编程过程有阻碍作用（Chazaud et al., 2006; Mikkelsen et al., 2008），我们的假说对这项研究是一个补充。我们认为多能性因子可能引导谱系特化过程，而谱系特化因子则可能影响多能性的诱导；这一模型提供了一种新观念，那就是人们可以通过平常不出现在多能性诱导过程中的物质来到达多能性“目的地”。 我们的“跷跷板模型”与近期一种观点一致，该观点认为多能性因子按经典谱系特化因子那样的方式引导ESCs分化成为特定的谱系，同时相互抑制，这样就保证了不同谱系之间的相互排斥（Loh and Lim, 2011）。各种多能性因子协同作用就会使所有的谱系暂时被抑制，使细胞保持一种未分化状态。当所有的谱系特化力量都在彼此拮抗时，也就是说处于“跷跷板”的平衡点时，自激活的多能性模块就会激活。那时，没有哪个谱系的特化活性大到可以抑制多能性模块。多能性模块一经激活，SOX2和OCT4就会分别限制住ME和ECT状态，从而多能性状态得以继续。

大部分SOX2和OCT4的替代物都是以前所称的典型ME标记物（GATA6, GATA4, ect.）或ECT标记物（SOX1, SOX3, ect.）。为了让我们的模型简明易懂，这些谱系特化因子只分成两类，ME和ECT。但是这种分类不是绝对的，正如我们的“跷跷板模型”所指出的那样。ME和ECT是两个主要的互相排斥的谱系，但是在重编程的交响曲中，由不同的，并不限于ME和ECT谱系的各种谱系特化因子组成的一个巨大而错综复杂的，自相拮抗的联合体精密协同，完成诱导多能性的协奏。

“跷跷板模型”主要针对重编程中的一个主要方面：理解重编程图景中的含义，这一图景是由不同的细胞状态之间相互作用而形成的。自不必言，重编程并不仅仅是一个“跷跷板”。其它重要事件也参与重编程这一过程，例如表观改变。此外，重编程要想成功，还须克服一些很关键的障碍。不同的重编程因子各自发

挥其作用，刺激诱导多能性。随之而来的就是这些因子可能诱导副作用，例如刺激了谱系分化。除了有那些已经被报道的，激活多能性线路的功能，表观和细胞周期调控功能之外，KLF4和c-MYC还可以增加向特定谱系的刺激（Cao et al., 2012; Smith et al., 2010; Sridharan et al., 2009）以协同达到一种均势。在其它过程中也涉及到这些谱系特化因子的功能，需要更进一步的研究。

我们希望我们的这个模型能够成为一个起点：用新的方式来解释神秘的重编程密码。我们的结果提示，对能够替代OCT4和SOX2引导各自谱系特化作用的小分子物质进行化学筛查，是产生iPSCs的一种全新且可行的方法。我们的发现也说明了对多能性因子和谱系特化因子作用的传统观点，以及认为多能性调控线路是在重编程过程中确定的那种传统观点，做进一步研究的必要性。

EXPERIMENTAL PROCEDURES

筛查

用于筛查其能否替代OCT4的10,080 cDNAs是由Origene Co., Ltd提供。Oct4-GFP MEFs用SKM（SOX2，KLF4，c-MYC）慢病毒上清液（MOI:4）再加10ng/μl聚凝胺（Sigma）感染12小时。详细过程请见Extended Experimental Procedures

细胞培养

原始的MEFs，小鼠GECs，角化细胞，以及MDFs是从ICR×Oct4-GFP转基因小鼠身上取得的。小鼠GECs分离及培养的方法如前人所述（Aoi et al., 2008）。详细过程请见Extended Experimental Procedures

iPSCs的产生

我们使用的可用多西环素诱导的慢病毒系统如前人所述（Maherali et al., 2008）。进一步的详细过程请见Extended Experimental Procedures

诱导GATA3的时程

我们使用了可用多西环素诱导的慢病毒系统，所以tet-GATA3的表达可以被多西环素诱导，但pll3.7-ΔU6ΔGFP-SOX2，pll3.7-ΔU6ΔGFP-KLF4，或pll-ΔU6ΔGFP-c-MYC不能被多西环素诱导（Zhao et al., 2008）。多西环素是在不同的时间段里加入培养基的，感染后（dpi）10天开始统计Oct4-GFP-阳性的克隆数量。

iPSCs的特征

我们做畸胎瘤形成，以及嵌合体实验的方法如前人所述（Li et al., 2011）。RT-PCR，基因组PCR，以及RT-qPCR所用的引物列在Table S7中。对DNA进行的亚硫酸氢盐处理是使用CpGenome Fast DNA Modification Kit（Millipore）完成的。用于启动子扩增的引物如前人所述（Takahashi and Yamanaka, 2006）。免疫荧光检验的详细过程，以及AP（碱性磷酸酶）活性的检查过程请见Extended Experimental Procedures

单克隆分析

用不同的重编程混合物感染后第5天，使用AP（碱性磷酸酶）活性染剂（Invitrogen）来检验AP活性。然后选出AP阳性的克隆，将每个克隆分成两部分。其中一部分继续放在诱导培养基中培养2~4天。另一部分则在－80℃中冰冻起来。如果Oct4-GFP在之后这2~4天的诱导培养中变为阳性，并且在没有多西环素的4天里变得不再依赖多西环素，我们就会用Rneasy micro kit（QIAGEN）从冰冻的那部分克隆中分离出全部的RNA，进行RT-qPCR分析。

基因抑制（knockdowns）

Dlx3的抑制是使用含有抗嘌呤霉素基因的shRNA慢病毒载体（Sigma）实现的。更为详细的实验步骤请见Extended Experimental Procedures

蛋白质印迹（Western blotting）

细胞用PBS洗涤，用1×SDS样本缓冲液处理，然后煮沸（boiled）。其它的详细过程请见Extended Experimental Procedures

DNA微阵列

从iPSCs，MEFs，感染后7天的MEFs，以及R1中全部的mRNA均用Cy5示踪，杂合到鼠寡微阵列中（Phalanx鼠全基因组单阵列；Phalanx Biotec）。数据按照生产商的预定方案进行了分析。

RNA-序列

RNA序列基因库是使用Illumina mRNA-Seq预套装构建出来的。那些散碎片段，并且被随机致敏的200bp大小的配对末端基因库是用Illmuna HiSeq 2000测序的。细节请见Extended Experimental Procedures

统计学分析

我们对细胞增殖曲线进行了双侧配对Student’s检验。在其它实验中进行了单侧非配对检验。用标准差（SD）来量化差异。

模型构建

这个粗糙的模型是根据我们的实验结果，以及以前的研究结果而建立的。这个模型中涉及到的各种相互作用请见Figure6A的介绍。其它的细节请见Extended Experimental Procedures

基因库登录号

我们的微阵列及RNA-Seq数据现在已经可以在Gene Expression Omnibus（GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）上查到，登录号是GSE43995

补充信息

有关Extended Experimental Procedures，7幅插图，以及7个表格的补充信息，可以在http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.05.001上与本文一同找到。

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Chengyan Wang and Xiaolei Yin for helpful discussions. We also thank Haisong Liu, Jiancheng Wang, Zhiyuan Hou, Ren Li, Fangfang Zhu,Dongyi Xu, and Xing Zhang for technical assistance. J.S., C.W., and Y.W. conducted most of the experiments in this study. Z.L. performed the computer analysis and mathematical model analysis. H.D., Y.Z., and C.T. conceived ofand supervised the study. This work was supported by grants from theNational Basic Research Program of China (973 program grant numbers2012CB966401, 2009CB941101, 2010CB945204, and 2009CB918500), theKey New Drug Creation and Manufacturing Program (grant numbers2011ZX09102-010-03), the National Natural Science Foundation of China(grant numbers 90919031 and 11021463), the 111 project, and NSF (CMMI-0941355).Received: October 26, 2012Revised: February 13, 2013Accepted: April 15, 2013Published: May 23, 2013

REFERENCE

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