锦鲤致病性嗜水气单胞菌分离和药敏试验

第２４卷　第３期　２　０　０　２年５月　中国预防兽医学报　Ｖｎ１．２４．Ｎｏ　３　Ｍａｙ　２００２　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａ１．ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄ￣ｉｎｅ　锦鲤致病性嗜水气单胞菌分离和药敏试验　李炔荣，崔德凤，张耳　，盖晓曦　（北京农学院动物科学技术系．北京１０２２￣）　摘要：从北京某渔场发病锦鲤中分离出８株细菌。经形态学、生化特性鉴定及凝集试验，证明其中３株为嗜水气单胞苗。　通过溶血试验、脱脂奶琼脂平板法、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法及动物试验，显示这３株菌均能产生溶血毒素和胞外蛋白酶，并能致死小鼠。　药敏试验表明它们对常用抗生素呈不同程度的耐药性。　关键词：锦鲤；嗜水气单胞菌ｔ药敏试验　中图分类号：￥９４１　４２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８－０５８９（２００２）０３．０２０５．０４　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆＶｉｒｕｌｅｎｔＡｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｌｕ＇ｌａ　ｆｒｏｍＫｏｉ　ａｎｄ　ＳｕｓｅｅｐｔｉｂｍｔｙｔｏＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　Ｈ　Ｈｕａｎ—ｔｏｎｇ．ＣＵ　Ｄｅ－ｆｅｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｅｒ，ＣＥ　Ｘｉａｌ卜ｘｉ　【Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄＴｅｄｍｏｌｏ￣，＇Ｄ印ｏｆ　ＢｄｊｉｎｇＡ￣ｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ１０２２０６０，ＣｈｉｎａＪ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｉｇｈｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗ∽ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｄｉｓｅａｓｅｄ　Ｋｏｉ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｎｗｒｐｈｏｌｏｇｙ．ｈｉｏｃｈｅｎｆｉｓ￣ａｎｄ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　【ｅ　，ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒａｉｍ　ｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ　Ｔｈｅｓｅ　ｓｔａ＇ａｉｍ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｅｍｏｌｙｔｈｉｃ　ｔｏｘｉｎ　ａｎｄ　ｅｘａ＇ａｃｄｌｎｌｎｒ　ｐｖｏｔｅ￣，　ｎｄ　ｃｏｕｌａｄ　ｃａｔ，￣ｔｈｅ　ａｌｂｉｖ，ｏ　ｍ。ｕｓｅ　ｄｅａｄ　Ｓｏ　ｔｈｅｙ　ｒｅ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｏｆｔｈｅ　ｄｉｓｅａ．ｓｅｄ　Ｋｏｉ　Ｂｙ　ｓｅｔｔｓｉｔｉｖｉＢ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｔＯ　ｍａｔｉｈｉｏｔｉｅｓ，ｔｈｅ　ｌｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ｒｅｓｉｓ￣ａｌｅｅ　ｔｏ　ｕｓ　ａｎｄｈｌｏｔｉｃｓ　ｔｏ　ｇｒｅａｔｅｒ　ｏｆ　ｌｅｓｓ　ｄｅｇｒｅｅ．　Ａｅｒｏｍｏｒｕ２￣ｈｙｄｒｐｈｉｌａ；　Ｓｅｏｓｉｔｌｖｅ　ｔｅｓｔ　Ｋｅｙ　ＷＯｇ￣ＳＩ　Ｋｏｉ；　锦鲤是一种名贵观赏鱼类，２０００年１Ｏ月北京市　隆实验动物养殖厂。　某渔场大量饲养的锦鲤出现脱鳞及肠炎症状，直接　１．４标准菌株细菌。经形态学、培养特性、生化特性及血清学试　对此３株细菌进行了胞外蛋白酶和溶血毒素的测　Ａｈ　２－１，南京农业大学动物医学院　　影响了其观赏价值。我们从发病锦鲤内分离出８株　微生物实验室惠赠。１．５抗菌药敏纸片　有三种来源：一是上海医学　糖苷类４种：四环素、红霉素、碘胺药、复方磺胺、磺　验，鉴定其中３株为嗜水气单胞菌（ｓ太、　、、ｘ）　并　化验所生产的，包括口．内酰胺类抗生素１２种；氢基　定，以及动物试验和药敏试验。现将试验结果报告　胺药＋ＡＭＰ、氯霉素、氟哌酸、氯林可、多粘菌素；二　是北京天坛药物生物技术开发中心生产，包括头孢　如下。　ｌ材料和方法　１．１病鱼采自北京小汤山某渔场发病锦鲤，带　氨苄、卡那霉素、新霉素；三是参照文献［２］自行配　置，包括阿莫西林、仙逢久（头孢羟氢苄）、利复星。　１．６全菌抗血清按常规法自行制备。　１．７羊抗兔酶标抗体工作效价为１：１０００。华美　生物工程公司。　回实验室分离细菌。　ｌ　２培养基蔗糖胰蛋白胨肉汤、改良产毒素培养　基、１％脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板：参照文献　１．８发病锦鲤病鱼表现为精神状态不好，体表侧　［１］自行配置。其余培养基按常规方法配制　１．３　实验动物　小鼠、家兔，购于北京市海淀区兴　作者简介：李焕荣（１９６８一），女，北京农学院讲师、硕士，主要　从事动物微生物学与免疫学教学与科研工作．　＊２００ｌ届本科毕业生　收稿日期：２００１～０７—１３　线上下两排鳞片脱落，肛门红肿，剖检见内脏色黄质　脆，肠牯膜充血。用７５％酒精对体表进行消毒，无菌　操作取皮肤粘膜、鳃、肠粘膜、血、肝、胰脏等组织接　种于普通营养琼脂平板２８℃培养２４小时，然后划线　于普通营养琼脂平板，２８℃进行纯培养。　１　９细菌形态观察挑单个菌落涂片，经干燥、固　定，革兰氏染色镜检，观察细菌形态、染色特性。　维普资讯 http://www.cqvip.com

中国预防兽医学报　２０∞年　１．１０生化特性测定以微量发酵管法进行阿拉伯　死亡情况。　糖、甘嚣醇、水杨苷、硫化氢、七叶苷、肌醇、蔗糖的生　１．１４凝集试验取４种菌悬液ｌ滴分别与４种等　化试验；常规法分别进行葡萄糖产气、运动性、ｖＰ、鸟　量抗血清进行混合，不断摇动，室温下２分钟内出现　氨酸脱羧酶试验。氧化酶测定用试纸法，变红者判　明显凝集颗粒者判为阳性，均匀混浊者，判为阴性。　为阳性。　１，１５药敏试验按常规纸片法进行。培养温度为　１．１ｌ溶血毒素剥定在微量血凝板上分别加入所分　２８　。参照文献［５］的判定标准进行判定（表４）。　离的三株细菌培养上清，倍比稀释，然后加入等量不　同动物的ｌ％红细胞，于３７　放置ｌ小时，判定结果。　２结果　１．１２胞外蛋白酶测定　２．１分离茵株的鉴定共从病鱼体内分离出８株　ｌ，ｌ２．１脱脂奶琼脂平板法：将分离菌株接种于　细菌，分别编号为ｓ　（鳃），ｓ小（鲤），ｘ（血），Ｇ大（肝），　ｌ％脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板，２８　培养２４小　、（肝）、Ｐ★（皮）、Ｐ，ｂ（皮），ｃ（肠），括号内表示为分　时，茵落周围出现清晰透明溶蛋白圈者判为阳性。　离部位。８株菌革兰氏染色均为阴性。ｓ★与ｘ的　１．１２．２　Ｄｏｔ．ＥＬＩＳＡ法：参照文献［３，４］的方法，略作　细菌形态相似，为两端纯圆的短粗杆菌；Ｓ，ｊ、、Ｇ，ｊ、、Ｐ★　改动。点样、封闭、洗涤、显色相同，由于一抗为兔抗　的相似，为短杆菌，比ｓ太细；Ｇ　与Ｃ为粗短杆菌；　胞外蛋白酶（ＥＣＰａｓｅ５４）抗体，故二抗为山羊抗兔酶　Ｐｍ为细长杆菌。菌落特性，Ｓ灿ｘ、Ｐ　相似，均为光　标抗体。设Ｊ．１株培养上清为阳性对照，灭菌肉汤为　滑、湿润、半透明、边缘整齐、隆起的灰白色中等大小　阴性对照。　的圆形茵落；Ｓ，ｊ、为边缘整齐、隆起、光滑、半透明浅　１．１３动物试验取分离菌株ｓ士、Ｓ　、ｘ的２８ｑｃ２４　菌黄色圆形小菌落，　、为边缘整齐、隆起、无色、露　小时肉汤培养物，用灭菌生理盐水反复洗涤取沉淀　珠样针尖大小的圆形茵落；Ｇ★、Ｇｌ、、Ｃ未记录。生化　菌体，将其配成３亿浓度，腹腔注射健康小鼠０．２ｍｌ／　特性见表１。　只，每组两只。同时设生理盐水对照组，观察发病及　表１分离菌株的生化试验结果　ＴｅＮ．ｅ２　ｒｅｍｌｌｔｓ　０ｆ　ｂｉ腿　酬ｔｅｓｔ　氯化酶Ｏｘｌｄｅｓｅ　＋　＋　＋　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　葡萄糖ＧＩｕｃｏｓｅ　（＋）　（＋）　（＋）　一　（＋）　＋　蔗糖Ｓｕｃｒｏｓｅ　＋　＋　＋　一　（＋）　一　阿拉伯糖Ａｒ￣ｂｉ　ｒｍｅ￣　＋　＋　＋　（＋）　（＋）　Ｄ　甘露醇Ｍａｒｍｅｅｅ　＋　＋　＋　一　（＋）　¨　＋　水杨苷Ｓａｌｉｃｉｎ　＋　＋　（＋）　一　一　鸟氨酸脱羟酶Ｏｒａｉｔｉｔｈｉａｅ　ｄｅｃａｒｂ３ｘｙｌｎｓｅ　一　一　一　一　一　砬他氢玛５　一　一　一　一　＋　七叶苷Ａｅｓｃａｆｌｉｎ　＋　＋　＋　一　一　肌醇ｋ一　一　一　一　一　一　ＶＰ　Ｖ。ｇ曙一Ｐ　叫ｅｒ　＋　＋　＋　一　一　运动性‰ｉｌ】”　＋　＋　＋　＋　＋　注：“ＨＤ　表币未铡　十”表示产酸，　ｔ＋）”表示产酸、产气．”一　表示不发酵　镐：“ＮＤ＂…０　ｄｅｔｃｔ￣ｆｉｎａｔｉｏｎ，“＋”ｍ啡玛ｐｒｏｄｕｃｌｎ￣ａｃｉｄ，“（＋）”Ⅱ　ｐｍ　吨ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｇａｓ．“～”ｔ—ｎｏｆｅｒｍｅｎｔ　２．２溶血毒素测定将分离菌株进行毒素的测定。　２．３．１脱脂奶琼脂平板法：分别将３株细菌接种于　结果为：Ｓ★、Ｓ　Ｘ可使人Ｏ型、绵羊、鸡、鸭、鲫鱼、　ｌ％脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板，经培养，检测到　小鼠红细胞发生溶血。溶血性以ｓ★最强，ｓ，ｉ、次　ｓ　ｓ］、、ｘ均产生胞外蛋白酶。　之，ｘ较弱。但对人。型、鸡、鸭的溶血性基本相似。　２．３．２　Ｄｏｔ．ＥＵｓＡ法：将３株细菌的培养上清经点　２．３蛋白酶测定　样，一抗、酶标二抗孵育和显色，与阳性对照均显出　维普资讯 http://www.cqvip.com

第３期　李焕荣，等．锦鲤致病性嗜水气单赡菌分离和药敏试验　褐色斑点，而阴性对照无褐色斑点出现。　２．５凝集试验将培养的４种菌悬液分别与等量　２．４动物试验将经培养洗涤的菌体悬液接种小　ｘ均有不同程度精神萎　的４种菌的抗血清进行凝集试验，结果见表３，从表　３可知，ｓ大血清型与Ｊ＿１株相同，Ｓ，ｈ、Ｘ与Ｊ－１株不相　同，　Ｘ二者血清型也不尽相同。　鼠，注射后４小时ｓ大、　顿、躯体卷缩，注射ｓ大、ｓ小的小鼠１Ｏ小时全部死　亡；注射Ｘ的小鼠２４小时、４８小时各死１只。　表２凝集试验结果　Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　０ｆ增　ＪｔｊⅡ蜘ｔｅｓｔ　注：“＋”表示凝集，“一”表示不凝集　Ｎｏｔ￣：　＋　｜一ａｇｇｌｕｔｌｎ￣ｍ．　一　帕　ｎ０　ａ盟】　ｎ　∞　表３药敏试验判定标准与结果　＂ｌ＇ａｈｌｅ　３　Ｔｈｅｅｒｌｔｅｒｉａ　０ｆＪｕｄｇｅｍｅｎｔ　ｔｈｅ　０ｆａ喇　￣ｖｌｔｙｔｅｓｔ　Ｕｎｉｔ：ｌｌＩⅡ　维普资讯 http://www.cqvip.com

２０８　中国预防兽医学报　２００２疰　２．６药教试验选用Ｂ．内酰胺类、氨基糖苷类、凹　环素类、太环内脂类、多肽类等３１种抗生素分别对　Ｓ　、Ｓ＾、ｘ进行药敏试验，结果见表３。表３显示，３１　种抗生素中抑菌作用最强的是头孢三嗪、头孢哌酮、　妥布霉素、四环素、丁胺卡那、卡那霉素、新霉素、复　方磺胺、链霉素、氟哌酸、氯霉素、多牯菌素、庆大霉　素、碘胺药＋ＡＭＰ、头孢羟氨苄、利复星，三种菌对其　均敏感；其次是头孢吱新、氧哌嗪青霉素、阿奠西林、　红霉素，三种菌对其中度敏感或敏感；最次是青霉　素，三种菌对其均耐药；苯唑青霉素、羟苄青霉素、氨　苄青霉素、头孢唑啉、头孢氨苄、氯林可、碘胺药纸　片，ｓｔ、ｘ对其耐药，Ｓ，、敏感；Ｓ，Ｉ、对头孢他啶耐药，　Ｓ　、ｘ中度敏感；Ｓ　对头孢噻肟耐药，Ｓ★、ｘ敏感　３小结和讨论　３．１根据分离菌株的形态学特征和生化特性，在氧　化酶试验是阳性的前提下，参考凌红丽【１Ｊ提出有运　动力气单胞菌的六项生化指标：葡萄糖产酸产气，发　酵甘露醇、阿拉伯糖、七叶苷、蔗糖，不发酵鸟氨酸脱　羧酶。鉴定所分离的８株细菌中有３株是嗜水气单　胞菌。并与标准对照株进行凝集试验。显示３株菌　血清型的不同，这与文献　介绍的嗜水气单胞菌血　清型多样性相一致　３．２嗜水气单胞菌广泛存在于淡水、土壤中，对多　种鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、哺乳动物，甚至对人　类也有致病能力，特别对鲤科鱼类危害严重，在公共　卫生上占有重要地位＿７一。这次我们从锦鲤体内分离　的３株嗜水气单胞菌均表现出不同程度的致病能　力。此３株细菌对鸡、鸭、绵羊、鲫鱼、人Ｏ型红细胞　均有不同程度的溶血性；蛋白酶测定阳性；对小鼠有　较强的致死能力。这与文献　所报道相符。由于条　件限制，不能做回归实验。但Ｗｏｎｇ等以乳鼠作为　气单胞菌毒力研究的动物模型　效果较好　因此，　作者认为此３株菌为锦鲤的致病菌。至于哪一株是　主要致病菌，或者是几株菌协同致病，还有待进一步　研究。　３．３药物防治是预防细菌性鱼病的重要技术之一。　但在水产养殖中滥用抗生素的现象较普遍，致使耐　药菌株大量出现，目前几乎所有鱼类病原菌都有耐　药现象的存在＿１　将分离的３株嗜水气单胞菌进　行药敏试验，结果显示，ｓ★、ｘ对广谱抗生素，如磺　胺药、羧苄青霉素、氨苄青霉素巳产生完全耐药，而　对复方磺胺、磺胺药＋ＡＭＰ表现敏感。一方面说明　在北京水产养殖中确实存在耐药性问题，这可能与　水产养殖中长期使用某一抗菌药物或作为饲料添加　剂应用有关；另一方面，说明合理配伍、联合用药避　免耐药性出现的重要性。对革兰氏阳性菌有较强抑　制作用的氯林可与青霉素，对气单胞菌作用微弱或　无作用，说明在临床使用抗生素药物时应根据各种　药物的抗菌谱及作用特点合理选药。　据文献介绍＿ｌ　，在水产养殖中Ｂ＿内酰胺类抗生　素并不是常用药物　而本试验显示，所分离的３株　菌对羧苄青霉素、氨苄青霉素、苯唑青霉素　及部分　头孢菌素呈现全部或部分耐药，其原因值得深思。　参考文献　［１］凌红丽，陆承平，胨怀青．等．嗜承气单胞菌幢验程序的研究［Ｊ］．　中国动物检疫．１螂，１５（３）：１—３．　［２］傅先强．刘占君．养禽厂禽病检验手册［Ｍ］．北京：中国农业出版　社．１９９７．　［３］李焕荣．陈忤青．陆晕平．等．嗜水气单胞菌胞外蛋白酶的检测　［Ｊ］水生生物学报，１９９７．２１（４）：９７—１１３ｏ　［４］沈隶芳．储卫华，艋承平．鱼类致病性气单胞苗诊断试剂盘的研　究［】］．中国兽医学报，２ｃｏｏ．２０（５）：４６４—４６，１　［５］赵静．杨汉眷，查振树．猪源太踊埃希氏菌对较新的１６种抗生索　敏感性［】］．中国兽医学报，２ｃｏｏ．２０（５）：４５９—４６１．　［６：陆承平．兽医檄生物学：Ｍ］．第３版．北京：中国农业出版杜，　２００１　［７］陆承平致病性嗜水气单胞苗丑其所致鱼病［Ｊ］．承产学报，１９９２，　１６（３）｝２２５—２２７　［＆１陵红丽，陆承平．６株气单胞菌的毒力园子及其对小鼠的致死性　［Ｊ］．中国兽医学报，１９９９．１９（３）：２２５～２２７　［９］Ｗｏｎｇ　Ｃ　Ｙ　Ｅ．ｈＩａ　赫Ｇ，ＨｅｍｅｎｒｏｅｄｅｒＭＷ，ｅｔ　．ＦＥＭＳＩｍｍｕｎｏ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｖｉｎｄ目・∞ｏｆ　Ａ㈣　Ｌ＇ｓｉｎｇ　ｓｕｃｋｌｉｎｇ　ｎｍｄｄ　ｏｆ　ｉｆｏｅｅ．　ｔｉ￣ｌ［Ｊ］．Ｎｅｄ　￣ｃｒ，Ｍｉｏｌ，１９９６，１５：２３３—２Ａ－Ｉ．　［１０］李爱华．王伟俊．鱼类病原苗耐药质粒研究概况［Ｊ］．中国兽医　学报，１９９８，ｌ８（５）：３０９—３１２　［Ｉｌ　汪建国鱼病防希实用技术［Ｊ］科学养鱼，１９９９，（２）：８—１０．