急性毒性试验(改进寇氏法)

一、目的与要求

1、学习急性毒性试验的方法，掌握LD50的测定方法。 2、观察马钱子的毒性反应。 二、实验原理

急性毒性试验是指受试动物在一次大剂量给药后所产生的毒性反应和死亡情况。药物毒性的大小，常用动物的致死量来表示，因为动物生与死的生理指标较其他指标明显、客观、容易掌握。致死量的测定也较准确。在测定致死量的同时，还应仔细观察动物是否出现耸毛、倦卧、耳壳苍白或充血、突眼、步履蹒跚、肌肉瘫痪、呼吸困难、昏迷、惊厥、大小便失禁等不良反应。

致死量的测定常以半数致死量为标准。半数致死量是指能够引起试验动物一半死亡的剂量，妈药物致死量对数值，用符号LD50表示。由于LD50的测定较简便、可靠，而且稳定，现已成为标志动物急性中毒程度的重要常数。LD50测定的方法有多种，如Bliss法、改进寇氏法、简化机率单位法、累积插值法、机率单位-加权直线加归法等等。以上方法虽各有特点，但都有共同的要求：

（1）动物：均选用体重17～22克健康小鼠（同次试验体重相差不得超过4克），或选用体重120～150克（同次试验体重相差不得超过10克）健康大鼠作实验动物。性别相同或雌雄各半。

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（2）给药途径：要求采用两种给药途径，其中必须有一种与临床所采用的相同。溶于水的药物沿须测定静脉注射的LD50。值得提出的是，临床上虽然不用腹腔注射，但动物实验因腹腔注射给药方便，吸收迅速，颇为常用。若供试药物在腹腔内不引起强烈刺激或局部变化（如纤维性病变等），那么啮齿类动物腹腔注射的LD50，参数很接近于静脉给药的LD50。口服制剂无法通过注射给药途径时，可只用胃肠给药。

(3)试验周期和观察指标：给药后至少观察7天。观察期间应逐日记录动物的毒性反应情况和死亡动物的分布。

（4）正式试验前，均须先用少量动物进行预试试验，大致测出受试药物引起0%和100%死亡率的致死量范围，然后安排正式试验。正式试验组数不得少于三个剂量组，一般选用4～5个剂量组，每组动物数为10～20只。

（5）报告LD50时需注明实验动物的种属及品系、性别、体重范围、给药途径及每个剂量组动物数等，还需注明受试药物的配制方法、给药剂量、各组剂量间的比值（一般以0.65～0.85为宜）、给药容积、观察时间及计算方法。还须标出LD50的95%可信限。 三、实验材料和试剂

动物：小鼠 药品：马钱子水煎液

器材：注射器、灌胃针头、鼠笼 四、操作方法

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1、预试实验：预试实验目的是为了找出引起动物0%（Dn）和100%（Dm）死亡的剂量，以便安排正式实验。预试实验一般采用少量动物（6～9只小鼠）进行，将动物随机分为3组，组间剂量比值一般以1：0.5或1：0.7为宜。灌服或腹腔注射量以0.2ml/10g体重为度。预试实验应进行到找出Dn和Dm后方可安排正式实验。

2、正式实验：在预试实验测得Dn和Dm的剂量范围内设4～6个剂量组，最多10组。最理想的结果是使LD50的上下各有2～3组。组数愈少，准确性愈差。各剂量组的动物要求相等，至少10只动物（分组时应注意分层随机均匀化的原则）。本实验要求最大反应率为100%，最小反应率为0%， 或至少反应率接近100%或0%。组间剂量比值（1：K），常用1：0.8或1：0.75。如实验中出现相邻剂量有重复的100%和0%反应率时，应将靠边的组弃去不计，使大剂量组只有一个100%的反应率，小剂量组也只有一个0%的反应率。

分组完毕和各组剂量算出后，分组灌服或注射不同剂量的受试药物。为能得到理想的结果，实验最好从中间剂量开始，以便从最初几个剂量组动物接受药物后的反应来判断两端剂量是否合适，便于调整剂量和组数。为了提高实验的精确度和节省药物，受试药物可按“低比稀释法”配置。即使每只动物的用药体积相等（0.2ml/10g），而溶质不等。给药后逐日观察并记录中毒反应、死亡率和死亡情况。 五、实验结果记录与计算

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马钱子水煎液对小鼠死亡率的影响

组别

剂量g/kg(d)

1 2 3 4

Logd(X)

死亡数 死亡率（P）

P2

P-P2

公式1: （logLD50） X50=Xm-i(ΣP-05)

则LD50=log-1 X50

公式2： Sx50=i*(pp2)/(n1) 公式3：LD50的95%可信限=lg-1（X50±1.96S X50） LD50的平均可信限= LD50±（LD50高限- LD50低限）/2 Xm：最大剂量组剂量的对数值

i：相邻两组剂量（d）对数值之差，或相邻两组高剂量与低剂量之比的对数。 P：各组动物的死亡率，用小数表示。 ΣP：为各组动物死亡率的总和。 n：每组动物数。 Sx50：logLD50的标准误。

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