HepG2培养protocol

HepG2细胞培养

培养液配方：DMEM高糖培养基+10%FBS（胎牛血清）+1%双抗（青霉素+链霉素混合）（其中百分比均为某物质在培养液中的终浓度）

HepG2细胞传代培养（生物安全柜中操作）：

1：将长满细胞的培养瓶（皿）中的原培养液吸去

2：加入适量生理盐水（工作体积10ml培养瓶加入5ml，工作体积5ml培养瓶加入3ml），轻轻摇匀后吸去

3：加入适量胰酶（10ml培养瓶加入3ml，5ml培养瓶加入1ml），轻轻混匀后，计时3分钟后用手用力拍打培养瓶壁（可以看到细胞被消化后拍打后脱落的白色絮状物）

4：加入适量新鲜培养基后，吸打混匀（将培养基吸取到移液管中再打到培养瓶壁上，对培养瓶壁上残留的细胞吹下，吸打要反复几次直到混匀）。将混匀后的的培养液全部吸入到10ml离心管中。

5: 300g离心3分钟后，吸出上清后舍弃

6：加入适量生理盐水（10ml培养瓶加入5ml，5ml培养瓶加入3ml），将细胞沉淀反复吹打成细胞悬液。（吹打时要轻并避免产生气泡，细胞沉淀要完全吹散）。

7: 300g离心3分钟后将上清舍弃

8： 加入适量新鲜培养基（10ml培养瓶加入6ml，工作体积5ml培养瓶加入3ml），反复吹打将沉淀变为细胞悬液 （吹打时要轻并避免产生气泡，细胞沉淀要完全吹散）。

9：取出1/5-1/3体积细胞悬液 至新培养瓶中，加入适量新鲜培养基补齐培养瓶工作体积。吸打混匀。其余的细胞悬液可以冻存起来，步骤见下方。

10：放入CO2 培养箱中进行培养。一般3天即可长满培养瓶。

冻存细胞：

1：将上述9中的剩余细胞悬液吸入15ml离心管，300g离心3分钟后，将上清去除

2：加入适量血清（FBS）将细胞重悬后吸入冻存管中，再加入适量DMSO（使FBS终浓度为90%，DMSO终浓度10%）混匀。

3：慢冻：将冻存管放入4度冰箱1h后-20度冰箱1h，-80度过夜后即可放入液氮罐中长期保存。

注意事项：

1：为了保证无污染，所有操作均需在生物安全柜中进行，工作前将安全柜打开紫外照射

2：所有东西拿进（包括手）安全柜时都要喷酒精。

3：所有移液管均应为一次性，用后丢掉。