RT—PCR检测猪传染性胃肠炎病毒方法的建立

维普资讯 http://www.cqvip.com 中国兽医杂志２００３年（第３９卷）第３期　ＲＴ—ＰＣＲ检测猪传染性胃肠炎病毒方法的建立　吴国平　，尹燕博　，孙淑芳。，郭福生。，何后军　，龚振华。　（１．集美大学水产学院，福建厦门３６１０２１；２．山东澳兰生物工程研究所，山东青岛２６６５１５；　３．农业部动物检疫所，山东青岛２６６０３２；４．江西农业大学动物科技学院，江西南昌３３００４５）　中图分类号：￥８５８．２８５．３　文献标识码：Ｂ　文章编号：０５２９—６００５（２００３）０３—００１９－０２　猪传染性胃肠炎（ＴＧＥ）是一种以严重腹泻、呕　吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病，属于国　际兽疫局（ｏｌＥ）法典中Ｂ类疫病必检的猪传染病。　１．３　细胞　猪睾丸细胞系（ＳＴ）、ＰＫ。　购自上海动　植物检疫局。　１．４　引物　按Ｂｒｉｔｔｏｎ和ＰａｇｅＬ３］的方法选取　ＴＧＥＶ是一种有囊膜的正链ＲＮＡ冠状病毒。目前　检测ＴＧＥＶ的方法主要有中和试验、免疫荧光抗体　试验、酶联免疫吸附试验和电镜技术，这些方法对于　检测ＴＧＥＶ和防制ＴＧＥ起到了重要作用，但也存　在特异性不强、灵敏性差、耗时长等缺点。ｅＤＮＡ探　针、ＲＴ—ＰＣＲ近年来已成为国际上用于检测病原微　生物的主要方法。由于ｃＤＮＡ探针与临床样品中非　相关核酸有一定的非特异性结合，尤其是检测粪便、　ＴＧＥＶ　Ｓ基因一段高度保守区的序列作为扩增区。　上游引物（Ｐ１）５ｆ＿ＡＧＡＡＣＴＡＴＡＧＧＴＡＡＣＣＡＴＴ—　ＧＧ一３　，与Ｓ基因１６７８～１６９８位核苷酸相同；下游　引物（Ｐ２）５　一ＴＴＣＴＡＡＴＧＴＡＧＴＣＧＣＡＣＧＣＡＴ一３　，　与Ｓ基因２２３０￣２２５０位核苷酸互补；这对引物由中　科院上海细胞生物研究所合成，扩增长度为５７２　ｂｐ。　１．５　试剂Ｔａｑ酶、ＲＮａｓｉｎ酶、ＡＭＶ—ＲＴａｓｅ、　ｄＮＴＰｓ、ＰＣＲ　Ｍａｒｋｅｒｓ（入ＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢ＋ＥｃｏＲ１）为　尿液等复杂、不干净的样品更易产生较深的背景，影　响对阳性结果的判断，从而限制了它的广泛应用。　ＲＴ—ＰＣＲ方法因其特异、灵敏、快速和可直接检测　临床样品等优点，已成为检测ＴＧＥＶ的一种有效的　新方法。国内至今类似报道很少，本试验旨在建立检　测ＴＧＥＶ的ＲＴ—ＰＣＲ方法，为临床上诊断ＴＧＥ和　研究ＴＧＥＶ的流行病学提供灵敏、可靠的手段。　１材料　Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；异硫氰酸胍、Ｓｉｌｉｃａ为Ｓｉｇｍａ产　品；ＭＥＭ、胰蛋白酶为Ｇｉｂｅｏ公司产品；犊牛血清为　杭州四季青公司产品。　２方法　２．１　腹泻病料处理腹泻粪便用Ｈａｎｋｓ液稀释成　１０％的悬液４　０００　ｒ／ｍｉｎ，离心２０　ｍｉｎ．取上清经　０．２２　ｍ细菌滤器除菌后，一２０　Ｃ保存备用。　１．１参考毒株ＴＧＥＶ　Ｍｉｌｌｅｒ株细胞毒（简称Ｍ）　来源于美国、ＴＧＥＶ　Ｐｕｒｄｕｅ株细胞毒（简称Ｐ）系广　州动植物检疫局惠赠；猪轮状病毒细胞毒（简称Ｒ）　和猪瘟病毒细胞毒（简称ＨＣ）为农业部动物检疫所　保存。　１．２腹泻病料地，共２４份。　仔猪腹泻粪便样品收集自山东各　２．２　病毒增殖培养ＳＴ、ＰＫ。　细胞按常规传代培　养方法进行。将２株ＴＧＥＶ细胞毒用Ｈａｎｋｓ液对倍　稀释后接种于长满单层的ＳＴ、ＰＫ　细胞，至出现明　显细胞病变（ＣＰＥ）时冻融３次收毒，一８０　Ｃ保存备　用。对ＴＧＥＶ　Ｍ株ＳＴ细胞毒进行蚀斑试验，检测　病毒滴度。处理的腹泻病料按李佑民等　报道方法　进行病毒分离。　２．３核酸的提取异硫氰酸胍一步法：取细胞培养　液或处理的腹泻病料２００　ｌ，按Ｈｏｍｃｚｙｎｃｋｉ和　收稿日期：２００１—１１－２６　作者简介：吴国平（１９７２一），男，讲师，硕士，主要从事动物病原　微生物学研究。　Ｓａｃｃｈｉ［ｓ　报道方法萃取样品总ＲＮＡ作为反转录模　板。　３讨论与小结　３．１据报道脑炎型白痢主要发生于褐壳蛋鸡和肉　仔鸡，如伊萨褐蛋鸡、ＡＡ肉仔鸡和艾维茵肉仔鸡。　发病常见６～４０日龄，以１５～２Ｏ日龄达到高峰。发　病率不等，主要受饲养管理和用药等因素影响，一般　为２　～１２　，死亡率极高，几乎达１００　。而乌骨鸡　发生脑炎型白痢者少见报道。　３．２从Ａ、Ｂ、Ｃ　３组鸡的脑组织中分离到的３株细　菌，经形态学检查、培养特性和生化反应特性，确诊　为鸡白痢沙门氏菌。　３．３脑炎型白痢的病理变化除心脏、肝脏等表现出　白痢特征外，主要在大脑半球后部出现了明显的水　肿区和坏死区。组织学检查见大脑脉络丛内有化脓　性坏死灶，因而病鸡均表现有头颈扭曲或运动障碍　等临床症状。　维普资讯 http://www.cqvip.com 中国兽医杂志２００３年（第３９卷）第３期　２．４分步法ＲＴ—ＰＣＲ依次向０．５　ｍｌ　ＥＰ管中加　１２　ＰＦＵ的病毒量（图２），一步法ＲＴ—ＰＣＲ可检测出　１０－４０．２　ｍｌ（即１２０ＰＦＵ）的病毒量。　３．５　ＲＴ—ＰＣＲ对腹泻病料检测结果　２４份粪样中　共检出５份阳性，１９份阴性；对腹泻病料细胞培养　物检测，只有２分样品在第１代和第２代均检出阳　入５×ＲＴ　ｂｕｆｆｅｒ　４　ｌ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）４　ｌ，　ＡＭＶ—Ｒｔａｓｅ（１Ｏｕ／ｔ￣１）１　ｌ，Ｒｎａｓｉｎ（４０ｕ／ｔ￣１）１　ｌ，　Ｐｒｉｍｅｒｓ（２０ｔ￣Ｍ／Ｉ　）１　ｌ，ＲＮＡ样品共２０　ｌ于４２　Ｃ　温育６０　ｍｉｎ；取反转录产物５　ｌ加入含１０×Ｔａｑ　ｂｕｆｆｅｒ　２　ｌ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ／ｉ　）１．５　ｌ，Ｔａｑ酶（Ｚｕ／　性，其他样品细胞培养物均未检测到阳性结果。　１）０．５　ｌ，ＭｇＣＩ２（２５ｍＭ／Ｉ　）×　ｌ，ｄｄＨ２０共２５　ｌ，　覆盖２５　ｌ液体石蜡油后，置ＰＣＲ扩增仪自动循环。　２．５一步法ＲＴ—ＰＣＲ依次向０．５　ｍｌ　ＥＰ管中加　入１０×Ｔａｑ　ｂｕｆｆｅｒ　３　ｌ，ｄＮＴＰｓ（２．５　ｍＭ／ｉ　）３　ｌ，　ＡＭＶ—Ｒｔａｓｅ（１Ｏｕ／ｔ￣１）１　ｌ，Ｒｎａｓｉｎ（４ｕ／ｔ￣１）１　ｌ，Ｔａｑ　酶（２ｕ／ｔ￣１）１　ｌ，Ｐｒｉｍｅｒｓ（２０ｔ￣Ｍ／Ｉ　）１　ｌ，ＭｇＣ１２（２５　ｍＭ／Ｌ）Ｘ　ｌ，ＲＮＡ样品，ｄｄＨ　０共３０　ｌ，混匀后加　入３０　ｌ液体石蜡，４２　Ｃ３０ｍｉｎ反转录完后立即置　图ｌ　ＲＴ—ＰＣＲ的特异性　ＰＣＲ扩增仪自动循环。　１．空白对照．２．Ｍａｒｋｅｒｓ。３．Ｍ。４．Ｐ。　２．６　ＰＣＲ条件优化　将制备的ＴＧＥＶ细胞培养　５．Ｒ。６．ＨＣ．７．正常细胞培养物　物核酸样品作为标准，对影响ＰＣＲ的各循环参数　（Ｍｇ抖浓度、退火温度及循环次数）进行优化组合。　２．７　ＲＴ—ＰＣＲ产物的检测　采用１　琼脂糖凝胶　电泳法，以Ｍａｒｋｅｒｓ作为参照。　２．８　ＲＴ—ＰＣＲ特异性试验　对Ｍ、Ｐ、Ｒ、ＨＣ和正　常未接毒ＳＴ、ＰＫ　细胞培养物按上述方法进行ＲＴ—　ＰＣＲ。　ｌ　２　３　４　５　６　７　８　２．９　ＲＴ—ＰＣＲ敏感性试验　对经蚀斑试验测定的　图２分步法ＲＴ—ＰＣＲ的敏感性　ＴＧＥＶ　Ｍ株ＳＴ细胞毒培养物取２００　ｌ作连续１０　１．Ｍａｒｋｅｒｓ。２～８：１０。～１Ｏ　样品　倍稀释，按上述方法进行ＲＴ—ＰＣＲ。　２．１０电镜检测取ＴＧＥＶ细胞培养物、正常细胞　３．６电镜检测结果Ｍ、Ｐ二细胞毒检查为结果阳　培养物、腹泻病料细胞培养物、腹泻病料进行磷钨酸　性；２４份粪样中检测到２份阳性（属于ＲＴ—ＰＣＲ检　负染，电镜检测，以观察到冠状病毒颗粒样为阳性结　测到的５份阳性样品中的２份），２２份阴性；ＲＴ—　果，反之为阴性结果。　ＰＣＲ和电镜检测结果符合率为（２＋１９）／ｚ４—　８７．５　，两者特异性一致，但前者比后者敏感。对　３结果　正常细胞培养物、腹泻病料细胞培养物未检测到阳　３．１病毒增殖结果ＴＧＥＶ　Ｍ、Ｐ二细胞毒很容易　性样品。　适应细胞培养增殖，并产生ＣＰＥ。对ＴＧＥＶ　Ｍ株　４讨论　ＳＴ细胞毒蚀斑试验测定的滴度为６×１０　ＰＦＵ／ｍｌ。　腹泻病料进行病毒分离，经连续７次传代未见产生　４．１　本试验成功地建立了ＲＴ—ＰＣＲ检测ＴＧＥＶ　ＣＰＥ。　细胞毒和粪便毒的方法，敏感性最高达１２ＰＦＵ。其　３．２　ＲＴ—ＰＣＲ　经实验比较，分步法ＲＴ—ＰＣＲ在　中分步法ＲＴ—ＰＣＲ比一步法ＲＴ—ＰＣＲ敏感性高１０　本试验条件下，最佳Ｍｇ抖浓度为１．５　ｍｏｌ／Ｉ　；一步　倍，分析可能是由于一步法中的Ｔａｑ酶活性下降造　法ＲＴ—ＰＣＲ中最佳Ｍｇ抖浓度为２．０　ｍｏｌ／Ｌ。经条件　成。一步法由于操作更简便，减少了样品污染率，同　优化，最后确定的ＰＣＲ参数为：９４　Ｃ变性６０ｓ，５３’Ｃ　时敏感性仍很高（１２０ＰＦＵ），可满足临床样品检测，　退火６０ｓ，７２　Ｃ延伸７０ｓ，共３０个循环，最后７２　Ｃ延　值得推广应用。　４．２从上述结果可知，ＲＴ—ＰＣＲ、电镜和细胞培养　长３００ｓ。　３．３　ＲＴ—ＰＣＲ特异性试验　对Ｍ、Ｐ二细胞毒进　分离检测ＴＧＥＶ的敏感性逐渐下降。腹泻样品细胞　行ＲＴ—ＰＣＲ，都能扩增出一条特异目的条带，大小约　培养物前２代可检测出２份阳性样品，尔后继续传　５７２　ｂｐ。同时对Ｒ、ＨＣ和正常细胞培养物进行ＲＴ—　代样品检测结果却为阴性，这与细胞培养一直未出　ＰＣＲ，未扩增出任何条带（图１）。　现ＣＰＥ和电镜检测为阴性结果相一致，推测样品中　３．４　ＲＴ—ＰＣＲ敏感性试验　试验结果表明，分步　的ＴＧＥＶ并未在细胞培养中增殖，这也说明ＴＧＥＶ　法ＲＴ—ＰＣＲ最低可检测出１０　／０．２　ｍｌ的样品，即　的细胞分离较难，影响因素较多，有待进一步研究。