(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103994980 A(43)申请公布日 2014.08.20
(21)申请号 201410174352.9(22)申请日 2014.04.28
(71)申请人中国农业科学院兰州畜牧与兽药研
究所
地址730050 甘肃省兰州市七里河区小西湖
硷沟沿335号(72)发明人王晓力 王永刚 朱新强 王春梅
张茜 路远 汪晓斌 杨晓(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人王文君(51)Int.Cl.
G01N 21/31(2006.01)G01N 1/38(2006.01)
权利要求书1页 说明书5页 附图3页权利要求书1页 说明书5页 附图3页
(54)发明名称
一种茜素红S络合分光光度法测定铝离子含量的方法(57)摘要
本发明涉及一种茜素红S络合分光光度法测定铝离子含量的方法，该方法包括：准确移取1.5mL茜素红S溶液、0.15mL pH4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，然后于每份上述溶液中分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL铝离子标准溶液，加去离子水定容
静置10min，于490nm处测定光至5mL，混合均匀，
吸收值，以铝离子含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制铝离子标准曲线。本发明的检测方法具有操作简便、灵敏度高、测试结果准确、选择性好，符合测试精度要求。CN 103994980 ACN 103994980 A
权 利 要 求 书
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1.一种茜素红S络合分光光度法测定铝离子含量的方法，该方法包括：准确移取1.5mL茜素红S溶液、0.15mL pH4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，然后于每份上述溶液中分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL铝离子标准溶液，加去离子水定容至5mL，混合均匀，静置10min，于490nm处测定光吸收值，以铝离子含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制铝离子标准曲线。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，最终制得的线性回归方程为Y＝1.49305x+0.01071，R2＝0.99937，其中x代表铝离子的浓度mg/mL，y代表吸光值。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述茜素红S溶液由以下方法制备：称取茜素红S0.025g，溶于50mL无水乙醇中，用蒸馏水稀释定容至100mL。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述铝离子标准溶液由以下方法制备：称取0.89g AlCl3.6H2O(铝含量为0.1g)，用去离子水溶解并定容至100mL。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述磷酸氢二钠溶液由以下方法制备：称取磷酸氢二钠0.716g，用去离子水溶解并定容至100mL。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述柠檬酸溶液由以下方法制备：称取柠檬酸0.21g，用去离子水溶解并定容至100mL。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述pH4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液由以下方法制备：准确移取46.75mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和53.25mL0.1mol/L柠檬酸溶液，混匀至100mL。
8.权利要求1-7任一项所述的方法用于检测食品中的铝离子含量。9.根据权利要求8所述的应用，所述食品为无色透明液体饮料或可被硫酸消化处理的固体食品。
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一种茜素红S络合分光光度法测定铝离子含量的方法
技术领域
[0001]
本发明涉及属于分析检测领域，具体涉及一种茜素红S络合分光光度法测定铝离
子含量的方法。
背景技术
[0002] 铝盐被广泛用于餐饮业中的餐具和食品添加剂，环境治理的水处理剂以及医药中的免疫佐剂等，已经成为日常生活中不可缺少的一部分。然而，过量的铝盐随食品、药物、饮水等途径一旦进入人体，就会表现出生物毒性效应。有研究表明，老年性痴呆(阿尔茨海默病)、关岛帕金森氏痴呆综合症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化、和透析性脑病等神经失调性疾病、骨软化症及小细胞贫血等都与铝盐的过量摄入有关，有关病症被称为铝脑病、铝骨病。这些研究为公众健康敲响了警钟，所以准确、快速的测定铝含量是保证食品安全与工业高效生产的前提。[0003] 目前，铝含量常见的测定方法主要有EDTA络合滴定法、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP)及ICP质谱法(ICP-MS)、石墨炉原子吸收光度法、分光光度法、荧光分析法以及极谱法等。其中以铬天青作为显色剂的分光光度法应用最多，研究应用也最为广泛，但是该方法体系繁琐，需要加入乳化剂和增敏剂作为样品预处理(增溶)和方法灵敏度的手段之一。因此，本发明主要涉及一种基于茜素红S络合反应的简便、稳定、灵敏度和准确度高的测定铝盐中铝离子含量的可见分光光度法。[0004] 茜素红S(茜素磺酸钠，Alizarin S，ARS)是光度分析中应用比较广泛的一种羟基蒽醌类试剂，能与许多金属离子形成水溶性络合物，主要用于测定Ga3+、In3+和稀土元素离子的测定。在试剂介绍中提到：茜素红-S(茜素磺酸钠)(检验铝离子，pH＝4～9，产生玫瑰红色沉淀)。
[0005] 常规的茜素红S分光光度法测定蛋白质(赵丹华，茜素红S标记分光光度法测定微量人血清白蛋白，广州第二师范学院学报，2011年10月，第31卷第5期：51-54)步骤为：于25mL比色管中加入pH＝5.10的3.0mL B-R缓冲溶液，4.00mL5.0×10-4mol/L茜素红S，一定量的标准BSA溶液，稀释至刻度，静置20min，于λ＝420nm处吸光度A值，不加入BSA，按照上述步骤做空白，测定吸光度A0值，以二次去离子水作为参比溶液，测定吸光度值，令ΔA＝A0-A，以△A作为测定BSA的信号响应。因此，茜素红S可以被用作蛋白质含量的测定，但是由于金属离子对该测定方法的影响较大，不被作为常规蛋白质定量的方法。常规的蛋白质定量方法主要有考马斯亮蓝G250比色法和双缩脲比色法。[0006] 本发明利用茜素红S作为显色剂，采用响应面优化法研究了反应体系及反应条件，最终获得一种新的灵敏度高，选择性好，准确度高、简便的测定铝离子含量的实验方法。发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术的不足及国标法测试程序繁琐、周期长、成本高的缺点，提供一种反应体系简便、灵敏度高、测试结果准确，符合精度要求的基于茜素红S
[0007]
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说 明 书
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络合反应的紫外可见分光光度法测定铝离子含量的方法。
[0008] 本发明提供了一种茜素红S络合分光光度法测定铝离子含量的方法，该方法包括：准确移取1.5mL茜素红S溶液、0.15mL pH4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，然后于每份上述溶液中分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL铝离子标准溶液，加去离子水定容至5mL，混合均匀，静置10min，于490nm处测定光吸收值，以铝离子含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制铝离子标准曲线，其线性回归方程为Y＝1.49305x+0.01071，相关系数r为0.99937，其中x代表铝离子的浓度mg/mL，y代表吸光值。[0009] 上述方法中：
[0010] 所述茜素红S溶液由以下方法制备：称取茜素红S0.025g，溶于50mL无水乙醇中，用蒸馏水稀释定容至100mL。
[0011] 所述铝离子标准溶液由以下方法制备：称取0.89g AlCl3.6H2O(铝含量为0.1g)，用去离子水溶解并定容至100mL。
[0012] 所述磷酸氢二钠溶液由以下方法制备：称取磷酸氢二钠0.716g，用去离子水溶解并定容至100mL。
[0013] 所述柠檬酸溶液由以下方法制备：称取柠檬酸0.21g，用去离子水溶解并定容至100mL。
[0014] 所述pH4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液由以下方法制备：准确移取46.75mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和53.25mL0.1mol/L柠檬酸溶液，混匀至100mL。[0015] 本发明提供的方法适用于食品领域，主要用于无色透明液体饮料、可被硫酸消化处理的固体食品等。
[0016] 本发明的特点是：[0017] 1、本发明提供的方法是利用显色剂茜素红S在酸性介质中与铝离子络合反应，创建了一种新的紫外可见分光光度法测定铝离子的方法，其中关于反应体系和吸收峰的确定为：
[0018] 茜素红S溶液本色为黄色，在pH4.6磷酸氢二钠-柠檬酸酸性介质中，与一定浓度的铝离子形成稳定络合水溶物，颜色为红色，利用紫外-可见分光光度计对反应前后溶液进行全波长扫描，表明茜素红S溶液最大光吸收峰在420nm处，与铝离子反应后溶液最大吸收峰在490nm。因此，确定了反应体系为：pH4.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、茜素红S溶液和铝离子溶液，检测波长为490nm。[0019] 2、本发明主要是利用茜素红S在酸性条件下，与金属铝离子反应生成有色化合物，并随着铝离子浓度增加在490nm处光吸收值呈线性梯度增加，符合朗伯比尔定律。可溶性蛋白质、糖以及诸多金属离子对该方法影响较小，主要在于蛋白质、部分金属离子与茜素红S的反应最大吸收峰值不同，在490nm处的影响较小。本方法重在开发一种简便的准确测定金属铝离子的方法。[0020] 3、本发明提供的方法选择性、重现性和精密性均好，操作简单，适用测定浓度范围宽，符合精度要求，不需要昂贵的大型仪器。[0021] 4、本发明的方法适用于无色透明液体饮料、可被硫酸消化处理的固体食品等中铝离子含量的测定，食品中的蛋白质、个别金属离子Ga3+、In3+和稀土元素离子对本方法稍有影响，但影响较小。
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附图说明
[0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027]
图1：茜素红S溶液的紫外-可见全波长扫描图；图2：在酸性介质中，茜素红S与铝离子络合溶液的紫外-可见全波长扫描图；图3：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液添加量对反应体系光吸收值的影响图；图4：茜素红S溶液添加量对反应体系光吸收值的影响图；图5：铝离子标准溶液添加量对反应体系光吸收值的影响图(线性范围的确定)；图6：铝离子标准溶液浓度梯度与光吸收值线性相关曲线图。
具体实施方式
[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。[0029] 实施例1：溶液的预配制[0030] 1、茜素红S溶液(0.25g/L)的制备称取茜素红S0.025g，溶于50mL无水乙醇中，用蒸馏水稀释定容至100mL。[0031] 2、铝离子标准溶液(1.0mg/mL)的制备：称取0.89g AlCl3.6H2O(铝含量为0.1g)，用去离子水溶解并定容至100mL。[0032] 3、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的制备(pH4.6)：准确移取46.75mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和53.25mL0.1mol/L柠檬酸溶液，混匀至100mL。[0033] 实施例2：反应体系与最大吸收峰的确定[0034] 茜素红S溶液本色为黄色，在pH4.6磷酸氢二钠-柠檬酸酸性介质中，与一定浓度的铝离子形成稳定络合水溶物，颜色为红色，利用紫外-可见分光光度计对反应前后溶液进行全波长扫描，结果见图1和图2。
[0035] 图1结果表明茜素红S溶液最大光吸收峰在420nm处，图2结果表明，与铝离子反应后溶液最大吸收峰在490nm。[0036] 因此，确定了反应体系组分为：pH4.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、茜素红S溶液和铝离子溶液，检测波长为490nm。[0037] 实施例3：反应体系组分及条件的优化
[0038] 在实施例2的基础上对反应体系和反应条件进行了优化，分别研究了0.25g/L茜素红S溶液不同添加量(0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.5mL、1.8mL和2.0mL)、pH4.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液添加量(0.1mL、0.15mL、0.20mL和0.25mL、)和1.0mg/mL铝离子标准溶液添加量(0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL和1.0mL)对检测方法灵敏度和准确性的影响。[0039] 结果见图3-5：[0040] 由图3可知，在490nm处，在不同铝浓度梯度下(0.2-0.7mL)下，缓冲液添加量为0.15mL时，吸光值范围比较宽，灵敏度好，故选择0.15mL作为添加量；[0041] 由图4可知：在490nm处，在不同铝浓度梯度(0.2-0.7mL)下，茜素红S溶液添加量在1.5mL～1.8mL范围内，吸光值范围广，灵敏度高，稳定性好，从节约实验成本的原则考虑，故选择1.5mL作为添加量；[0042] 由图5可见：在茜素红S溶液添加量为1.5mL，磷酸氢二钠-柠檬酸添加量为
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0.15mL时，铝离子浓度梯度在0.0-0.7mL范围内，在490nm处的光吸收值梯度差异显著(线性方程斜率值较大)，线性关系良好。
[0043] 最终汇总得出最佳的反应体系为：反应体系总体积为5.0mL，不足用去离子水定容，其中茜素红S溶液加入量为1.5mL、pH4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加入量为0.15mL和铝离子的测定范围为0.2-0.7mg/mL；反应条件为：室温静置10min后，于490nm处测定光吸收值。
[0044] 实施例4：标准曲线的绘制[0045] 取8支比色管，每支比色管中准确移取1.5mL茜素红S溶液、0.15mL pH4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL铝离子标准溶液，加去离子水定容至5mL，混合均匀，静置10min，于490nm处测定光吸收值，以铝离子含量(mg/mL)为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制铝离子标准曲线(如图6)。[0046] 由图6可知：在茜素红S溶液添加量为1.5mL，磷酸氢二钠—柠檬酸添加量为0.15mL时，铝离子浓度梯度在0.0-0.7mL范围内，线性关系良好，线性相关方程为Y＝1.49305x+0.01071，R2＝0.99937，其中x代表铝离子的浓度(mg/mL)，y代表吸光值。(线性相关系数为r，主要用R2值来表示)[0047] 实施例5：方法学的考察
[0048] 在实施例4的基础上从重复性试验、精密度试验、加标回收率试验以及外源离子对反应体系的影响四个方面对检测方法进行验证。重复性结果表明，随机移取相同体积的铝离子标准溶液(1.0mg/mL)6份，按照上述方法对6份溶液进行测定，测得该6份样品中的铝离子含量分别为0.52mg/mL、0.53mg/mL、0.49mg/mL、0.48mg/mL、0.51mg/mL和0.50mg/mL，重复性以其RSD值来估计，RSD为1.87％。说明该方法测定样本中的铝离子含量结果变化不大，重现性较好。精密度试验结果表明，移取0.6mL铝离子标准溶液(1.0mg/mL)按照上述方法对此样本连续进行测定6次，测得铝离子含量分别为0.58mg/mL、0.56mg/mL、0.62mg/mL、0.61mg/mL、0.64mg/mL和0.62mg/mL，精密性以其RSD值来估计，RSD为2.94％。说明该方法测定同一样品中的铝离子含量结果变化不大，稳定性较好。加标回收率试验结果表明，在含有0.15μg铝离子的本底溶液中分别加入0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg标准铝离子，测定结果如表1。[0049] 表1：加标回收率试验结果
[0050]
表1结果显示：加标回收率分别为89.37％、98.97％、96.99％、92.57％和98.57％。由此进一步说明该方法重现性好，有较高的准确性和可靠性，能用于实验室快速测定铝离子含量；此外本发明还研究了外源离子K+、Na+、Zn2+、Fe3+和Cu2+对该方法测定准
[0051]
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确性的影响。
[0052] 结果表明，除了Cu2+有微弱的影响外，其他离子基本没有影响。[0053] 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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