环介导等温扩增技术在呼吸系统疾病中的应用

４１０　・床肺科杂志２０１　１年３月　第１６卷第３期　综　述・　环介导等温扩增技术在呼吸系统疾病中的应用　陈蚊颖　陈愉生　呼吸道感染和肿瘤，是威胁人类健康的主要疾病之一，其　死亡率居高不下，而肺癌常与某些疾病共存或其影像学形态　与某些疾病类似，故易误诊或漏诊。呼吸道疾病传统诊断方　术，是以ＳＰＡ基因为靶点，扩增ＭＲＳＡ特定蛋白Ａ、ｍｅｃ—Ａ基　因，以及耐甲氧西林的青霉素结合蛋白－２基因，并可在血培　养出现阳性结果后的２　ｈ内完成检测。这种方法与Ｄｒｔ—ＰＣＲ　法慢、敏感度低下，亟待一种快速，敏感、准确的诊断方法面　世。２０００年Ｎｏｔｏｍｉ等　首先发布环介导等温扩增技术，　ＬＡＭＰ作为一种快速准确、敏感度高的诊断方法备受瞩目。　目前，ＬＡＭＰ方法在各种领域得到广范应用，某些国家甚至已　批准其作为病原体鉴定和检测的常规方法，我们就ＬＡＭＰ在　呼吸道疾病的应用进展做一综述。　环介导等温扩增法（Ｌｏｏｐ—Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｉｆｃａ—　ｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）是利用一种链置换ＤＮＡ聚合酶（Ｂｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙ．　ｍｅｒａｓｅ）和两对特殊的引物，特异地识别靶序列上的６个独立　区域，在等温条件下（６５℃左右）保温几十分钟，即可完成核　酸扩增反应。反应结果可直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀　浊度进行判断，也可以藉由添加ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ、溴化乙啶　（ＥＢ）或其它核酸染剂进行呈色后观察。该技术由于特异性　强，灵敏性高，仅需普通水浴锅就能快速、高效、简便地对病原　微生物进行鉴定，因而具有推广性，可以作为常规的检测工　具。　在感染性疾病诊断中的应用　ＬＡＭＰ因具有高特异性、高效率和快速反应的特点，可以　大量扩增所需的靶序列，故被用于感染性疾病的诊断和病原　体的检测。　一、细菌的检测　１金黄色葡萄球菌的检测　耐药性细菌已成为医院感　染的重要病原菌，因此快速、准确检测耐药性细菌，对预防耐　药性细菌的感染具有重要意义。２００６年申建维等　在检测　耐甲氧西林金黄色葡萄球菌时将核酸杂交和ＬＡＭＰ技术进　行结合，用多重ＬＡＭＰ同时扩增金黄色葡萄球菌耐药基因　ｍｅｃＡ和ｆｅｍＡ，在反应体系中加入的２种不同荧光探针分别　与ｍｅｃＡ和ｆｅｍＡ基因的扩增产物互补结合，最后检测反应管　中的２种荧光值。结果该方法的最低检测限为１０　ＣＦＵ／ｍｌ，　与药敏试验结果相比较，灵敏度９９．０％，特异度９０．９％，证明　该方法灵敏度高，特异性强，操作简便快速，适用于临床样品　的直接快速基因检测。　２００７年，日本的Ｍｉｓａｗａ　Ｙ等　利用ＬＡＭＰ技术，在６３℃　恒温的条件下高特异性，高效率地扩增目的基因，以检测血培　养阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。这种ＭＲＳＡ—ＬＡＭＰ技　基金项目：福建省科技厅重点项目（２００９Ｙ００１０）　作者单位：１．３５０００１　福州，福建医科大学省立临床医学院呼吸内科　２．３５０００１福州，福建省立医院呼吸内科　通讯作者：陈愉生，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｌｙｙｙｗｂ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ　结果比较后显示，两者灵敏度分别为９２．３％和９６．２％，特异　性都为１００％，阳性率分别为９６．９％以及９８．４％。虽然两者　结果几乎相同，但是ＬＡＭＰ法更符合成本效益，并为临床实验　室提供快速优良的检测，因此ＬＡＭＰ是一个敏感可靠的新方　法用于诊断ＭＲＳＡ的血液感染，并指导合理应用抗生素。　２肺炎链球菌的检测　目前临床使用的检测方法鉴别　肺炎链球菌、轻型链球菌、口腔链球菌三种基因相似性链球菌　的结果不太理想，ＳＥＫＩ等　针对肺炎链球菌的特异性基因序　列ｌｙｔ　Ａ设计６条引物，利用ＬＡＭＰ法来检测肺炎链球菌，通　过对ｌ０株肺炎链球菌和６株非肺炎链球菌的检测验证了　ＬＡＭＰ法的特异性，ＬＡＭＰ的检测下限为１Ｏ个拷贝的纯化　ＤＮＡ，比ＰＣＲ法检测肺炎链球菌敏感１０００倍，时问只需６０　ｍｉｎ，作者认为利用ＬＡＭＰ法检测肺炎链球菌是一个可靠且敏　感的检测手段。　３百日咳杆菌的检测　对于百日咳杆菌的检测有细菌　培养及血清血方法。其费时费力，为了早期诊断，临床上针对　不同的靶序列有ＩＳ４８１一ＰＣＲ法和ＰＴｐｌ／ｐ２一ＰＣＲ法。Ｋａｍａｃｈｉｎ　等　利用ＬＡＭＰ对Ｂ型百日咳杆菌进行检测，可以检测１０　水平的ＤＮＡ，而ＩＳ４８１一ＰＣＲ和ＰＴｐｌ／ｐ２一ＰＣＲ只能检测出１　Ｐｇ　和１００　Ｐｇ水平的ＤＮＡ，且ＬＡＭＰ的特异性等同于ＰＴｐｉ／ｐ２一　ＰＣＲ，在对临床１１２例咽试纸的检测中．同样证明ＬＡＭＰ的灵　敏度高于ＩＳ４８１一ＰＣＲ。　４结核分枝杆菌的检测　目前我国肺结核患者较多，因　其传染性较强，需要治疗时间长，未得到及时的治疗预后较　差，故临床上一直在寻找快速准确的鉴别诊断生长缓慢的分　枝杆菌的方法。１ｗａｍｏｄｏ等　根据分枝杆菌属１６Ｓ核糖体　ＤＮＡ保守序列设计共用引物，采用ＬＡＭＰ方法可以检测出分　枝杆菌属病菌，他们还根据分枝杆菌不同种的ｇｙ　ｒＢ基因序　列的特异性，分别针对结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌和胞　内分枝杆菌设计引物从痰标本中鉴定结核分枝杆菌、鸟分枝　杆菌和胞内分枝杆菌。作者通过检测２４株分枝杆菌和７株　非分枝杆菌证实了ＬＡＭＰ法的特异性和敏感性。其操作非常　简便，仅将所有的反应物混合后６３℃孵育３０—６０　ｍｉｎ，即可　在反应试管中加入ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ进行检测。如果此项试验　成功并应用于临床，有望对肺结核的诊断带来革命性变化。　５　嗜肺军团菌的检测　军团菌在自然界广泛存在并可　导致高病死率，已成为世界性的公共卫生问题，引起普遍关　注。而传统的实验室诊断主要依靠细菌培养、生化反应和血　清学鉴定，所耗时间长，难以适应快速控制疫情的要求。Ｚｈｕ　ｓＲ等　７１２００９年根据嗜肺军团菌的ｍｉｐ基因设计了５引物（２　临床肺科杂志２０１１年３月　第１６卷第３期　４１　１　条内引物，２条外引物，１条环引物）的ＬＡＭＰ反应体系，并对　原体系进行了优化。其研究结果显示，此反应系统检测灵敏　度达到５个拷贝的纯化ＤＮＡ，反应过程仅需１．５　ｈ，反应结果　性质粒为模板，对实验中的几个重要参数进行优化，结果显示　ＬＡＭＰ检测方法对Ｈ５Ｎ１禽流感病毒的灵敏度达到４—６个拷　贝，其引物对于Ｈ１，Ｈ９亚型禽流感病毒和新城疫病毒无非特　异性扩增，表现出良好的Ｈ５亚型特异性。　三、支原体的检测　可视化。其敏感性和特异性均高于ＰＣＲ法。　二、病毒的检测　目前，检测和诊断病毒性疾病的传统方法有病毒中和试　验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光抗体试验、免疫荧光电子显　微镜技术及ＰＣＲ等，这些方法曾在病原体的检测和疾病的诊　断及研究中发挥了巨大作用，但存在的问题是需时长、操作复　杂、不利于现场检测等，限制了它们在病毒快速诊断中的应　用。ＬＡＭＰ技术具有快速、便捷、敏感、特异、结果易于判定、　由于肺炎支原体感染的常规检测方法有培养法、血清学　和核酸扩增技术，培养法条件要求较高，分离和鉴定需１～２　周，周期太长且阳性率低，因此对ｉＮ床帮助不大。血清学方法　灵敏度不高且要求采集病人急性期和康复期的血清标本，更　快更灵敏的ＰＣＲ和Ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ用于肺炎支原体的检测已　有报道，然而其需要昂贵的设备限制了其广泛运用。Ｓａｉｔｏ　便于现场快速检测和诊断疾病等特点，可对多种病毒进行检　测和鉴定，成为最有发展前景的快速诊断手段。　１严重急性呼吸综合征冠状病毒（ＳＡＲＳ—ＣｏＶ）检测　目前，临床上ＳＡＲＳ的检测方法主要有两种：一种是检测　ＳＡＲＳ．ＣｏＶ抗体，虽然这种方法的敏感性较高，但需在发病１０　ｄ后才可检出；另一种方法是Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ，这种方法可在　发病早期检出ＳＡＲＳ—ＣｏＶ，但是需要昂贵的仪器和熟练的技　术，不便于在ＳＡＲＳ暴发时进行常规检查。随着ＬＡＭＰ技术　的出现，２００４年ＨＯＮＧ等　根据ＬＡＭＰ的原理设计了一步　法、单管实时定量ＲＴ－ＬＡＭＰ方法，将ＳＡＲＳ—ＣｏＶ的Ｒｅｐ基因　逆转录为ｅＤＮＡ，利用ＬＡＭＰ技术检测ＳＡＲＳ—ＣｏＶ病毒。通过　对来自越南河内ＳＡＲＳ流行期间的４９份病人标本和１０份健　康人标本进行检测，结果发现ＲＴ—ＬＡＭＰ的灵敏度是ＲＴ—ＰＣＲ　的１００倍，且ＲＴ—ＰＣＲ的检出率只有ｌｉＴ—ＬＡＭＰ的８７％，并可　在１ｈ内获得结果，最短为ｌ１ｍｉｎ，检测下限达０．０１　ＰＦＵ且比　ｌｉＴ—ＰＣＲ更经济简便，更省时。　随后，ＰＯＯＮ等　同样利用上述方法对发病３　ｄ以内，以　及３　ｄ后的ＳＡＲＳ病人鼻咽分泌物标本进行检测，结果显示对　于发病三天以内的样本ＰＣＲ的检测率是１４／１５，而ＬＡＭＰ的　检出率是９／１５；对于发病三天之后的样本，两者检出率相似，　分别为３２／４４、３３／４４。与Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ比较ＬＡＭＰ的敏感　性要稍低，但能够达到ＰＣＲ的灵敏度，且ＬＡＭＰ简便快速，检　测成本较低，更利于临床应用推广。　２甲型流感病毒（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ＡＩＶ）检测ＡＩＶ在　医学上是一个重要的病毒病原体，在世界各地造成了很高的　发病率、死亡率和严重的经济负担，由于甲型流感病毒的高度　传染性，疾病会在一个密闭的空间里快速传播，故早期检测　ＡＩＶ是控制流感的关键。目前已有几种分子检测技术用于快　速检测ＡＩＶ，其中ＬＡＭＰ技术提供了一个新的分子诊断方法，　其主要的优势在于检测的简便快速且高度敏感，故有很大的　潜力用于现场检测。ＰＯＯＮ等　。。利用ＬＡＭＰ技术检测ＡＩＶ，　针对６个独立的结合位点设计两对特异性的引物来扩增目　的基因，以管家基因或外源性ＲＮＡ分子作为阳性参照，检测　了ＨＩ—Ｈ３的ＡＩＶ，与ＰＣＲ法比较符合率为１００％。　Ｉｍａｉ等…　用ＲＴ—ＬＡＭＰ检测了Ｈ５Ｎ１型高致病性禽流感　（ＨＰＡＩ）病毒，ＲＴ—ＬＡＭＰ检测灵敏度达到０．０１　ＰＦＵ／管，其敏　感性比一步法ｌｉＴ—ＰＣＲ高１００倍。　２００９年张坤等　根据Ｈ５Ｎ１禽流感病毒血凝素（ＨＡ）基　因序列，在序列保守区域设计ＬＡＭＰ引物，同时以所克隆的阳　等　利用ＬＡＭＰ对肺炎支原体进行检测，以Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　为对照，ＬＡＭＰ与ＰＣＲ在６０　ｍｉｎ内分别能检测出２×１０　拷　贝和２×１０拷贝的基因，灵敏度相当。在对７０例患者及２５　例正常人咽试纸检测中。阳性率１００％，无假阳性。由于　ＬＡＭＰ的操作简单、快速及费用低廉，在临床检验中比实时　ＰＣＲ更适用。　２００８年Ｙｏｓｈｉｎｏ　Ｍ等”　利用支原体基因组中的ＳＤＣ１基　因为靶基因设计引物用于检测肺炎支原体。这种方法能够在　６５℃恒温的条件下，１　ｈ内快速，准确地检测出Ｉ型及Ⅱ型肺　炎支原体，且与其他常见的病原微生物无交叉反应。其诊断　灵敏度达到６个拷贝，高于ＰＣＲ。在对２０４例临床样本（痰、　咽拭子）同时进行ＬＡＭＰ及ＰＣＲ检测，两者结果相仿。　四、真菌的检测　巴西副球孢子菌，是引起人体真菌病的一种热依赖的两　型真菌。Ｅｎｄｏｔ等　利用ＬＡＭＰ方法对２２株巴西副球孢子　菌的临床样本和７株分离自犰狳的样本进行检测。通过检测　该菌的特异性基因ｇｏ４３，在３　ｈ内可完成诊断工作。ＬＡＭＰ法　还可从石蜡包埋的组织样本中抽提ＤＮＡ为模板进行鉴定，在　真菌的临床检测中很有应用前景。　五、卡氏肺囊虫性肺炎的诊断　卡氏肺囊虫肺炎（ＰＣＰ）是有卡氏肺囊虫引起的一种特殊　的肺间质性肺炎，常见于艾滋病患者及肾移植术后患者。临　床上常用的用于检测ＰＣＰ的方法是支气管镜活检结合活检　物涂片和培养。Ｕｅｍｕｒａ　Ｎ等　利用ＬＡＭＰ技术对卡氏肺囊　虫肺炎进行检测，他们根据特定的１８Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列，设计　了相应的寡核苷酸引物。这种方法在３０　ｍｉｎ（恒温６１℃）内　完成检测，灵敏度达到５０拷贝／管（２１０拷贝／ｍ１），并且和其　他物种的真菌，包括念珠菌，曲霉和隐球菌无交叉反应。在　２４份ＰＣＰ患者的临床样本（痰和支气管肺泡灌洗液）中，有　２１个经实时荧光ＬＡＭＰ检测呈阳性，反应结果可视化。　ＬＡＭＰ还可用于流感嗜血杆菌　、新兴病毒　、呼吸道　合胞病毒　等多种病原体的检测。　在肺癌诊断中的应用　在传统的肿瘤诊断中，组织切片方法在恶性肿瘤的病理　诊断中起着极为重要的作用。Ｉｋｅｄａ　Ｓ等　在２００７年报道了　采用原位ＬＡＭＰ法直接检测特定的点突变，高效高特异性地　对肺癌石蜡切片进行诊断。他们将原位ＬＡＭＰ法联合特异性　突变扩增系统（ＡＲＭＳ），以Ｌ８５８Ｒ为靶基因进行检测，Ｌ８５８Ｒ　４１２　临床肺科杂志２０１１年３月　第１６卷第３期　是一种表皮生长因子受体，其能够有效地反映抗癌药物吉非　替尼的效果。他们的研究显示，在２６例来自于手术肺癌病例　的石蜡切片标本中，有１２例Ｌ８５８Ｒ发生突变，而且都位于肿　瘤细胞的细胞核内。余下的ｌ４例未检测到有Ｌ８５８Ｒ突变。　此外，有少数病例显示在非癌变区的支气管上皮细胞的核内　也有突变的发生，这表明Ｌ８５８Ｒ基因突变发生在肿瘤的早　期，这对肺癌早期的基因及病理诊断都有较大的价值。　２００９年Ｍａｅｄａ　利用ＬＡＭＰ检测方法，将癌胚抗原　（ＣＥＡ）的ｍＲＮＡ作为目的基因，用来检测非小细胞肺癌（ＮＡ—　ＣＬＣ）患者的肿瘤细胞。他们对临床上２２例原发肿瘤和２２　例非小细胞肺癌患者的１４Ｊ４个淋巴结标本进行检测分析，并　与传统的ＲＴ—ＰＣＲ技术进行了对比。结果显示，ＬＡＭＰ能够　在２５　ｍｉｎ获得结果，灵敏度为１００拷贝。此外，ＬＡＭＰ能够百　分百检测到２２例原发性肿瘤的癌胚抗原一ｍＲＮＡ。与ＲＴ—　ＰＣＲ比较的结果显示，ＬＡＭＰ的敏感度为８１％，特异性为　１００％，阳性率为１００％，阴性率为９１％。这结果表明，使用　ＬＡＭＰ检测癌胚抗原的方法在快速诊断非小细胞肺癌淋巴结　转移方面具有较大潜力。　展　望　ＬＡＭＰ是本世纪发展起来的一种分子生物学技术。虽然　还存在诸多的缺点和不足，但它在不断地改进和完善，它最主　要的优点是不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单、扩增快速　高效，适合各种条件下的快速检测，实用性强，故其应用范围　越来越广泛，在下呼吸道感染病原菌的检测中有其独特的优　势。综上所述，随着ＬＡＭＰ技术不断的完善和成熟，其在病原　菌的检测中将发挥重要作用，必将成为一种简便、快捷、实用　的检测病原菌手段应用于临床。　参考文献　［１］　Ｎｏｔｏｍｉ　Ｔ，Ｏｋａｙａｍａ　Ｈ，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒ－　ｍａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，２０００，２８（１２）：　ｅ６３．　［２］　申建维，王旭，范春明，等．多重分子信标环介导等温扩增快速　检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌［Ｊ］．中华医院感染学杂志，　２００６，１６（７）：７２９—７３３．　［３］　Ｍｉｓａｗａ　Ｙ，Ｙｏｓｈｉｄａ　Ａ，Ｓａｉｔｏ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉ—　ｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｔｏ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）ｉｎ　ｂｌｏｏｄ　ｃｕｌ—　ｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００７，１３（３）：１３４—４（１　［４］　Ｓｅｋｉ　Ｍ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｙ，Ｔｏｒｉｇｏｅ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌｙｔ　Ａ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒｅｐｔｏ。　ＣＯＣＣＵＳ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，４３（４）：１５８１—　１５８６．　［５］　Ｋａｍａｅｈｉ　Ｋ，Ｔｏｙｏｉｚｕｍｉ—ｉｊｉｓａｋａ　Ｈ，Ｔｏｄａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｌｏｏｐ．ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｕｍｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉ—　ｏｌ，２００６，４４（５）：１８９９—１９０２．　［６］　Ｍｉｓａｗａ　Ｙ，Ｙｏｓｈｉｄａ　Ａ，Ｓａｉｔｏ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉ—　ｓｏｔｈｅｍｍｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｔｏ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）ｉｎ　ｂｌｏｏｄ　ｃｕｌ—　ｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００７，１３（３）：１３４—４０．　［７］　Ｚｈｕ　ＳＲ，Ｗａｎｇ　ＺＧ，Ｚｈａｎｇ　Ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇｈｕａ　Ｌｉｕ　Ｘｉｎｇ　Ｂｉｎｇ　Ｘｕｅ　Ｚａ　Ｚｈｉ，２００９，３０（５）：４８１—５．　［８］Ｈａｎｇ　Ｔ　Ｃ，Ｍａｉ　Ｑ　Ｌ，Ｃｕｏｎｇ　Ｄ　Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｌｎ　ｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｖｅｒｅ　ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｃｏｍｎａｖｉｏｒｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｅｂｉｏｌ，２００４，４：１９５６—１９６１．　［９］Ｐｏｏｎ　ＬＬ，Ｗｏｎｇ　ＢＷ，Ｃｈａｎ　ＫＨ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｒｅａｌ・－ｔｉｍｅ　ｌｏｏｐ－－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ　ｆｏｒ　ｓｅｖｅｒｅ　ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１，２００５，４３（７）：３４５７—９．　［１Ｏ］Ｐｏｏｎ　Ｉ　Ｌ，Ｌｅｕｎｇ　Ｃ　Ｓ，Ｃｈａｎ　Ｋ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｂｙ　ｌｏｏｐ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉ—　ｃｒｏｂｉｏＩ，２００５，４３（１）：４２７—４３０．　［１１］Ｉｍａｉ　Ｍ，Ｎｉｎｏｍｉｙａ　Ａ，Ｍｉｎｅｋａｗａ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈ５－ＲＴ—　ＬＡＭＰ（１ｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ）ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｈ５　ａｖｉａｎ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００６，　６６：７９—８２．　［１２］Ｚｈａｎｇ　Ｋｕｎ，Ｈｕａｎｇ　Ｗｅｉ，Ｌｉ　Ｇａｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆＲａｐｉｄ　Ａｓｓａｙ　Ｆｏｒ　Ａｖｉａｎ　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ（Ｈ５　Ｎ１）Ｖｉｒｕｓ　ｂｙ　Ｌｏｏｐ—Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌｅｔｔｅｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２（２０）：２１７—　２２０．　［１３］Ｓａｉｔｏ　Ｒ，ＭｉｓａｗａＹ，ＭｏｒｉｙａＫ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍ　ａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｍｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ，２００５，５４（Ｐｔ　１１）：　１０３７—１０４１．　［１４］Ｙｏｓｈｉｎｏ　Ｍ，Ａｎｎａｋａ　Ｔ，Ｋｏｊｉｍａ　Ｔ，Ｉｋｅｄｏ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｅｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ｂｙ　ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｋａｎｓｅｎｓｈｏｇａｋｕ　Ｚａｓｓｈｉ，２００８，８２（３）：１６８—７６．　［１５］Ｅｎｄｏ　Ｓ，Ｋｏｍｏｒｉ　Ｔ，Ｒｉｃｃｉ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒａ３　ｏｆ　ｐａｒａｅｏｃｅｉｄ—　ｉｏｉｄｅｓ　ｂｒａｓｉｈｅｎｓｉｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　（ＬＡＭＰ）ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ＦＥＭＳ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ，２００４，２３４（１）：９３—　９７．　［１６］Ｕｅｍｕｒａ　Ｎ，Ｍａｋｉｍｕｒａ　Ｋ，Ｏｎｏｚａｋｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｌｏｐ—　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ　Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓ—　ｔｉｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ［Ｊ］．Ｊ　Ｍｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｌａ，２００８，５７（Ｐｔ　１）：５０—７．　［１７］Ｔｏｒｉｇｏｅ　Ｈ，Ｓｅｋｉ　Ｍ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎ—　ｌｆｕｅｎｚａ　ｂｙ　ｌｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｕｔ—　ｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐ６　ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，２００７，６０（１）：５５—８．　［１８］Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｅｆｅｎｃｅ　Ｒ　ｎａｄ　Ｄ　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ，ｅｔ　ａ１．Ｒａｐ—　ｉｄ　ａｎｄ　ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｏｆ　ｂｉｏ・　ｍｅｄｉｃａｌ　ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｓｏｃｉ，２００８，３３（４）：６１７—２８．　［１９］Ｓｈｉｒａｔｏ　Ｋ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ　Ｈ，Ｓａｉｊｏ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｅｙｔｉｌａ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｌｏｏｐ‘ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏ－　ｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ『Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００７，１３９（１）：７８—８４．　［２０］Ｉｋｅｄａ　Ｓ，Ｔａｋａｂｅ　Ｋ，Ｉｎａｇａｋｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａ—　ｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐａｒａｆｉｆｎ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍ－　ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐａｔｈｏｌ　Ｉｎｔ，２００７，５７（９）：５９４—９．　［２１］Ｍａｅｄａ　Ｊ，Ｉｎｏｕｅ　Ｍ，Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｒａｐｉｄ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｉｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｗｉｔｈ　ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉ－　ｉｆｃａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｕｓｉｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｍＲＮＡ［Ｊ］．Ｌｕｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ，２００９，６５（３）：３２４—７．　［收稿日期：２０１０—０６—０８］