【目的】
1 ． 掌握蔗糖酶米氏常数测定的方法及原理。 2 ． 熟悉蔗糖酶米氏常数测定的及意义。 3 ． 验证底物浓度对酶促反应速度的影响。 【原理】
当环境温度、 pH 和酶浓度等条件一定时，酶促反应的初速度（ V ）随底物浓度 [ S ] 增高而加快，直至达到一个极限，即最大反应速度（ V max ）。依据底物浓度与酶促反应初速度的这种关系，米 – 曼（ Michaelis-Menten ）氏推倒出如下公式，称为米 – 曼氏方程式（式 3-1 ）。方程式中 K m 称为米氏常数， K m 是酶的特征性常数，等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度， K m 可以近似地表示酶与底物亲合力的大小， K m 愈小，表明酶与底物的亲合力愈大。测定 K m 是研究酶促反应动力学的一种主要方法。林 – 贝（ Lineweaver-Burk ）氏将米 – 曼氏方程式等号两边取倒数得到的双倒数方程为林 – 贝氏方程式（式 3-2 ）。实验选择不同的 [S] ，测定相对应的 V ，以 1/V 对 1/[S] 作图，得到一个斜率为 K m /V max 的直线，将直线外推与横轴相交，其横轴上截距即﹣ 1/ K m （图 3-7 ），由此求出 K m 。
V = （式 3-1 ）
= ? + （式 3-2 ）
斜率： K m /V max Y 轴截距： 1/V max X 轴截距： ﹣ 1/K m
图 3-7 双倒数作图法
本实验以酵母蔗糖酶为例。应用制备的酵母蔗糖酶，在 pH5.0 的醋酸缓冲液中， 30 ℃ 条件下测定其 K m 值。其过程是：当酵母蔗糖酶在有缓冲液存在时与不同浓度的蔗糖混合，保持反应液的温度 30 ℃ ，反应 5min 后，测定还原糖生成量（还原糖的定量测定，参见第 3 篇实验 18 ）。以还原糖的生成量代表反应开始阶段的初速度 ( V ) ，按照 Lineweaver–Burk 作图法求得 K m 值。 【器材】 1 ． 中号试管 2 ． 刻度吸量管 3 ． 微量移液器 4 ． 恒温水浴箱 5 ． 冷冻离心机 6 ． 分光光度计 【试剂】
1 ． 0.2M pH5.0 醋酸缓冲液
0.2M 醋酸 30ml 与 0.2M 醋酸钠 70ml 混合 2 ． 醋酸 钠 3 ． 1 M 醋酸 4 ． 0.03M 蔗糖溶液
(1) 蔗糖的纯化：在做实验前 , 用 Bendiet 氏试剂检验蔗糖中是否有还原糖存在，如果有还原糖则需要将蔗糖纯化，纯化利用蔗糖和还原糖在乙醇中溶解度的差异 ( 表 3 -7 ) ，蔗糖在绝对量上最多，将少量的还原糖从蔗糖中洗去。
表 3-7 不同糖类在水和乙醇中的溶解度 糖 类 蔗 糖 果 糖 葡萄糖 水中的溶解度 乙醇中的溶解度 179 0.9 ＞ 200 83 6.71 1.94 纯化操作：称取干燥的蔗糖 50g ，置于 250ml 烧杯中，加入 95% 乙醇 100ml ，
不时搅动，放置片刻后用布氏漏斗吸滤，沉淀用 50ml 95% 乙醇淋洗 2-3 次。吸干沉淀，取少量用 Bendiet 氏试剂检验，应不具还原性；其余部分取出推置玻璃板上， 80 ℃ 烘箱干燥后备用。
(2) 精确称取纯化的蔗糖 10.26g ，蒸馏水溶解，定容至 1 000ml 。 5 ．蔗糖酶溶液 (1) 自溶
称取 40g 的干酵母粉放在 250ml 三角瓶中，再分别放入 1.2g 醋酸钠细粉末、 30ml 甲苯，充分搅拌使酵母液化，然后在 35 ℃ 水浴中间隔片刻震荡、保温 30 分钟，此时会观察到菌体自溶现象。 (2) 粗酶的制备
往上述自溶液中加入 100ml 水，充分搅拌，于 35 ℃ 保温过夜。第二天，将自溶液于 10,000r/min ， 4 ℃ ，离心 10min 。取出离心管后分三层，用吸液管将最上层的甲苯吸去，然后可再用一药勺挡住中间块状粘稠物，倾斜离心管倒出下层清夜。弃去粘稠物。此时会有一些悬浮物存在。再离心一次（ 10,000r/min ， 4 ℃ ，离心 10min ），滤清上清液，小心倒入 250ml 烧杯中，得到的溶液为无细胞抽提液即粗酶液，用 1M 醋酸调节 pH5.0 左右。 4 ℃ 保存备用。 (3) 蔗糖酶活性的预实验
在进行具体实验之前，通过预实验调节酶活性 ( 即酶的浓度 ) ，使本实验中最高底物浓度，在规定的实验条件下所测得的吸光度值控制在 0.8 左右，这样能达到比较满意的效果。
6 ．碱性铜试剂、 标准葡萄糖溶液 (0.025mg/ml ） 、 磷钼酸试剂
参见第 3 篇实验 18 。 【操作】
1 ． 制备酶反应液
取中号试管 5 支，编号，按照下表操作 。
试剂（ ml ） 0 管 1 管 2 管 3 管 4 管 0.03M 蔗糖液 0 1.0 1.5 2.5 5.0 去离子水 5.0 4.0 3.5 2.5 0 pH5.0 醋酸缓0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 冲液 混匀，同时将蔗糖酶溶液一起置于 30 ℃ 恒温水浴中，保温 5min ，使温度达到平衡 蔗糖酶 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 充分混匀，置于 30 ℃ 恒温水浴中，准确保温 5min 。 碱性铜试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀，终止酶促反应。酶反应液留作还原糖的测定。 2 ． 还原糖的测定
取中号试管 6 支，编号，按照下表操作。
试剂（ ml ） 0 管 1 管 2 管 3 管 4 管 5 管 酶反应液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 去离子水 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 0 碱性铜试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 葡萄糖标准0 0 0 0 0 2.0 液 混匀 , 沸水浴中加热 8min ，取出后勿摇动，流水冷却。 磷钼酸试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀，静置 3min 。 蒸馏水 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀，用分光光度计于 650 nm 波长处比色测定， 0 号管作空白调零，读取并记录各管的吸光度值。 3 ． 计算还原糖的生成量
按下式计算各管酶反应液在 5min 反应时间内生成还原糖的毫摩尔数。
还原糖的毫摩尔数 / 管＝ 4 ．作图求 K m 值
按照 双倒数作图法 ，以各管的实际蔗糖浓度，即 1/[S] 作为横坐标，各管酶反应液在 5min 反应时间内生成还原糖的毫摩尔数为反应速度 V ，以 1/V 作为
纵坐标，作图，其横轴截距为－ 【注意事项】
，进一步求得 K m 值。
1 ． 蔗糖酶的浓度与蔗糖的纯度直接影响实验结果。因此，必须纯化蔗糖和进行蔗糖酶活性的预实验。
2 ． 本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。 3 ． 当用 pH5.0 的醋酸缓冲液，在 30 ℃ 测定时，酵母蔗糖酶的 K m 值约为 28 mM 。
4 ． 还原糖与碱性铜试剂的碱性、各成分的浓度以及加热的时间等均有关系。因此操作时力求条件恒定。
5 ． 加入磷钼酸试剂后显色不稳定，应该迅速比色。 【思考题】
1 ． 为什么要测定酶的 Km 值，有什么理论意义和使用价值？ 学习是成就事业的
基石
2 ．为什么不直接用米氏方程式进行 Km 值的测定？
3 ． 还原糖生成量的计算公式中
和 含义是什么？
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