FISH实验步骤
一、实验仪器：
荧光显微镜:
高速离心机：可达12000r/min 高压灭菌锅：160℃以上杀菌 恒温箱：为杂交提供恒定温度 恒温水浴锅
照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片
二、试剂的配制：
1、0.2mol/ L (pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB) 试剂为NaH2P04·2H20和Na2HP04·12H2O。
-----0．2M的NaH2P04溶液: 31.2g NaH2P04·2H20,加蒸馏水1000mL溶解
-----0．2M的Na2HP04溶液: 71.632g Na2HP04·12H2O 加蒸馏水至1000ml溶解
----0．2M (pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB) : 19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合
高压灭菌，常温保存。
2、0.03 mol/ L磷酸盐缓冲溶液（(PBS）
试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB
------0.03MPBS溶液：22.8gNaCl ，150ml磷酸缓冲溶液(PB) ，加蒸馏水至1000ml，混匀
------0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml ------0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml 高压灭菌，常温保存。 3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作） -----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50℃，
------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60℃ -------1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。 -------1/3体积的PBS溶液，
-------用Hcl将pH调至7.2，定容， -------用孔径为0.22μm的滤膜过滤，
----4℃保存最多保存两天，或者取少量保存在-20℃。
（加热时温度不宜过高，为60℃-65℃，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。
4、1mol/L(pH8.0)Tris-HCl缓冲液的配置
---121.1g Tris(三羟基氨基甲烷), 加800mL蒸馏水溶解，加入大约42mL的浓HCl ---用1M的HCl或lM的NaOH将pH调至8.0，最后加蒸馏水至1000Ml 高压灭菌，4℃冰箱保存。 5、10%SDS
---10g SDS（十二烷基硫酸钠）于50ml灭菌水中，加水至100ml，分装后室温保存。灭菌，或用滤膜过滤
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称取SDS时需戴口罩！
6、0.5M EDTA（pH8.0）溶液的配置
---- 186.1g乙二胺四乙酸二钠 加800mL蒸馏水溶解，剧烈搅拌(最好使用磁力搅拌机) -----用NaOH调节溶液的pH至8.0，然后定容至1000mL。 7、杂交缓冲液
配置2ml杂交缓冲液于2ml离心管中，各试剂的加入顺序：
360μL 5M NaCl； 40μL 1MTris—HCl
xμL 100％甲酰胺（见下表） yμL 无菌水（见下表） 2μL 10％SDS
0.22μm孔径的滤膜过滤，4℃保存。
表1 配置不同甲酰胺杂交液中甲酰胺和无菌水的体积
甲酰胺浓度（%）
甲酰胺体积x（μL）
无菌水体积y（μL）
1598 1498 1398 1298 1198 1098 998 898 798 698 598 498
0 0 5 100 10 200 15 300 20 400 25 500 30 600 35 700 40 800 45 900 50 1000 55 1100
（甲酰胺有剧毒，操作时需戴手套，在通风处内进行，废液需要回收）
不同甲酰胺杂交液的配制
甲酰胺浓度5M NaCl溶液 1M Tris-HCl 10% SDS 甲酰胺体积x（%） （mL） (mL) (mL) （mL） 20 72 8 0.4 80 35 72 8 0.4 140 40 72 8 0.4 160 55 72 8 0.4 220 8、杂交后洗涤液的配置
配制50mL杂交洗涤液于50mL离心管中，各试剂加入的顺序如下： Z μL 5M NaCl
1mL 1MTris-HCl(pH7.6) 无菌水加至50mL 50μL 10％SDS
无菌水体积y（mL） 239.6 179.6 159.6 99.6
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500μL EDTA
表2 根据杂交缓冲液中甲酰胺浓度而定的探针清洗液液中NaCl体积数
甲酰胺浓度%
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
NaCl体积z（μL）
9000 6400 4600 3280 2250 1590 1120 800 560 400 280 200
NaCl最终浓度（mM）
900 640 460 328 225 159 112 80 56 40 28 20
不同甲酰胺对应的洗涤液的配制
甲酰胺浓度（%） 20 35 40 55 1M Tris-HCl (mL) 8 8 8 8 10% SDS (mL) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5M EDTA （mL） 4 4 4 4 5M NaCl溶液 （mL） 18 6.4 4.48 1.6 无菌水体积（mL） 369.6 381.2 383.12 386
9、4',6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI)
常备：1 mg µl
-1
需要稀释为：1 µg µl
灭菌储存在-20℃ (用铝箔覆盖管子)
DAPI可诱变致癌，所以在使用时要戴手套并且收集废液，包括早使用移液管时。
为了避免使用时对溶液造成污染，所有的溶液应取出置于50ml管中，够每天使用的量。
-1
三、实验步骤：
1、玻片的预处理：
（1）玻片预处理
1）玻片清洗：
载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，在实验室可用超声清洗代替刷洗（4~5次 每次10 min），然后用清水浸泡过夜； 2）硅化处理：
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第二天换用1%的盐酸浸泡24小时，然后用蒸馏水清洗干净后放入高压灭菌锅灭菌，60°C烘干。盖玻片用锡纸包好4°C保存备用。（盖玻片干净即可，不用处理）
(2)黏附剂涂片制备
载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液（现配现用）中约1min，取出用高压灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥（也可放入烘箱里25°C烘干），然后置4℃保存备用
2、荧光探针的选择和标记（见fish探针的选择表） 3、样品的制备与固定
（1）用已灭菌的聚乙烯取样管取反应器内泥水混合液1mL，加适量灭菌蒸馏水振荡混匀，并用超声波处理使细菌分散。取处理后的悬浊液约 0.5ml进行后续处理。 （2）将悬浊液混合均匀后，按1:1加入4%多聚甲醛，于4℃固定24小时，
（3）然后置于12000r/min离心5min去除固定剂，将固定样本加入1ml 0.0lmol/L PBS以10000r/min的速度离心漂洗两次，弃去上清液。 （4）采用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于−20℃保存备用
4、样品的预处理
（1）用微型振荡器将样品混合均匀，取10μl样品在载玻片上涂抹20mm×20mm大小（不要太大），37℃的烘箱热固定2h，最高温度不超过60℃
（2）风干后于50％、80％、95％的乙醇中各脱水3min，自然风干。
（脱水：准备三个瓷盘，然后将载玻片取出依次放入瓷盘中，用50%乙醇淹没载玻片，脱水3min，取出放入第二、三个瓷盘，然后用80%乙醇脱水，96%乙醇脱水。脱水后的80%、96%乙醇回收。）
脱水后的玻片可以在室温下保存几个月，可在-20℃的条件下保存几个月 5、原位杂交
探针浓度为50ng/μL，
在密闭的杂交盒内铺满吸水纸（经高压灭菌烘干），用杂交液湿润，使杂交环境保持一定的湿度。用移液枪分别取24μL的杂交液和1μL探针滴入带有样品的载玻片上（均匀覆盖涂片面积），（加盖硅化盖玻片，不用）放入杂交盒内进行杂交反应。杂交温度与杂交时间如下。
所有有关探针的操作在处理时都应避光处理！ 探针种类 EUB MIX AOB MIX NOB MIX GAO MIX HGC69a PAO651 温度（℃） 46 46 46 46 46 46 时间（h） 5 3 5 2.5 2.5 2.5 甲酰胺浓度% 20 55 40 30 30 30 备注 同步染色法 重复染色法 重复染色法 同步染色法 同步染色法 同步染色法
6、杂交后洗涤
从恒温箱中取出玻片之前将盛有清洗液的容器放入到48℃的水浴中预热20分钟。杂交完成后取出玻片，立即放入到预热好的容器中。注意不能让玻片干燥，不然将很难洗去非特异性结合的信号，增加背景染色。清洗液的量应当淹没玻片，清洗15～20分钟后取出，用清水洗去剩余的清洗液，然后室温下晾干。 7、DAPI染色
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每个玻片用10μL DAPI（用甲醇稀释至1μg/μL）滴加到载玻片样品上，在冰上染色10min，用水冲洗多次，室温下自然晾干，镜检前加盖盖玻片。 8、荧光显微镜观察
经过以上处理的样品，用荧光显微镜进行观察。 探针 EUB338 NIT3 cNIT3 GAOQ989 HGC69a PAO651
a
目标菌群 探针序列 GCTGCCTCCCGTAGGAGT CCTGTGCTCCATGCTCCG CCTGTGCTCCAGGCTCCG TTCCCCGGATGTCAAGGC TATAGTTACCACCGCCGT CCCTCTGCCAAACTCCAG CGGGAGGCAGCAGT
甲酰胺浓度
20% 55% 40% 35% 25% 35% 35%
修饰 HEX HEX FITC Cy5 FITC Cy3 FAM
TMTM
Domain Bacteria
NSO190 Ammonia-oxidizing bacteria CGATCCCCTGCTTTTCTCC
b
Nitrite-oxidizing bacteria
Competibacter Actinobacteria Accumulibacter Denitrifier
b
注：探针浓度均为50ng/μL；cNIT3为硝酸菌探针NIT3的竞争探针。
Abbreviation FITC（绿色） DAPI（蓝色） 365 nm CY3（橙色/红色） CY5（红外线检测） HEX 554 nm 650 nm 418 nm 570 nm 667 nm 15(Zeiss) 26(Zeiss) maximum absorption Maximum emission 492nm 528nm Filter set 10(Zeiss) 02(Zeiss)
探针的选用
选用EUB MIX(EUB338、EUB338Ⅱ、EUB338Ⅲ)来检测活性污泥中的全部的细菌。 选用PAOMIX来检测活性污泥中的聚磷菌，
选用AOB MIX NOBMIX来检测活性污泥中的硝化菌。 选用GAOMIX探针来检测活性污泥中的聚糖菌，
选用HGC69a探针来检测反硝化聚磷菌的优势菌种Actinobacteria，
用PAO651来检测优势菌种Rhodocyclus，杂交后用4¢ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydro-chloride (DAPI) (1:1,000稀释)和PHB进行 复染样品。
试剂与材料：
NaH2P04·2H20，Na2HP04·12H2O； NaCl；
多聚甲醛PFA；
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150g三羟基氨基甲烷 (Tris)，浓HCl，NaOH； 十二烷基硫酸钠（SDS）； 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）； 100％甲酰胺； DAPI；
载玻片，盖玻片，吸水纸，瓷盘（带盖）；
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