霉菌的培养与形态学观察
实验一 真菌培养基的配制与灭菌
实验目的：（1）了解培养基的配置原理和方法，掌握分离培养微生物的有关准备工作。
（2）掌握高压灭菌方法及原理
实验原理：（1）培养基的制备原理 ：
1. 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
2. 从营养角度分析：
♪营养：碳源、氮源、能源、生长素、水分和无机盐等； ♪适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力； ♪一定的氧化还原电位； ♪合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固，不容易被微生物污染。但多次反复融化，其凝固性降低。
（2）湿热灭菌原理－高压蒸汽灭菌
在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不
断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
实验材料与方法 7 每组 全室
配制培养基所需器材
实验设备：高压蒸汽灭菌器。
实验器材：500ml三角烧瓶、蓝盖瓶、5ml刻度吸管、培养基、天平、砝码、
镊子、载玻片、盖玻片、滴管、胶头、显微镜镜检用物品（不用准备，实验室已提前准备好） 小室培养法器材49cm平皿→内垫滤纸1层→放载玻片2块、盖玻片2片。套 （8付左右用报纸包好，高压） 高氏I号琼脂 （平板） 5.6 150 共1瓶，配好后包扎瓶口，直接高压，高压后再制平板
称量纸、药勺、500ml、100ml量筒、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、铁丝筐、平皿、剪刀等。
培养基等集中放讲台前高压桶内，送到洗刷室统一高压 灭菌条件及注意事项
高压灭菌条件：121.3℃，15min 。含糖培养基113 ℃，15min 。
倒平板 电炉加热灭菌好的培养基 打开平皿包装 倒平板（10块） 注意事项：空气环境无菌（应在酒精灯火焰周围无菌区）。
a.在酒精灯火焰处，倾斜打开瓶口。 b.瓶口要过火焰。 c.左手掀开平皿小口。
d.倾注满皿底再多一点，约10ml（7cm直径平皿）。
e.推放一边要轻缓，不能晃起琼脂挂壁，易在培养过程中污染杂菌。
f.完全凝固再翻转平板放塑料筐内，4℃备用。
分析与讨论（1）如何证明培养基灭菌是否彻底?
把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管(瓶)，标上记号，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；如果某一位置的培养基出现了杂菌菌落，可能是摆放的太紧，导致蒸汽不畅，或锅的结构不合理等原因所致，应根据上述情况进行改进；如果大部分或全部菌种瓶都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。经过几次检验都证明能彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。
经过几次检验都证明能彻底灭菌后,以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。
（2）为什么说消毒与灭菌是微生物学和临床医学必不可少的基本知识? 由于病原生物广泛存在于自然界，可通过不同途径和媒介进入人体，引起感染或造成疾病流行。因此，杀灭或清除存在于体外传播媒介上的病原生物，对于切断传播途径、预防和控制其感染具有重要意义。自古以来，人们就利用煮沸、火烧、日晒等方法杀灭或去除微生物，达到预防疾病的目的。实际上，除了在临床医疗实践中需要防止微生物的污染或感染外，在微生物学实验室、食物保存、饮水净化、药品与生物制品生产等过程中都需要避免微生物的污染。
实验二 霉菌的接种与培养
实验目的与要求：掌握霉菌与酵母菌的接种与培养方法。
实验原理： 接种是微生物实验及科学研究中一项基本操作技术。根据实验目的和要求，
选择合适的接种工具与接种方法，接种工具有接种环、接种针、接种铲、接种钩、吸管、滴管、棉签等。常用接种方法有：斜面接种，液体接种，穿刺接种，平板接种和固体接种。 接种的关键是无菌操作。
无菌操作的原则：在酒精灯火焰旁进行 ，所有器皿均须严格消毒，培养基
应事先做无菌试验，接种工具使用前后须经火焰烧灼灭菌，棉塞不能乱放，始终夹在手指中。
在培养四大类微生物时应注意选择适宜的培养条件。多数细菌为专性需氧菌与兼性需氧菌，少数为厌氧菌。多数食品腐败菌和工业用菌种，以及人和动物病原菌的最适生长温度为37℃，并且在近中性（PH6.5～7.5）条件下生长良好。多数放线菌为好氧菌，少数为厌氧菌，最适生长温度为28～30℃，多数适宜在偏碱性环境中生长（PH7.5～8.5）。
实验材料与方法
（1）实验材料：实验设备：温箱。
实验器材：毛霉、曲霉、青霉、根霉、啤酒酵母、白假丝酵母、新生隐球酵母菌、细黄链霉菌、PDA平板、高盐察氏平板、高氏合成I号平板、塑料筐、20%甘油水溶液、镊子、接种铲、无菌盖玻片、无菌滤纸、无菌载玻片、石棉网、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、铁丝筐等。
（2）实验方法：平板接种：毛霉→PDA平板（点植法）
啤酒酵母→PDA平板（五区分离划线法） 青霉、曲霉→PDA平板（连续划线法）
小室载玻片培养法：1、取灭菌后小室平皿。
2、取无菌PDA琼脂薄层平板，用镊子夹住
盖玻片切割成0.5 ～1.0cm2的琼脂块，并将其移至培养小室中的载玻片上，制作过程注意无菌。
3、用接种环取少量霉菌的孢子接种于培养
基四周，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上，并轻压使之与载玻片间留有极小缝隙，但不能紧贴载玻片，否则不透气。注意：接种量宜少，尽可能将孢子分散接种在琼脂块边缘，否则菌丝过于稠密，影响观察。先在平皿的滤纸上加3～5ml灭菌的20%甘油（用于保持湿度），盖上皿盖，标记，置28～30 ℃培养3～5d
粮食产品的平板接种：
1. 取粮食样品20g,放入无菌烧杯，加无菌水洗涤，
反复10次，弃去水后，将粮粒倒于平皿内备用 2. 镊子取粮食种入PDA琼脂内，每皿可接种5-10粒。
放线菌的接种：取细黄链霉菌划线法接种，在接种的划线处，无
菌操作斜插入盖玻片数张。
注意事项：
1.空气环境无菌（应在酒精灯火焰周围无菌区）。 2.在酒精灯火焰处，倾斜打开瓶口。
3.接种环使用前，直接在酒精灯上烧灼灭菌，把环和
金属丝烧红即可。
4.接种环使用后，先在火焰周围把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。 5.金属杆快速通过火焰2－3次，杀灭表面微生物
分析与讨论1、粮食中产毒真菌的种类及产生毒素？
青霉、毛霉、曲霉、根霉、酵母、白念、细黄链霉菌（放线菌） 青霉素、丝生毛霉素、黄曲霉素、根霉素、白念菌素。细黄链菌素
2、常用霉菌培养基有哪些？
马铃薯蔗糖培养基
豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）琼脂培养基 察氏培养基
3、霉菌的接种方法有何不同？为什么？
（1）连续划线法（青霉、曲霉）
青霉与曲霉为局限性生长的霉菌。应采用连续划线接种法接种。 （2）点植法（根霉、毛霉）
根霉与毛霉生长区域比较大，应采用点植法。 （3）小室载玻片培养法（青霉、毛霉、根霉、曲霉）
实验三 霉菌的制片与形态观察
实验目的： 学习并掌握观察霉菌形态的基本方法；
了解四类常见霉菌的基本形态特征。 了解放线菌的基本形态特征。
实验原理：霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约为3-10μm）,常是细
菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液，用此染液做霉菌制片的特点是细胞不变形，具有杀菌、防腐作用，不易干燥，能保持较长时间，能防止孢子四处飞散，棉兰具有一定的染色作用，染液的蓝色能增大反差。
实验材料：
（一）菌种：在马铃薯琼脂平板上培养3—4天的青霉(Penicillium sp.)、曲霉
(Aspergillus sp.)、毛霉（Mucor sp.）、根霉；
（二）器材及用具：镊子、载玻片、盖玻片、显微镜。
实验方法：
（一）直接制片观察
于洁净载玻片上，用镊子取霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝，然后
小心地盖上盖玻片。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜 （二）小室培养观察
将载玻片直接放低倍镜下观察，再换高倍镜观察。
观察原则：
毛霉：用低倍镜观察孢子囊梗、囊轴等。用高倍镜观察孢子囊孢子的形
状、大小。
根霉：菌丝、孢子同毛霉，注意观察有无假根。
曲霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子着生位置，辨认分生孢
子梗、顶囊、小梗和分生孢子。
青霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子梗、副枝、小梗和分生
孢子的形状等。 实验结果： 名称 （属） 菌丝 分生孢子 孢子囊 菌落 毛霉 青霉 根霉 曲霉 粮食真菌 放线菌 有 有横隔 有匍匐枝 无 有 黄色 绿色,蓝色或黄色 白色 ----- 各异 球形、椭圆 少数 形 无 褐色 无 有 产生大量分 球形 生孢子梗 基内菌丝、气 有 生菌丝、孢子丝
分析与讨论：
青霉和曲霉的形态有哪些异同？
青霉常分布在霉腐变质的水果、蔬菜、粮食和皮革等物体上，菌体直立菌丝的顶端长有扫帚状的结构，结构的每一个分枝上，生有成串的孢子，成熟的孢子呈青绿色，进行孢子生殖。
曲霉广泛分布在谷物、空气和土壤中，曲霉直立菌丝的顶端膨大成球状，球状结构的表面放射状地生有成串的孢子，孢子随曲霉种类的不同而呈黄色、橙色或黑色。
从皮肤取材查真菌如何检查？
皮肤真菌镜检是通过直接镜检的方法，找到菌丝和孢子，以供初步诊断。而培养的方法，则根据菌落的特征和镜下形态，结构以确定菌种。 正常值：
阴性，即无致病菌生长。 临床意义：
当真菌侵犯人体后，医生将按它们对人体的侵犯部位来划分，因此真菌可分为浅部真菌和深部真菌两大类。浅部真菌主要会引起皮肤粘膜等 浅表感染;深部真菌则可侵犯全身器官和组织，如严重败
血症、心内膜炎、脑膜炎等致死性疾患。引起这些疾病的真菌有：白色念珠菌、新型隐球菌、热带念珠菌等。
异常结果： 真菌检查方法常采用直接检查(包括不染色直接涂片
镜检、负染色法、革兰氏染色法、荧光染色法)和真菌培养。异常结果如下：
1.涂片找到真菌菌丝和孢子。
2.检出新型隐球菌，可见于亚急性或慢性脑膜炎或肺部感染，也可
侵犯皮肤、皮下组织、肌肉、淋巴结及肠道等处，由肺经血行播散时可侵犯所有脏器组织。不管发生哪类隐球菌感染，最后中枢神经系统终将受染。 3.检出真菌(包括深部真菌和浅部真菌)。
深部真菌指侵犯表皮以外的组织和器官的病原真菌、条件致病真
菌，包括隐球菌属、念珠菌、申克孢子丝菌、暗色孢科真菌、曲霉菌、毛霉菌。
浅部真菌指寄生或腐生在表皮、毛发、甲板等部位的真菌所引起 的浅部真菌病，称为癣，包括毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属。 需要检查的人群： 有疑似真菌感染症状的患者
黄曲霉毒素如何检查？
检测黄曲霉M1的方法一般就是免疫亲和层析净化高效液相色谱法和酶联免疫吸附法（试剂盒）这两种方法。前一种方法主要使用到高效液相，后一种使用的是酶标仪。由于高效液相色谱法费用高试用繁琐，所以现在市场上检测黄曲霉M1主要还是用的后一种方法
食品中大肠杆菌的测定
实验目的：
（1）学习及掌握食品中大肠杆菌的测定方法
（2）了解大肠杆菌在食品卫生检验中的意义
实验意义：
（1）粪便污染的指标细菌。
（2）大肠杆菌是肠道传染病的主要原因
实验原理：
大肠菌群（coliforms）：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性
厌氧革兰阴性无芽胞杆菌。利用其发酵乳糖，产酸产气的性质，我们可以使用乳糖胆盐发酵培养液予以分离。
制作三种不同梯度的培养液管和培养皿，分别为10-1,10-2,10-3稀释原液进行科学的计数统计，通过查表MPN分析得出结论。
粪大肠杆菌还具有耐热的性质，故其鉴定培养基置于恒温水浴中再检测其阳性与
否。
实验基本过程：
提取待测样品，分别制作成三个不同稀释倍数样品培养皿（一个对照培养皿），三支不同梯度稀释的样品试管液。在培养后观察各组实验效果，分析得出结论。再进一步进行各种验证，以确定结论。
实验数据记录与实验讨论：
我们是第六小组，负责测试牛奶中的大肠杆菌数值。 在第一轮的三组稀释培养试管中，数值如下：
不同稀释倍数 10 100 1000 对照组 培养所记菌落数 5 0 0 7 根据上数据查检索表
可得每ml菌落总数约为 5*10-1=50cfu*ml-1
❖ 一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系 ❖ 水的类别 ❖ 最清洁水 ❖ 清洁水 ❖ 不太清洁水 ❖ 不清洁水 ❖ 极不清洁水 ❖ 菌落总数(cfu/ml) ❖ 10～100 ❖ 100～1000 ❖ 1000～10000 ❖ 10000～100000 ❖ ＞100000
50 cfu/ml属于 10～100 是最洁净水
结果显示对照组的菌落总数甚至比样品1还多。推测可能原因是在制作对照组培养皿是被污染，操作不当等各种原因导致。
（我国规定生活饮用水卫生标准为1ml水中的菌落总数不得超过100个（≤100cfu/ml））
根据乳糖胆盐发酵培养实验可得
实验稀释标号 10-1 10-2 10-3 实验结果 — — —
结果显示三支试管 均为阴性。无任何产气，产酸现象。故认为样品中大肠杆菌结果为阴性。
MPN 100ml（g）300 符合第一项标准
菌落总数小于1*10 cfu/ml
由于实验结果测得样品中大肠杆菌阴性，故后续实验我们使用第七组的阳性样品继续检测。 由此验证样品牛奶（伊利牌）完全合格。
后续试验使用第七组屠宰场井水。
首先抽样阳性试验样本细菌至伊红美蓝培养基划线培养。由于大肠杆菌产酸与伊红美蓝发生化学反映呈现出金属光泽的蓝黑色。在取菌落至乳糖胆盐培养皿中，继续培养验证。另一方面去样制作革兰氏染色实验。在显微镜下观察。大肠杆菌为革兰氏阴性细菌，理应看到染色为红色。我试验时不知何故看到染成紫色。不过染色时间与真正实验有所出入，没有严格按照规定时间控制，可能造成效果的偏差吧。
观察效果图
最后再根据实验结果进一步验证试验。
乳糖胆盐培养液中，发酵倒管 有气泡产生则为阳性；无气泡则为阴性 试管液为蓝色则为阴性；黄色则为阳性，以此判断。 亦进一步将样品加入EC肉汤培养于44度恒温水浴锅中， 若实验结果为阳性，则为粪大肠杆菌阳性 结果若为阴性，则为粪大肠杆菌阴性。
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容