牦牛、牧民源大肠杆菌分离鉴定、耐药基因检测、PFGE分析及耐药性传递的研究

耐药性传递的研究

牦牛是藏区牧民的最重要生产和生活资料,牦牛的大肠杆菌病在牧区普遍存在。在其他地区随着抗生素的不断使用,大肠杆菌耐药性问题已越来越严重。

但是在色达藏区,海拔在3500米以上,由于气候寒冷,路途遥远,条件简陋,采样极为不便,对牦牛、牧民的大肠杆菌耐药性及相关性的研究还未见报道。本论文针对藏区牦牛、牧民源大肠杆菌进行分离鉴定、耐药性的传播,对磺胺药、氟苯尼考耐药基因等问题,开展了系列研究工作,取得以下结果：1、藏区牦牛、牧民源大肠杆菌分离、血清学鉴定及16S rRNA分析从四川甘孜色达藏区9个不同乡镇的牧场,采集了具有牦牛210份粪便样品及同牧场的90份鼻腔拭子,进行采集、接种、保存条件摸索,对分离大肠杆菌进行生化学、血清学和致病性鉴定,抽取40株分离菌株作16sRNA分析。

结果表明,采用80%甘油加30%脱脂牦牛奶作保护剂,可将接种成功率从10%提高到70%,菌种能保存到一周以上。共分离出株114牦牛源大肠杆菌和70株牧民源大肠杆菌。

有98株牦牛源大肠杆菌菌的血清型被鉴定出来,分属24种血清型,其中有9种优势血清型占了60%的比例。有58株牧民源大肠杆菌的血清型被鉴定出来,分属12种血清型,其中有6种优势血清型占了62.8%的比例。

鉴定出了22株牦牛源为致病性大肠杆菌,有20株的血清型鉴定出来,其中O78、O26、O111所占的比例最高,分别为18.2%、13.6%、13.6%,为致病性大肠杆菌的优势血清型。16S rRNA分析,这些细菌都与登录的大肠杆菌同源性为98-99%。

进化树结果表明,四川甘孜色达藏区牧民源的与牧民源大肠杆菌聚为一类,

牦牛源与牦牛源大肠杆菌也聚为一类。该研究首次建立了一套在高海拔、高寒条件下采样、分离、保存细菌的简单实用方法,该方法的建立为在当地开展细菌的科研工作铺下了的技术基石。

鉴定了四川甘孜色达藏区牦牛致病性大肠杆菌的优势血清型。首次用16S rRNA鉴定了四川甘孜色达藏区牦牛、牧民的大肠杆菌,研究结果为进一步研究藏区牦牛源大肠杆菌提供了基础材料。

2、四川甘孜色达藏区牦牛、牧民源大肠杆菌对15种常用抗生素的MIC测定及比较采用药物平板稀释法对四川甘孜色达藏区114株牦牛源和70株牧民源大肠杆菌进行15种抗菌药的MIC值测定,然后对结果进行的比较分析。结果表明,四川甘孜色达藏区牦牛源大肠杆菌对磺胺甲基异嗯唑、磺胺嘧啶、氟苯尼考的耐药性最高,分别为44%、40.4%、11.4%；对其他抗生素的耐药性低：分别为阿莫西林8.78%、氨苄西林6.14%、庆大霉素3.5%、链霉素1.75%；对新霉素、多西环素、土霉素、诺氟沙星、环丙沙星、萘啶酸、壮观霉素、头孢噻呋都敏感。

四川甘孜色达藏区牧民源大肠杆菌对磺胺嘧啶和SMZ的耐药性最高,分别为57.1%和51.4%。而对其他抗生素的耐药性相对较低,从高到低分别氨苄西林22.9%、阿莫西林25.7%、链霉素20%、壮观霉素14.3%、庆大霉素11.4%、土霉素11.4%、头孢噻夫11.4%、萘啶酸11.4%、诺氟沙星8.57%、多西环素5.71%、氟苯尼考4.3%、环丙沙星2.86%、新霉素0%。

比较牦牛源与牧民源大肠杆菌的耐药性发现：a、牧民源大肠杆菌的耐药性比牦牛源的比例高,种类多。b、两种来源的大肠杆菌都对磺胺药的耐药性在所有抗菌药中最高。

c、在牧民不使用氟苯尼考的情况下,却检测出3株牧民源大肠杆菌对该药产

生抗性。本研究首次对四川甘孜色达藏区的牧民、牦牛进行耐药性平行检测和比较分析数据,未见在同一环境中采样,对比分析牦牛与牧民源大肠杆菌耐药性的研究报道。

该研究为治疗当地的大肠杆菌病提供了科学指导,为耐药性研究提供了更全面的资料。3、四川甘孜色达藏区牦牛、牧民源大肠杆菌对磺胺类和氟苯尼考耐药基因的PCR检测为检测四川甘孜色达藏区大肠杆菌主要耐药表型的耐药基因,在单重PCR方法的基础上,建立了检测磺胺耐药基因Sul1.Sul2和Sul3的三重PCR方法。

利用此方法分别对50株牦牛源大肠杆菌的耐磺胺药物的基因进行检测,结果发现,在耐磺胺的50株菌中,基因阳性率为94%。其中携带基因型Sul1,Sul2,Sul1+Sul2的比例分别为36%,52%,6%。

对40株牧民源大肠杆菌中,基因阳性率为92.5%。其中携带基因型Sul1,Sul2,Sul3,Sul1+Sul2,Sul1+Sul3的比例分别为42.5%,27.5%,7.5%,12.5%,2.5%。

比较牦牛源与牧民源的磺胺耐药基因发现,牧民源大肠杆菌的磺胺药耐药基因型比牦牛的多两种,基因种类多Su13。本研究在国内首次对牧区人和动物磺胺耐药基因分布比较进行比较,为研究人与动物的耐药基因库提供资料。

4、用脉冲场凝胶电泳PFGE对牦牛、牧民相同耐药基因型的菌株的分析研究为了研究同一个牧场里,牦牛和牧民之间是否存在耐药菌株的相互传播。本实验挑选26株耐药大肠杆菌,分为两组,每组13株菌,携带相同的耐药基因(Sull或flor),分离于两个牧场,来源不同宿主。

采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型和QantityOne软件进行菌株聚类

分析。结果发现,在第一组携带磺胺耐药基因sull的13株大肠杆菌可分成12个PFGE谱型,其中含有一个克隆系,菌株牧民源C2与C4之间的相似系数达到0.9。

在第二组,携带有氟苯尼考耐药基因(flor)13株菌可分成8个PFGE谱型,含有三个克隆系。其中一个克隆系里牧民源菌株B3与牦牛源菌株B12、B13具有0.88和0.93的相似系数。

这些数据表明了在同一个牧场内,牧民与牧民、牦牛与牧民、牦牛与牦牛之间都存在着相同PFGE分子型的相同耐药谱菌株,提供了耐药菌株水平传播的线索。与国内外的其它类似的研究比较,本实验在所选的对象上具有独特性,首次采用PFGE研究在藏区特殊生产和生活模式下的人和牛的耐药性关系,为保障牦牛产品安全和人类健康提供科学依据。

5、携带磺胺耐药基因和氟苯尼考耐药基因大肠杆菌的转化试验和接合性试验挑选有特别耐药性的19株菌进行分组。A组：牦牛源大肠杆菌株7株,携带有flor基因,对磺胺甲基异嗯唑敏感。

B组：牧民源大肠杆菌12株,携带有Sull或Sul2基因,对氟苯尼考敏感。对所有细菌进行质粒提取,电泳分析质粒图谱；采用Ca2+转化法把各菌株的质粒转化到受体菌E.coli JM109中,然后挑选转化子,测MIC值,提取质粒,用PCR检测耐药基因；将所有菌与受体菌E.coli C00进行接合试验,并测定了产生接合子的时间。

结果表明,每株菌都检测到多条大小不等的质粒DNA条带,质粒获得率为100%,质粒分子量为0.4×103～90.0×103bp。在A组7类质粒中,有4类质粒转化成功；在B组12类质粒中有6类质粒成功转化；总的转化率为52.6%。

在接合试验中,发现质粒转化不成功的菌株都没有与受体菌接合成功,在含

耐氟苯尼考耐药基因质粒的4株牦牛源大肠杆菌中有2株接合成功；在含耐磺胺药基因质粒的6株牧民源大肠杆菌中有5株接合成功：发生接合转移的时间为3h～6h；总的接合率为36.8%。本实验在实验室证明了耐药性能通过质粒的转化和细菌的接合传播,揭示了耐药性通过质粒传播的比例与速度,为控制耐药性的传播提供了科学资料。

同时,鉴定到了2株含有携带flor基因质粒的牦牛源供体菌A12、A17,携带Sul1、Sul2基因质粒的5株牦牛源供体菌B1、B7、H1、D3, H5,为进一步开展天然大肠杆菌耐药质粒传递的研究提供了素材。本研究在四川甘孜色达四川甘孜色达藏区对分离自牦牛、牧民的大肠杆菌进行了致病性鉴定、血清学鉴定、MIC值检测,检测了主要耐药品种的耐药基因,用PFGE分析了同牧场中牦牛与牧民之间耐药菌株的关系,检测了耐药质粒对耐药性的传递特性,为指导当地藏民科学用药,有效防治大肠杆菌等细菌性疾病,保障牦牛产品安全,防制耐药性泛滥,保护人类健康提供了科学依据。