利用微卫星标记分析长白山中华蜜蜂遗传多样性

２０　试验研究报告　中国蜂业　ＡＰＩＣＵＬＴＵＲＥ　ＯＦ　ＣＨＩＮＡ　２０１５年７月　第６６卷　利用微卫星标记分析长白山中华蜜蜂遗传多样性　高夫超　（黑龙江省农科院牡丹江分院，１５７０４１）　摘要：利用２１对微卫星标记对吉林长白山中华蜜蜂群体遗传多样性进行分析，共检测到３９个等位基因，等　位基因数目从１～５不等。平均等位基因数为１．８５７１；所有位点的平均期望杂合度（Ｈｅ）和平均多态信息含量（ｐＬｃ）　值分别为０．２０６８和０．１６７９。表明长白山中华蜜蜂群体遗传多样性较低。　关键词：中华蜜蜂；微卫星；遗传多样性　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｐｉｓ　ｃｅｒａｎａ　ｃｅｒａｎａ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｈａｎｇｂａｉ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　ｂｙ　Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　Ｍａｋｅｒｓ　Ｇａｏ　Ｆｕｃｈａｏ　（Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ　Ｂｒａｎｃｈ　ｏｆ　Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５７０４１　Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｐｉｓ　ｃｅｒｏ２￣ａ　ｃｅｒａｎａ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｈａｎｇｂａｉ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　ｉｎ　Ｊｉｌｉｎ　ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ｗａｓ　ｅｖａｌ—　ｕａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　２１　ｍｉｃｒｏｓｔａｅｌｌｉｔｅ　ｍａｋｅｒｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ，３９　ａｌｌｅｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｆ０ｕｎｄ　ｉｎ　２１　ｍｉｅｒｏｓｔａｅｌｌｉｔｅ　ｌｏｃｉ，ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ａｌｌｅｌｅｓ　ｐｅｒ　ｌｏｃｕｓ　ｒａｎｇｅｄ　ｒｏｍ　１ｆ　ｔｏ　５，ｍｅａｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ａｌｌｅｌｅｓ　ｗａｓ　１．８５７１，ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｅｘｐｅｃｔｅｄ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ　ａｎｄ　ＰＩＣ　ｏｆ　ａｌｌ　ｌｏｃｉ　ｗｅｒｅ　０．２０６８　ａｎｄ　０．１６７９．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　Ａｐｉｓ　ｃｅｒａｎａ　ｃｅｒａｎａ　ｐｏｐｕｌａ—　ｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｈａｎｇｂａｉ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　ｈａｄ　ｌｏｗ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．　Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ａｐｉｓ　ｃｅｒａｎａ　ｃｅｒａｎａ；ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｍａｒｋｅｒｓ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　中华蜜蜂（Ａｐ／ｓ　ｃｅｒａｎａ　ｃｅｒａｎａ）是我国特有的蜜蜂遗　传资源，公认它有５个生态型【ｌ１。长白山中蜂属于其中　的东北生态型，主要分布在长白山区东部的高海拔区　和中、西部低海拔浅山地带，历经数千年的繁盛时期，　长白山中蜂有其独特的形态学、生物学和生产性状，一　微卫星标记作为优先推荐的遗传资源分析工具１６１。目前　微卫星标记分析已经成为群体遗传结构、遗传多样性　研究中最普遍最有效的手段之一，但关于中蜂（Ａｐｉｓ　ｃｅｒａｎａ　ｃｅｒａｎａ）微卫星ＤＮＡ遗传多样性的研究还相对较　少。本试验采用２１对微卫星引物从ＤＮＡ水平上分析　长白山中蜂群体遗传多样性，评估其群体遗传结构，以　期能够为正确评价和合理保护利用其遗传资源提供科　学的理论依据。　１材料与方法　１．１试验材料　直以来都是本地蜂业生产中的佼佼者，深受广大养蜂　爱好者的青睐［２１。　遗传多样性（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｖ）一般指品种内个体在　ＤＮＡ水平上的千差万别。通过对遗传多样性的研究，可　了解品种的遗传结构、生活背景，分析其进化的历史和　潜力，以及探讨品种濒危的原因和现状，提出合理的保　样本采集于吉林长白山地区，共３０群。ＤＮＡ提取　种措施［３１。微卫星标记作为一种有效的评价动物遗传资　源的分子标记，具有分布广泛、多态信息含量高、呈共　显性遗传及检测快速方便等优点，已经被成功地用于　畜禽遗传变异及品种间遗传关系的研究，同时在构建　遗传连锁图谱、评价遗传多样性和群体进化、绘制系统　发生树、血缘关系鉴定、核基因组研究以及基因定位等　研究中得到广泛的应用　。联合国粮农组织（ＦＡ０）将　基金资助：国家蜂产业技术体系专项资金（ＣＡＲＳ一４５一ＳＹＺ　５）　参照吉挺川所建立的方法。提取的ＤＮＡ用紫外分光光　度计测定其浓度和纯度，一２Ｏ。ｃ保存备用。　１．２试验方法　１．２．１微卫星标记的选择　２１对微卫星引物信息列于表１，引物序列参考　ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）等网站和Ｍｉｃｈｅｌ　Ｓｏｌｉｇｎａｃ等嗍报导。　作者简介：高夫超，男（１９６５一），副研究员，主要从事蜂学方面的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｄｊｇｆｃ＠１２６．ｔｏｍ　２０１５年７月第６６卷　中国蜂业　ＡＰＩＣＵＬＴＵＲＥ　ＯＦ　ＣＨＩＮＡ　试验研究报告　２１　１．２．２　ＰＣＲ反应条件　２结果与分析　２．１长白山中蜂２１个微卫星扩增结果　ＰＣＲ反应体系共２０　Ｌ：５０　ｎｇ／ｐ＆ＤＮＡ模板１　Ｌ，１０ｘｂｕｆｆｅｒ　２．０　ＩｘＬ，２５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣ１２　１．６－２．２　Ｌ（因　基因座而异），１０　ｍｍｏｌ／ＩｘＬ的ｄＮＴＰ　０．５　ｔｚＬ，１０　ｐｍｏｌ／ｌ￣Ｌ　用２１对微卫星引物对长白山中蜂群体基因组　ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ扩增，扩增结果见表２。结果显示共　检测到１４４个等位基因。单个位点的等位基因数从２　（Ａ０２４ｄ、Ａ０３５）到１２（ＡＣ０１　１）不等，平均为５．７６。Ａｔ００３　位点则拥有最高的期望杂合度和Ｐ，ｃ值，为Ｏ．８８８１和　０．８６０４。　的引物各１　Ｌ，５　Ｕ／ＩｘＬ　纯水补足２０　Ｌ。　ＤＮＡ聚合酶０．２　，用超　扩增程序为９５℃预变性５　ｍｉｎ；９５　ｏＣ变性５０　ｓ，　５０～６Ｏ℃复性５０　Ｓ，７２　ｏＣ延伸５０　Ｓ，３０个循环；最终７２　℃延伸１０　ｍｉｎ。　２．２长白山中蜂２１个微卫星座位等位基因频率　１．２－３基因型判定　特异的扩增产物经８％聚丙烯酰胺凝胶电泳，用　根据各位点不同基因型数目计算出长白山中蜂２１　个微卫星座位的等位基因频率，结果见表３。　３讨论　银染法显影、定影。Ｋｏｄａｋ成像系统拍照保存图片。利用　Ｋｏｄａｋ　Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＩＤ　Ｉｍａｇｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ根据　本研究２１个微卫星位点分布于中蜂的１４条染色　ＰＢＲ３２２／Ｍｓｐ　Ｉ　Ｍａｒｋｅｒ为标准计算扩增片段的大小。　１．３统计方法　体上，覆盖了中蜂基因组８５％以上的染色体，因此能够　较好地反映长白山中蜂的遗传多样性，具有较高的可　信性。　等位基因数量反映了某个基因座在进化过程中所　利用Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ—Ｔｏｏｌｋｉｔ软件［９１计算等位基因频　率与期望杂合度。根据Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等【　Ｏｌ的公式计算每一个　群体每一个位点的多态信息含量。　ｎ　ｎ－１　ｎ　积累的遗传变异，等位基因数量越多说明进化历史上　这个基因座突变越活跃，导致物种在自然选择中发展　ＰＩＣ＝Ｉ一　ｐ　一２∑Ｐｉ２ｐｊ２　ｎ为等位基因数，ｐ　为第ｉ个等位基因的基因频　率，　为第ｊ个等位基因的基因频率。　的取向越多，对生活环境适应的潜能越大。从本试验结　果来看，长白山中蜂２１个微卫星座位中共检测到３９　个等位基因，平均等位基因数为１．８５７１个，最高为５　个，最低为１个，表明这些微卫星座位多态性较低。　２２　试验研究报告　中国蜂业　ＡＰＩＣＵＬＴＵＲＥ　ＯＦ　ＣＨＩＮＡ　２０１５年７月　第６６卷　表２长白山中蜂２１个微卫星标记等位基因数、等位基因大小、平均期望杂合度、多态信息含量　多态信息含量（ＰＩＣ）是衡量基因片段多态性较好的　指标，当ＰＩＣ＞Ｏ．５时，该座位为高度多态性座位；０．２５＜　ＰＩＣ＜Ｏ．５时，为中度多态性座位；Ｐ／Ｃ＜Ｏ．２５时，为低度多　表３各位点等位基因频率　态性座位【“１。同时多态信息含量关系到该座位可用性及　使用效率，多态信息含量越大，在一个群体中，该座位　杂合子比例则越大，提供的遗传信息就越高。本研究中　有１个位点处于高度多态，６个位点属于中度多态性位　点，４个位点属于低度多态性位点，１０个位点无多态　性，平均ＰＩＣ值为０．１６７９，说明这２１个微卫星位点在　长白山中蜂群体中所提供的多态信息含量较低，用以　分析其遗传多样性具有较高的有效性和可靠性。　基因杂合度也称为基因多样度，一般认为它是度　量群体遗传变异的一个最适参数，其值越大说明群体　遗传变异越大，反之，则越小。泽格．欧特将多态位点定　义为杂合度至少为０．１０的位点【埘，本研究所分析的２１　个微卫星标记中，１　１个位点均有较高的多态性（均高于　０．１０），占５２．３８％，１０个位点为０，占４７．６２％。群体遗传　多样性较低，选择潜力较低，今后可将它们作为候选遗　传标记用于性状和标记间的连锁分析，并对种质保存　提供参考。平均基因杂合度大小近似的反映出遗传结　构变异程度的高低。吉挺　”使用８对微卫星标记对江　苏省中华蜜蜂进行遗传多样性研究，宜兴中蜂的８个　位点的期望杂合度为０．４４２４，本研究中长白山中蜂２１　注：ｐｉ为某一座位第ｉ个等位基因的频率，ｉ＝ｌ，２，３，４，５。　个微卫星座位的平均基因杂合度为Ｏ．２０６８，低于宜兴　中蜂，显示出较低的遗传多样性和选择潜力。　本研究结果表明，长白山中蜂的群体遗传变异较　（下转第４７页）　２０１５年７月第６６卷　中国蜂业　ＡＰＩＣＵＬＴＵＲＥ　ＯＦ　ＣＨＩＮＡ　蜜源植物与授粉　４７　１５．芝．５５Ｉ　开花期６－８月；花期３０～４Ｏ天。　前后始花。吉林中西部平原区：７月中旬至８月中旬；东　部山区：７月下旬至８月中旬。内蒙古７月中旬至８月　中旬。　安徽７月上中旬至８月中旬。江西早芝麻：６—７月；晚　芝麻：７—８月。河南早芝麻：７月上旬始花；晚芝麻：７月　１８．荞麦　开花期：早养麦７　８月，晚养麦９～ｌ０月；花期３Ｏ一　４０天。　下旬始花。湖北早芝麻：７月上旬始花；晚芝麻：７月下　旬至８月上旬。湖南洞庭湖区：６月下旬至７月下旬。　１６．棉花　陕西８月至９月下旬。甘肃８－９月。宁夏７月中旬　开花期７－９月；花期：长江和黄河中下游产棉区　５０—６０天，新疆地区７０～９０天。　至９月上旬。山西始花时间：晋北７月下旬；晋中８月　上旬；晋西８月中旬；晋东南８月下旬。河北始花时间：　承德地区８月上旬；石家庄以南９月中旬。辽宁始花时　江苏７月底至９月初，泌蜜盛期在８月上中旬。安　徽７月中旬至９月中下旬。河南７月中旬至８月下旬。　间：建平县８月份１Ｏ～１５日；北票、阜新８月中旬。内蒙　古８月上旬至９月上旬。　１９．野坝子　湖北７月下旬至９月中旬。新疆吐鲁番地区：６月中下　旬至９月中下旬；其他：７￣９月。山东７月上中旬至８月　底或９月初，河北６月下旬至１０月上旬。　１７．向日葵　开花期９月中下旬至ｌ２月中旬；花期约６Ｏ天左　右。　开花期７～８月；花期约２５天左右。　黑龙江７月中旬至８月中旬。新疆南疆：６月中旬　至７月中下旬；北疆：７月上旬至８月上中旬。山西７月　四川冕宁以北：９月下旬至ｌ１月上旬；泸沽附近：　ｌ０月上旬至ｌ１月中旬；西昌、凉山：１Ｏ月中旬至１１月　下旬。云南始花时间：昭通９月中旬；寻甸９月下旬；昆　明ｌＯ月上旬；石林１０月中旬；弥勒１０月下旬。贵州ｌ０　月上旬至１２月中旬。　下旬至８月上旬。河北始花时间：邯郸地区７月初；张　家口地区８月上旬；仓州地区８月中旬；廊坊地区９月　初。辽宁南部：８月１０—１５日始花，大向日葵７月２０日　（上接第２２页）　小，多态信息含量较低，说明其近交程度较高。但在对　其进行品种进行长期保存时，需要保持一定的规模，并　运用有效的保种措施，如建立自然保护区等，保护种质　基因资源，防止有利基因的丢失。　参考文献　５０１－５０８．　［７】吉挺，陈晶，潘瑞．在不同提取方法下蜜蜂基因组ＤＮＡ浓度　的比较【Ｊ】．中国养蜂，２００５，５６（１２）：１０—１１．　【８】Ｍｉｃｈｅｌ　Ｓｏｌｉｇｎａｃ，Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ　Ｖａｕｔｒｉｎ，Ａｎｎｅ　Ｌｏｉｓｅａｕ，ｅｔ　ａ１．Ｆｉｖｅ　ｈｕｎｄｒｅｄａｎｄｆｉｆｔｙｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｔｈｅ　ｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅ　ｈｏｎｅｙｂｅｅ　…１　龚一飞，张其康．蜜蜂分类与进化【Ｍ】．福州：福建科技出版社，　２００２．１９－２１．　（Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｉｆｅｒａ　Ｌ）ｇｅｎｏｍｅ【Ｊ】．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　Ｎｏｔｅｓ，２００３，３（２）：　３０７－３１　１．　［２】李志勇，王志．长自山区中蜂资源的保护与利用［Ｊ］．特产研究，　２００４，０４：４２－４５．　【９】Ｐａｒｋ　ＳＤＥ．ＴｒｙｐａｎｏｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＷｅｓｔＡｆｒｉｃａｎＣａｔｔｌｅ　ａｎｄｔｈｅＰｏｐ—　ｕｌａｔｉｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ［Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ］．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｄｕｂｌｉｎ，２００１．　［３】樊斌，彭中镇，李奎，等．微卫星标记及其在猪遗传育种中的　应用【Ｊ】．河南农业大学学报，１９９９，３３（２）：１６１—１６５．　［１０１　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　Ｄ，Ｗｈｉｔｅ　Ｒ，Ｓｋｏｌｎｉｃｋ　Ｍ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｉｔｏｎ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｌｉｎｋ－　ａｇｅ　ｍａｐ　ｉｎ　ｍａｎ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｒｆａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ【Ｊ】．　［４］王德前，陈国宏，吴信生，等．运用微卫星技术分析中国地方　鸡品种的亲缘关系叨．扬州大学学报：农业与生命科学版，２００３，　２４（２）：１－６．　Ａｍ　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ，１９８０，３２（３）：３１４－３３１．　【１　１】Ｖａｎｈａｌａ　Ｔ，Ｔｕｉｓｋｕｌａ—Ｈａａｖｉｓｔｏ　Ｍ，Ｅｌｏ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅ－　ｎｅｆｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｅｉｇｈｔ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｌｉｎｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｍｉｃｍｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｍａｒｋ－　【５】屠云洁，陈宽维，汤青萍，等．江西４个地方鹅品种遗传多样　性的微卫星标记分析【Ｊ】．扬州大学学报：农业与生命科学版，　２００６，２７（１）：３３－３７．　［６］ＢａｋｅｒＪ　Ｓ　Ｆ．Ａ　ｇｌｏｂａｌｐｒｏｔｃｏｌｆｏｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ａ＿　ｍｏｎｇ　ｄｏｍｅｓｔｉｃ　ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ　ｂｒｅｅｄｓ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｔｈ　ｗｏｒｌｄ　ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１９９４，２１：　ｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，７７￣）：７８３－７９０．　【ｌ２】Ｊｕｒｇ　Ｏｔｔ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆ　ｏＨｕｍａｎ　ｅｎｅｔＧｉｃ　Ｌｉｎｋａｇｅ（ｅｖｒｉｓｄ　ｅｄｉｅｉｔｏｎ）．　Ｂａｌｉｔｍｏｒｅ：Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙ　ｔＰｒｅｓｓ，２００１．　【ｌ３】吉挺，陈晶，殷玲，等。江苏省野生及家养中华蜜蜂微卫星　ＤＮＡ遗传多样性分析［Ｊ］．中国畜牧兽医，２００７，３４（１　２）：３９—４１．