蛋白质的水溶液是稳定性的胶体溶液 稳定的原因有两个 1 水膜 2 电荷 蛋白质沉淀
物理化学因素影响下，蛋白质稳定性遭到破坏，以固体的形式从溶液中析出的作用。包括可逆沉淀和不可逆沉淀 可逆沉淀: 盐溶（salting in）
纯水或低盐溶液中溶解度较低的蛋白质，通过增加无机盐使溶解度增加 盐析（salting out）
高浓度的中性盐类可以脱去蛋白质分子表面的水膜，并中和蛋白质分子的电荷，从而使蛋白质从溶液中沉淀下来的过程 常用的中性盐：硫酸铵，氯化钠，硫酸钠等 不可逆沉淀
有机溶剂沉淀：如乙醇、丙酮、
生物碱试剂沉淀 :如苦味酸、三氯醋酸（TCA) 、钨酸等.在pH值小于蛋白质pI时，其酸根负离子能与蛋白质分子上的正离子相结合 重金属盐沉淀：金属正离子与蛋白质分子中负电荷结合 加热或改变pH等 实验2 蛋白质的透析脱盐 透析法（dialysis）
蛋白质是生物大分子，分子的直径在1-100nm之间，不能通过半透膜（有微孔的膜）；而无机盐等小分子化合物能自由通过半透膜。利用这一特性，将蛋白质与小分子化合物分离开来。这就是透析
本实验利用透析的方法把实验一盐析中所用硫酸铵去掉，达到分离纯化的目的
实验所用半透膜：玻璃纸
实验3 蛋白质的两性实验——酪蛋白的pI测定 蛋白质与氨基酸类似，是两性电解质
蛋白质分子在等电点时不带电荷，溶解度最低，容易聚集沉淀
本实验利用溴甲酚绿做指示剂，根据颜色的变化和等电沉淀的原理，确定待测蛋白酪蛋白的pI 注意事项：用干滤纸
硫酸铵缓慢加入 玻璃纸用橡皮筋扎紧
实验二 蛋白质的定量测定-----双缩脲法测定蛋白质浓度 实验目的：学习双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法
掌握分光光度仪的使用方法 掌握Excel软件制作标准曲线
蛋白质含量：蛋白质混合物中蛋白质的含量或总蛋白质含量 目前常用的方法 1）凯氏定氮法
①紫外吸收法 2）分光光度法 ②染料结合法 ③比色法： 双缩脲法 Folin-酚法
根据测定时所用的光源波长的不同，分光光度法可分为可见分光光度法、紫外分光光度法和红外分光光度法等几种。 （1）利用吸收光谱对物质进行定性分析
常用的方法有：比较吸收光谱曲线法、比较最大吸收波长法、比较吸光 度的比值。
（2）利用吸收光谱对物质进行定量分析 Beer-Lambert定律－吸收光谱法基本定律
描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系
含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。 T=I/I0
A=Ig1/T=IgI0/I=KCL
其中：T为透光率； A为吸光率； I0为入射光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度； L为溶液光程的厚度
以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。 比较法
对个别样品进行测定，且A-C曲线线性良好直接比较测定结果。 A标 =K标C标L标 A未知 =K测 C测 L测 C测=A测/A标xC标
2. 双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理
①
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。
②
蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。
③ 在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测定蛋白质浓度。
注意事项：
须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 实验三 唾液淀粉酶活性的观察 实验目的：
掌握酶的催化活性，酶的高效性和特异性
了解各种因素（如温度、pH及一些化学物质）对酶活性的影响 唾液淀粉酶的制备和活性观察
原理：酶是生物体内具有催化功能的生物大分子，也叫生物催化剂。 酶活性: 酶的催化能力,用催化化学反应的速度表示 酶活性的测定方法： 1）定底物 2）定时间
影响酶活性的因素：
pH值的影响: 能使酶活性达到最高时的pH值，称为该酶的最适pH。 温度的影响: 在一定温度范围内，随着温度的升高，酶促反应速度增加，直至达到最大值。在一定条件下，能使酶活性达到最高的温度即酶的最适温度。 激活剂和抑制剂的影响: 能增高酶活性的物质即称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。
注意事项：酶同时放，唾液、淀粉摇匀
实验四 电泳技术概论 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 目的：了解电泳的概念和一般原理；
掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作技术；
判别动物血清中各种蛋白组分
原理：不同溶质由于所带电荷性质，数量以及分子大小、形状不同，在电场中的泳动方向和速度不同而被分离.
迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。
注意事项：点样量适当，点样动作轻、稳。电极不能放错 实验三 层析技术 分子筛凝胶过滤分离血红蛋白和核黄素 目的：学习层析技术的基本原理
掌握凝胶层析法分离混合物的基本原理 了解凝胶层析法的分离血红蛋白的基本操作
原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。 名称 操作方式 固定相 流动相 分离依据 分配层析 纸层析 薄层层析 液体 液体 溶解度 离子交换层析 离子交换柱层析 固体 液体 带电性 静电引力 吸附层析 吸附薄层层析 固体 液体 气体吸附层析 固体 气体 吸附力 亲合层析 酶与底物 抗原与抗体 固体 液体 配体专一性 凝胶层析 凝胶过滤 固体 液体 分子大小 概念：凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析，当生物大分子随流动相通过装有作为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。
原理：凝胶颗粒内部具有多孔性网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
注意事项：各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。
始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。 装柱要垂直正确
实验五 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白 目的：掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理； 学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术； 了解血清蛋白的主要成份。
原理：不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品通过浓缩胶的浓缩按分子大小排列成层，然后进入分离胶，随着电泳的不断进行，不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开。
连续胶电泳
采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统（样品缓冲液、凝胶缓冲液 和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度相同的条件下进行。 优点：
制胶简单、快捷
缓冲液pH值恒定，可以防止样品进胶后因pH值改变发生的凝聚和沉淀 缓冲系统组成简单，来源广泛 缺点： 分辨率不高
不连续胶电泳
采用不相同孔径的凝胶和不同缓冲系统的电泳方式，在电泳分离过程中，由
于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带，然后
在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离。 优点： 分辨率高
用于复杂和特殊样品的分离 不连续电泳的四种不连续体系 凝胶的不连续 缓冲液成份的不连续
缓冲液pH值的不连续 电压梯度的不连续
不连续电泳的三种物理效应 样品的浓缩效应 凝胶的分子筛效应
电荷效应
实验六 动物肝脏DNA的提取
目的：了解从动物组织中提取DNA的一般原理；
掌握DNA提取的方法和步骤。
原理： 利用不同浓度的氯化钠溶液中脱氧核糖核蛋白(DNP)和核糖蛋白(RNP)的溶解度不同,使两者分离。同时利用SDS使DNA与蛋白质分开,利用氯仿-异
戊醇去除蛋白质,使DNA溶于浓盐溶液中,再用高浓度的乙醇使DNA析出. 主要试剂作用： EDTA
螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子
DNase作用时需要一定的金属离子作辅基 抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用 SDS
抑制核糖核酸酶的作用
溶解细胞膜上的脂质与蛋白，溶解膜蛋白而破坏细胞膜
与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来 氯仿
强蛋白质变性剂，使液相与有机相分开 抑制DNA酶的活性
上层-----水相 中间层---蛋白质 下层-----有机相
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