发展中的DNA测序技术

《生物工程进展》1997,Vol.17,No.4

发展中的DNA测序技术

赵晓娟　刘金毅综述　蔡有余　琦祖和　审校

(中国医学科学院　中国协和医科大学实验动物研究所　北京)

*

　　DNA序列分析是基因工程和分子生物学领域最重要的技术之一,是了解基因结构和功能的基础。“人类基因组计划”(humangenomeproject)的实施,有力地推动了高速DNA测序技术的发展。除经典的测序方法在技术环节上的不断改进外,近年来发展了一些全新的DNA测序方法,如毛细管凝胶电泳法、阵列毛细管凝胶电泳法、超薄层凝胶板电泳法以及不用电泳分离的直接测序技术,如杂交法、质谱法、原子探针法、流动式单分子荧光检测法等。

经典的DNA测序就其原理来说主要分为化学测序法和双脱氧链终止法。1977年,Max-am和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。这一方法是将模板DNA的一端标记之后,在四组或五组互为独立的化学反应中分别得到部分降解,其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。在这几组反应中,通过化学裂解形成具有共同起点而终点不同的放射性标记的分子。经过电泳及放射后自显影可以读出距离标记位点250个核苷酸以内的DNA序列,不仅适于单链,也可用于双链测序。到目前为止,这一技术在模板DNA标记和特异性化学反应方面都进行了改进,DNA序列的可读性也随之提高,成为DNA序列分析的基本方法之一。同年,Sanger推出了双脱氧链终止法。用链终止剂2′,3′-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)取代一种脱氧核苷三磷酸(dNTP),其中dATP可用放射性同位素标记。在含有模板、引物的A、G、C、T四个反应管中,DNA聚

　　*中国协和医科大学基础医学研究所。合酶合成出一系列以ddNTP为3′末端的不同长度的新链,电泳和放射自显影后,能迅速地读出DNA序列。双脱氧法不仅具有化学法的优点,而且极适于大规模测序。不久,Messing等引入噬菌体M13DNA为克隆载体,使单链

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DNA制备的困难迎刃而解。至此,双脱氧法结合M13克隆成为获取DNA序列信息的一种最经典方法。之后,人们在DNA序列分析的

基本策略、提高测序的精度及效果等方面进行了不懈的努力。例如,1982年,洪国藩建立了“非随机”DNA序列测定法,使测序速度明显提高;由于双链DNA测序省去了M13测序亚克隆的构建这一步骤,近些年来倍受欢迎[3];使用碱基类似物dITP或7-deaza-dGTP取代dGTP,减少了凝胶电泳后压缩效应给阅读带来的麻烦;各种DNA聚合酶的改进,如人工修饰的T7DNA聚合酶(也称测序酶Sequenase);使用S-dATP标记和缓冲液梯度胶分离,改善了电泳图谱的可读性,增加DNA顺序的可读长度等等。

以下主要就近年来DNA测序中的重大改进作一概述。

　　一、非放射性物质的使用

随着人们对放射性同位素对人体危害的进一步认识,在许多实验室已经使用非放射性物质取代放射性同位素。利用地高辛和生物素测序是近年来发展的一种测序手段。其酶学部分利用了双脱氧法的原理,但在测序反应体系中,

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以非放射性标记物(如地高辛、生物素)代替放射性同位素示踪测序反应的产物,最后通过酶显色反应显示出测序结果。又如Promega公司推出的银染测序方法,利用较为敏感的银染色来检测序列胶中的DNA条带。这一方法比传统的检测手段快速、安全、费用低廉,成为双脱氧法序列分析中独具魅力的测序系统。最近又报导了一种使用“链亲和素包裹磁性颗粒”的固相化学测序方法,采用化学发光物1,2-diox-[5]

这种etane为底物完全代替同位素进行标记。方法是基于生物素-DNA-链亲和素混合物的发现。此种混合物在化学测序反应条件下保持稳

定。聚合酶链反应产生的5′-生物素末端首先被链亲和素磁粒捕捉,室温时在磁粒上发生一系列化学反应,随后用哌啶分裂,其产物用凝胶电泳分离,转到尼龙膜上,然后对化学发光物检测可显示序列结果。由于完全排除了化学物质的污染,又压缩了传统的化学测序方法的沉淀/离心作用的实验时间,结果可获得高质量的序列梯度。也有报道膜上的DNA通过生物素-亲和素-生物素间接挂上碱性磷酸酶进行化学反应,最后检测序列的方法[6]。　　二、DNA测序的自动化

为适应大规模测序的需要,高速DNA测序技术在不断发展。美国应用生物系统公司(AppliedBiosystem)于1987年,继化学法和Sanger酶法问世整整十年以后,推出了自动DNA序列测定仪(370A和373A型)[7],九十年代初,欧洲分子生物学实验室(EMBL)与瑞典Pharmacia-LKB公司也联手推出了最新型的全自动激光序列分析仪(AutomatedLaserFluorescentSequencer,A.L.F),完成了DNA序列测定的又一次重大突破。

两种自动测序仪的原理仍沿用Sanger等建立的双脱氧链终止法,DNA聚合酶催化延伸反应产生的DNA片段仍需通过序列胶电泳分离,但都采用了无放射性伤害的荧光标记物。ABI公司的研究人员经长期实践摸索,最终确定了四种荧光基团分别作为DNA聚合酶延伸52

[4]

反应中四种ddNTP终止的DNA片段的标记

物。目前ABI公司的荧光素有两种掺入方式。第一种是将四种荧光素预先标记在测序反应所用引物的5′端,形成四种标记引物,在测序反应的四支管中,特定荧光标记的引物则与特定的ddNTP底物保持对应关系。第二种是将荧光素连在作为终止底物的ddNTP上,在反应中,带荧光发色基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时,使该片段3′端标上了一种特定的荧光素,四种荧光素分别与四种ddNTP底物连接,反应结束时产生的四组DNA片段分别由特定ddNTP所终止,且标记有四种不同的荧光发色基团。采用四标记单泳道电泳法分离DNA,一次可读出DNA的长度为400-500bp。最近ABI公司又推出了更为高效的377测序仪。

而A.L.F采用单种荧光素标记,也有两种标记方法。第一种是以5′端标记的引物进行反应,第二种是使用荧光素标记核苷酸(Fluore-该仪器适用于定向测dATP或Fluore-dCTP)。

序。采用单荧光标记四泳道分别加样的方法,可提高测序结果的准确性,使用该仪器每克隆能分离到1000bp,两条DNA模板分别测序后精确率>99.7%。

目前,人们在尝试使用六聚体条带进行高质量的DNA自动测序。预先合成短寡聚核苷酸文库(8-10bp),该文库为使用六聚体条带测序提供了一种切实可行的方案,结果的精确率>99%。也有实验室使用一种特殊的能提高光谱特性的荧光团-BODIPY标记DNA进行自动测序[9]。BODTIY的单、双标记引物显示了相同的泳动性和高荧光强度,由于BODIPY标记引物的高灵敏度,该方法每次所使用的反应试剂至少比传统的标记方法少33%。　　三、DNA测序的新方法

1990年美国制定了世界上最庞大的基因研究计划——“人类基因组项目”,拟定在15年

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内完成对人类基因组的全部DNA序列分析、定位及遗传学的研究。如此艰巨的任务使高速DNA序列分析新技术和新方法的研究势在必行,一些全新的DNA测序方法应运而生。

(一).以凝胶电泳为基础的测序方法

1.毛细管电泳激光荧光法

毛细管凝胶电泳比板凝胶电泳分离速度提高了25倍,但一只毛细管只能分离一个样品,因此分析效率并未提高。为了提高分析效率,1992年美国的Mathies等

[10]

目前,欧洲许多分子生物学实验室都在致力于新的DNA测序方法的研究,主要包括以下几个方面:

1.杂交法

杂交法(Sequencingbyhybridization,SBH)是有希望用于快速DNA测序分析的一种新技术[16],它应用一套已知序列的n-mer长的寡核苷酸探针,与待测DNA样品进行杂交,

首先提出阵列毛

细管电泳新方法,采用激光聚焦荧光扫描检测装置,25只毛细管并列电泳,每只毛细管在1.5小时内可读出350bp,DNA序列分析效率可达到6000bp/h。1994年日本的Kambara等提出另一种测序装置,20只毛细管并列电泳,采用激光荧光电荷藕合阵列检测器(CCD)检测,有较高的灵敏度。美国的Yeung等

[12]

[11]

寻找靶DNA链上的互补序列,形成完全互补

的双链,根据杂交情况排列出样品的序列信息。现行的做法是利用共价结合在寡核苷酸3′或5′末端的衔接物与玻璃板或凝胶结合,从而形成固定住的寡核苷酸小块,不同碱基组合的寡核苷酸小块排列在一起形成探针点阵[17]。寡核若寡核苷酸长为8bp,则需要4种寡核苷酸小块的排列。但该方法误差较大,且不能重复测点突变的检测,已日趋成熟。SBH作为一种快速、自动化的测序方法,相信在将来几年中会有迅速发展,在未来的大规模测序以及分子生物学和基因诊断中发挥重要的作用。

2.质谱法

发展较快的基体协助激光解析离子化(MALDI)-时间飞行质谱法用来检测双脱氧循目前又发展了一种延迟离子抽提技术(delayedionextraction,DE-MALDI)提高MALDI分析精度的方法[18]。循环测序过程中,每一特异的双脱氧末端片段检出限为100fmol,测序速度可高达100bp/s。这一技术提供了一种新的非凝胶碱基DNA测序方法,最终有可能被认为比传统的方法学有相当快速的优势。最近又

[19]

又提出了苷酸小块的数目取决于寡核苷酸片段的长度。

100只毛细管阵列电泳装置,采用CCD检测器同时检测100只毛细管的DNA分离样品,均获得满意效果。最近,Zhang等[13]使用无交联的聚丙烯酰胺凝胶,两小时之内分离四荧光标记的DNA片段达到640bp长度。

2.超薄层板电泳激光荧光法

一般的电泳胶厚度为200-400Lm,电场强度较低(75V/cm),限制了测序的速度。Smith等提出使用超薄层凝胶板电泳进行测序。采用50-100Lm凝胶板,配备流水冷却装置,场强提高到250V/cm,大幅度地提高了电泳速率。不久,又采用激光荧光CCD检测器检测,比常规电泳测序速度提高9倍,测序速度达到8000bp/h以上[14]。最近,一种基于超薄层板凝胶电泳的非连续的缓冲液系统——硼酸盐ED-[15]

TA-缓冲液系统被采用。与传统的凝胶系统相比,它有一定的优越性,能解决GC丰富区的迁移带现象。该系统明显提高了分析速度和分辨率。

在凝胶电泳DNA测序中,凝胶板的制备需手工操作,费时费力,虽然电泳速率有所提高,但制备凝胶板要花上二十几倍的时间,因此,很难断定哪一种方法更适用于人类基因组高速DNA序列分析,因此仍处于探索阶段。

(二).不用电泳分离的测序新方法定。目前SBH技术用于同源序列的比较测定、

环产生的DNA片段的序列已获得部分成功。

报道了一种MALDI-TOFDNA测序方法,部分双重探针(5bp单链伸出物)能在固定的、但无连接的长单链靶DNA上引导Sanger测序反应。该方法为将来的大规模的质谱DNA测序提供了可能。

3.原子探针显微镜

扫描隧道显微镜(STM)和原子力显微镜53

(AFM)新技术的发展,使快速、高分辨直接观测DNA分子构象成为可能。STM是采用相当于原子直径的导电探针扫描样品表面,通过连续测量移动的探头与分子表面之间形成的隧道电流,确定样品的三维图象。通过STM成功地观测到了DNA双螺旋结构和单个碱基对,单链分子中的单个核苷酸,所得结果与X射线结晶衍射法测得数据相吻合。根据扫描速度,DNA测序能达到1000bp/min以上。AFM是通过测量探针和DNA样品表面间的作用力,来确定分子表面形状,不要求样品导电。应用AFM已获得液体中DNA分子重现的图象

。

虽然STM和AFM具有直接观测DNA序列的能力,提供了一种新的高速DNA测序途径,但目前仍有许多问题,处于不断地探索阶段,有待于研究和开发。

4.流动式单分子荧光检测法

美国LosAlamos国家实验室Keller等发展了一种快速测序的新技术,可对单个分子进行检测。在模板DNA片段上标记不同的荧光基团,然后置于液流系统中,用水流载带DNA片段流动,再用外切酶快速切断DNA中标记的单个碱基,通过激光荧光检测,便可得到DNA序列,测序速度可达到100-1000bp/s。目前检测单个荧光分子技术正在取得长足进展[22],但目前这些新技术还没有完全应用到实际工作中,仍处于研究阶段。

DNA测序的研究工作,历经了数十年,成绩辉煌,曾获得两次诺贝尔奖。“基因组计划”对人类提出了严峻的挑战,使许多科学家在对原有技术进行不断的改进、完善的同时,亦致力于发展更加快速、简捷、经济的高速测序新方法、新技术。目前从国内来看,仍然是以双脱氧法为

[21]

[20]

经典模式进行测序,与国际上相比有一定的差距,但我国的科学家们正在为人类基因组计划

的实现进行不懈的探索,相信在不久的将来会有更迅速的发展。旨在测定人类整个基因组顺序的计划的成败将在很大程度上取决于有无更加有效的DNA测序技术的出现,而新技术的出现也必将推动分子生物学的迅速发展。

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DevelopingDNASequencingTechnique

(InstituteofLaboratoryAnimalScience,CAMSandPUMC,Beijing100021)

ZhaoXiaojuan,etal

Abstract　DNAsequenceanalysisisoneofthemostimportanttechniquesingeneengineer(下转第22页)54

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StabilityofmRNAinprotokaryote

ZhongZhenping

(InstituteofDevelopmentalbiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100080,China)

Abstract　StabilityofmRNAinprokaryoteisaffectedbymRNAsequence,nucleases,ribo-somesandmRNAbindingproteins.Stemloopstructure,AUUUAsequenceandpoly(A)tailregulatethestabilityofmRNA.Manykindsofnucleases,includingRNaseE,RNaseK,RNaseⅢetc,alsoparticipateinreducingmRNA'slife,buttheiractingmechanismsaredifferent.Re-searcherssupposethatmRNAbindingproteinsinprokaryoteregulatemRNA'sstability.Ribo-somesaregenerallybelievedtoprotectmRNAandretarditsdecomposition.Intheendofthispa-per,welistsomemethodswhichusedtofrequentlystudythestabilityofmRNA.

(接第54页)

ingandmolecularbiology,andbasisofstudyingthestructrueandfuctionofgenes.Humangenomeprojectcompelustodevelophigh-speedDNAsequencing.Exceptthatclassicalmethodshavebeenimprovedindetail,afewnewDNAsequencingmethodsarise,suchascapillaryarrayelectrophoresis,ultrathinslabgelelectrophoresis,sequencingbyhybridization,massspectrome-try,atomicprobemicroscopyandsinglemoleculefluorescencedetectioninflowingsamplestreams.

Keywords　DNASequencing,CapillaryArrayElectrophoresis,MassSpectrometry,Atom-icProbeMicroscopy,AequencingbyHybridization.

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