基于光谱分析的姜黄素碱性自氧化及其产物的抗氧化活性

杨昕;张迪;宋立敏;许茜;许卉;刘珂

【摘 要】在室温及弱碱性条件下进行姜黄素自氧化反应,应用柱色谱分离、 紫外吸收光谱(UV)、 红外光谱(IR)、核磁共振波谱(NMR)和质谱(MS)等分析技术,分离并鉴定了主要自氧化产物的化学结构.针对反应进程,采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)分析技术,从底物消除和产物生成2个方面进行了定性及定量研究.以抗坏血酸作阳性对照,采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、 羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O-·2)体系,定量比较了产物和姜黄素的体外抗氧化活性.结果表明,姜黄素在室温及弱碱性条件下的降解消除以自氧化反应为主,姜黄素消除过程和自氧化产物生成过程均符合一级动力学特征.自氧化产物具有双环乙酰丙酮的骨架结构,并显示有DPPH·,·OH和O-·2等自由基清除活性,但作用强度均显著低于姜黄素,因此在姜黄素应用过程中应严格控制pH条件,避免发生自氧化反应.%Curcumin is a natural antioxidant with strong biological and chemical activity. The curcumin degra-dation was carried out under weak alkaline conditions at room temperature, integrated used by means of column chromatography, UV, IR, NMR, MS and other spectral analysis techniques, the chemical structure of the major degradation products was isolated and identified. For the reaction process, the qualitative and quanti-tative studies were carried out from two aspects: substrate elimination and product formation by HPLC-DAD spectroscopy analysis technology. Ascorbic acid was used as a positive control, and its antioxidant activities were evaluated in vitro, by 1,1-diphenl-2-picrylhyrazyl free radical(DPPH·), hydroxyl radical(·OH) and superoxide radical( O-·2 ) scavenging assays, and

compared with curcumin quantitatively. The results showed that the main degradation of curcumin at room temperature under weak alkaline conditions was autoxidation reaction, both of which conformed to the first order kinetics. the structure of heptadiene-3,5-diketone in cur-cumin[(1E,6E)-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione] forms a quinone me-thide intermediate in the presence of alkaline environment, after a series of oxygenation, hydration, dehydra-tion and rearrangement, the target compounds bicyclopentadiones was a cyclization product with a tetrahydrofu-ran ring and cyclopentanedione structure in the molecule, we named CURC [ 6-hydroxy-1-( 4-hydroxy-3-me-thoxyphenoxy)-3-( 4- hydroxy-3-methoxyphenyl )-1, 3, 3a, 6a-tetrahydro-4H-cyclopenta [ c ] furan-4-one ] . Based on the established stable and reliable spectrophotometric system, the results of in vitro free radical scav-enging activity of CURC and curcumin are as follows. CURC has a certain scavenging activity on DPPH·, ·OH and O-·2 , but the action intensity is significantly lower than that of curcumin. The EC50 values were 0. 17 mmol/L and 0. 022 mmol/L in the DPPH assay, 0. 33 mmol/L and 0. 098 mmol/L in the ·OH assay as well as 0. 38 mmol/L and 0. 056 mmol/L in the O-·2 assay, respectively. The obtained results suggest that the pH condition should be strictly controlled during the application of curcumin and avoid the autoxidation reaction. 【期刊名称】《高等学校化学学报》 【年(卷),期】2017(038)009

【总页数】7页(P1549-1555)

【关键词】姜黄素;自氧化反应;双环乙酰丙酮;抗氧化活性;光谱分析 【作 者】杨昕;张迪;宋立敏;许茜;许卉;刘珂

【作者单位】烟台大学化学与化工学院,烟台264005;烟台大学药学院,烟台264005;烟台大学化学与化工学院,烟台264005;烟台大学药学院,烟台264005;烟台大学药学院,烟台264005;烟台大学分子药理和药物评价教育部重点实验室,烟台264005;烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,烟台264005;苏州雷纳药物研发有限公司,苏州215123 【正文语种】中 文 【中图分类】O657

姜黄素(CUR)是一种具有悠久应用历史的药食同源性天然多酚类抗氧化剂, 广泛存在于姜黄、 郁金及莪术等姜科植物中. 实验和临床研究表明, 姜黄素具有以抗氧化为基础的抗炎、 抗菌、 降脂、 抗风湿、 抗肿瘤、 保肝利胆和抗老年痴呆等多种药理活性[1]. 近年来的研究还发现, 姜黄素具有广谱的肿瘤细胞毒活性, 对肿瘤发生、 发展和转移的各个阶段均能产生多靶点的积极干预, 且安全性好, 具有作为抗突变剂和抗癌剂的巨大潜力, 美国国立肿瘤研究所(NCI)已将其列为第三代肿瘤化学预防剂, 姜黄素也因此成为当前生命健康领域最受瞩目的天然产物之一[2～4]. 作为药物, 由化学、 物理、 微生物、 药效和毒性共同决定的稳定性是保证其安全性和有效性的基础, 必须在从原料到制剂的生产、 贮藏和使用的全过程中保持稳定. 其中, 化学稳定性至关重要, 也是药物质量控制的重点内容[5]. 受独特的化学结构影响, 姜黄素具有极强的抗氧化性, 同时也易于发生光催化降解、 聚合、 氧化等反应, 导致化学结构改变. 近期的研究发现, 在碱性pH或环氧合酶(COX)、 脂氧合酶

(LOX)等催化酶作用下, 姜黄素可经自氧化或ROS介导生成的苯氧自由基中间体发生分子内环合反应, 使2个苯环之间的长链共轭β-烯二酮链段发生改变, 生成具有四氢呋喃并环戊二酮结构的分子内环化产物[CURC, 6-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenoxy)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,3,3a,6a-tetrahydro-4H-cyclopenta[c]furan-4-one, 图1][6,7]. 然而, 该产物是否具有与姜黄素相似的抗氧化活性进而对其生理活性产生影响, 迄今尚无明确的结论.

本文基于高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)分析技术, 对姜黄素在碱性自氧化反应条件下生成CURC的反应进程进行了定性和定量研究, 在优化的反应条件下制得了具有足够纯度和数量的目标产物, 综合应用质谱和一维、 二维核磁共振波谱等方法进行了化学结构确证, 并采用光度分析方法, 在不同的体外自由基清除模型上, 对其与原形药物的抗氧化活性进行综合定量比较, 所得结果将为姜黄素作为药物的可靠质量控制和深入开发应用提供科学依据. 1.1 试剂与仪器

姜黄素(经HPLC测试纯度>99.5%, Sigma Aldrich公司); 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH, 成都艾科达化学试剂有限公司); 焦性没食子酸(PA, 分析纯, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 亚甲基蓝(天津市恒兴化学试剂制造有限公司); H2O2溶液(质量分数30%, 烟台三合化学试剂有限公司); 抗坏血酸(Vc, 分析纯)、 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、 邻苯二甲酸氢钾、 硫酸亚铁和乙酸乙酯等购自国药集团化学试剂有限公司; 硫酸、 盐酸和乙醇等均为分析纯试剂; 甲醇(色谱纯, 德国默克公司); Inluck Poly 50/65聚合物填料(北京英莱克科技发展有限公司); 实验用水为超纯水. LC-20AT型高效液相色谱仪(包括二元高压泵、 在线脱气机、 自动进样器、 VWD和DAD检测器)和UV-2550型双通道紫外光谱仪(日本Shimada公司); MS105DU型分析天平(美国Mettler-Toledo公司); HH-6型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司).

1.2 CURC的制备与纯化

在文献[6,8]基础上, 以转化率为指标对主要试剂的浓度、 用量以及反应时间进行考察, 获得了优化的自氧化反应条件. 即将姜黄素甲醇溶液(浓度约为5 mmol/L)加入到50倍体积的磷酸盐缓冲溶液(0.1 mol/L, pH=8.0)中, 混合均匀, 室温下放置48 h(期间适时振摇), 加盐酸(6 mol/L)调节pH≈4.0, 终止反应. 针对终止的反应体系, 采用溶剂萃取与柱层析分离相结合的方法, 进行目标产物的分离、 纯化. 分别按1/2和1/3的体积倍量用乙酸乙酯萃取终止反应液2次, 合并有机层溶液, 减压浓缩至干, 残渣用20%乙醇-水溶液溶解, 取上层清液, 上聚合物填料填装的层析柱(Φ 26 mm×180 mm), 以20%乙醇-水溶液常压洗脱, 收集第35～60个柱体积的洗脱液, 减压浓缩除去溶剂, 干燥, 得棕黑色粉末状目标产物. 1.3 HPLC-DAD分析

对目标产物进行高效液相色谱(HPLC)分析, 根据归一化峰面积及色谱峰进行纯度检查, 根据DAD检测器所得的光谱图进行初步的定性判断. 色谱柱为Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 柱温30 ℃; 以0.2%甲酸-水(A)/甲醇(B)混合溶剂体系为流动相, 流速1 mL/min, 梯度洗脱程序: 0～10 min 40%B, 10～25 min 40%B→90%B, 25～27 min 90%B→40%B, 27～32 min 40%B; 检测波长280 nm, 进样量20 μL. 1.4 光谱结构分析

分子量和分子式的测定采用Agilent 1290 Infinity/6530 Q-TOF MS型高效液相色谱-精确质量数四极杆-飞行时间质谱联用分析系统(美国Agilent公司). HPLC条件: Agilent TC-C18柱(250×4.6 mm, 5 μm), 流动相为甲醇/0.2%甲酸-水溶液(体积比2∶3), 流速1 mL/min, 柱温30 ℃, 检测波长280 nm, 进样浓度0.1 mg/min, 进样量5 μL; MS条件: 电喷雾离子源, 正离子检测, 离子传输毛细管温度350 ℃, 压力50 psi(1 psi≈6.895 kPa), 鞘气温度325 ℃, 流速12 L/min, 毛细管电压3.5

kV, 离子源喷射电压 2 kV; 分子式的自动确认和数据库检索采用增强版的MassHunter工作站.

UV-Vis光谱检测以甲醇为溶剂, 在200～800 nm波长范围内扫描; IR光谱经KBr压片后在Spectrum 65型傅里叶变换红外光谱仪(美国PerkinElmer公司)上记录400～4000 cm-1的光谱; 1D和2D NMR谱测试采用Avance Ⅲ 400型超导核磁共振波谱仪(德国Bruker公司), 以丙酮-d6为溶剂, TMS为内标, 1H NMR和13C NMR的观测频率分别为400.13和100.62 MHz, 所有实验均采用标准脉冲序列, 室温下分别测定1H NMR, 13C NMR, DEPT及化学位移相关谱1H-1H COSY, NOESY, HSQC和HMBC. 1.5 体外抗氧化活性的光谱测定

DPPH自由基(DPPH·)、 羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O-·2)清除能力是评价外抗氧化活性的常用指标[9～11]. 分别以各体系相应标记物的特征UV光谱吸收值为指标, 测定系列浓度试样的自由基清除率(cl, %), 并根据量-效关系曲线计算受试化合物对自由基清除的半数有效浓度(EC50), 以定量评价抗氧化活性.

取4.6 mL试样溶液置于10 mL比色管中, 加入0.4 mL DPPH溶液(1 mmol/L, 现用现配), 混合均匀, 室温下避光孵育30 min. 以等体积溶剂代替试样溶液于相同条件下反应, 作为空白反应组. 分别测定各反应液在517 nm处的吸光度, 按公式(1-As/A0)×100%计算试样对DPPH·的清除率, 式中: As和A0分别为试样组和空白组的吸光度值.

取0.5 mL试样溶液置于10 mL比色管中, 依次加入硫酸亚铁溶液(4 mmol/L)、 亚甲基蓝溶液(质量分数0.015%)及H2O2溶液(3 mmol/L)各0.5 mL, 混合均匀, 用缓冲溶液(pH=3.0)定容, 于30 ℃水浴中孵育30 min. 分别以等体积缓冲溶液代替试样溶液, 以等体积缓冲溶液代替试样溶液及H2O2溶液, 于相同条件下反应, 作为空白反应组和对照反应组. 分别测定各反应液在670 nm处的吸光度, 按公式

(A2-A0)/(A1-A0)×100%计算试样对·OH的清除率, 式中: A0, A1和A2分别为空白组、 对照组和试样组的吸光度值.

取0.5 mL试样溶液和5 mL Tris-HCl缓冲液(pH=8.2, 200 mmol/L)置于比色管中, 混合均匀, 于25 ℃孵育10 min, 快速加入0.5 mL 25 ℃预热的PA溶液(3 mmol/L), 混合均匀, 反应20 min. 分别以等体积缓冲溶液代替试样溶液, 以等体积缓冲溶液代替PA 溶液, 在相同条件下反应, 作为空白组和对照反应组. 分别测定各反应液在320 nm处吸光度, 按公式[1-(As-Ab)/A0]×100%计算试样对O-·2的清除率, 式中: A0, Ab和As分别为空白组、 对照组和试样组的吸光度值. 2.1 自氧化反应进行程度的分析与控制

针对反应体系进行HPLC分析, 采用梯度洗脱实现对姜黄素与主要反应产物色谱峰的有效分离, 并通过DAD检测器采集主要特征色谱峰, 进行初步的定性分析, 所得典型色谱图如图2所示.

所得结果与文献[7]报道的光谱图一致, 可以确定该色谱峰所对应的化学成分为目标产物. 因化学结构中长链共轭结构烯键的破坏, 导致姜黄素自氧化反应产物的UV光谱特征与姜黄素显著不同. UV光谱测定结果(图3)表明, 姜黄素在264

nm(lgε=4.15)和424 nm(lgε=4.78)附近有强特征吸收峰, 分别为苯环和长链共轭体系强的K带吸收; CURC在相同条件下的UV光谱图与之差异明显, 在280 nm处有最大的特征吸收(lgε=3.74), 同时在360 nm处有1个强吸收峰(lgε=3.00), 显示其不再含有姜黄素的长共轭结构, 相应的K带吸收随之蓝移且减弱.

基于上述HPLC分析条件和反应产物色谱峰的定性分析结果, 相同条件下分别以CUR与CURC转化速率为定量指标, 分析姜黄素的碱性自氧化反应进程, 结果如图4所示, 室温下的碱性自氧化反应符合一级动力学特征, CUR与CURC的反应速率常数分别为-0.126和0.104 h-1. 此结果进一步表明, CUR在室温及弱碱性条件下自氧化生成CURC约占其转化率的82.5%, 为CUR碱降解的主要反应形式.

2.2 CURC化学结构的光谱分析

通过精确质量数四极杆-飞行时间质谱测得目标化合物具有m/z 401.1223的准分子离子峰([M+H]+, 100%), 经分析系统工作站的分子式自动确认和数据库检索, 推测其分子式为C21H20O8. IR光谱测试结果显示, 目标化合物分子中含有—OCH3、 四氢呋喃环、 1,3,4-三取代苯以及连氧苯环的结构单元, 其中, 与—OCH3相关的位于2850和1388 cm-1处的峰分别为甲基的伸缩振动和弯曲振动吸收峰; 1516, 1431, 590及799 cm-1处为1,3,4-三取代苯的相关峰; 1584, 1468, 1272, 1082及939 cm-1处的峰为四氢呋喃环的骨架振动吸收, 1000～1300 cm-1间的多重峰则归属为连氧苯环的υC—O—C.

13C NMR谱在δ 50～200的区间共显示出21个非溶剂的C共振吸收信号, 与分子式中的C数一致, 表明目标分子无对称结构单元; DEPT谱进一步显示其中含有2个—CH3, 11个—CH和8个C, 没有—CH2; 谱图低场端δ 200.9处为—CO信号, δ 105～150间显示为烯键及2组苯环的芳C信号, δ 80～100间有2个连氧的饱和次甲基C信号, 而在高场端δ 54～57间分别有2个邻近的—OCH3和不连氧的饱和次甲基C信号. 1H NMR谱在δ 3～7的区间共给出11组非溶剂的质子共振吸收信号, 提示目标分子含有11种不同化学环境的H, 各组信号的积分数加和为17; 高场端δ 3.00附近有一宽而平的峰, 且在HSQC谱中无与之对应的碳信号, 推测结构中含有活泼氢信号; δ 3.76和3.87处有2组积分数均为3的单峰信号, 在HSQC谱上可见分别与δ C 56.6和56.2相关, 表明目标分子含有2个化学环境略有差异的—OCH3; δ 6.74, 6.71和6.69的信号在HSQC谱上分别与δ 120.7, 113.0及115.0的C信号相关, 结合这3组H信号的积分数、 化学位移值、 峰型及偶合常数, 提示目标分子中存在2个1,3,4-三取代苯的结构单元. 综合分析上述波谱数据和HMBC谱[图5(A)]的相关信号, 并与母体化合物姜黄素的波谱数据对比, 推断目标化合物结构为2-[(4′-hydroxy-3-methoxy)phenoxy]-4-(4″-hydroxy-3-

methoxy-(phenyl)-8-hydroxy-6-oxo-3-oxabicyclo [3.3.0]-7-octene. 在发生氧化和分子内环合后, 姜黄素原有分子结构的长链共轭和对称性被破坏, 同时形成了4个手性中心, 并导致氧化产物的构型差异. 因此, 针对目标化合物进一步进行了NOESY谱[图5(B)]分析, 重点考察其四氢呋喃环上4个饱和H信号的NOE相关情况. 结果表明, 在H-1, H-4和H-5间可见明显的相关信号, 但与H-2均未显示明显的相关信号. 推断目标化合物的相对构型为H-1α, 2β, 4α, 5α, 其1H和13C NMR谱数据与文献[7,8]报道的相同构型产物完全一致, 化学结构如图1所示, 1H NMR和13C NMR谱数据归属列于表1. 2.3 体外抗氧化活性分析

以水溶性抗氧化剂维生素C(Vc)作为阳性对照物, 采用光谱法测定了CURC和姜黄素对3种常见自由基DPPH·, ·OH 和O-·2的体外清除活性. 实验结果表明, Vc对这3种自由基清除的EC50分别0.024, 0.28和0.32 mmol/L, 与文献[12,13]报道值在数量级上无明显差异, 表明所建立的光谱测定体系稳定、 可靠, 所得CURC和姜黄素在实验浓度范围内的体外自由基清除活性量效关系如图6所示.

具有单电子的DPPH·在517 nm波长处有强吸收, 其溶液呈特征的紫色. 体系中自由基清除剂的存在导致单电子消失, 并造成此波长处的特征吸收降低, 其降低程度可以定量反映溶液中自由基清除剂对DPPH·的清除能力. 由图6(A)可见, 在实验浓度范围内, CURC和姜黄素对DPPH·的清除作用均存在明显的剂量依赖关系, 但CURC的清除率显著低于等剂量姜黄素, 进一步计算得二者的EC50分别为0.17和0.022 mmol/L, 表明CURC对DPPH·自由基的清除能力比原形药物姜黄素明显降低.

羟自由基(·OH)是一种氧化能力极强的自由基, 可通过对蛋白质、 核酸等生物功能大分子的影响造成严重的机体损伤, 因此·OH清除能力成为抗氧剂活性评价的一项重要指标[14]. Fe2+与H2O2在酸性介质中发生Fenton反应可生成具有很高反应

活性的·OH, 能氧化亚甲蓝成无色的氧化产物, 导致其在670 nm处的特征吸收降低. 若在该体系中加入抗氧剂, 可与·OH反应而阻碍指示染料亚甲蓝的氧化褪色, 抑制体系在670 nm处吸光度值的降低, 其抑制程度可以定量反映抗氧剂的·OH清除能力. 基于对这一体系的光谱测定, 定量评价了CURC和姜黄素的·OH清除能力, 结果见图6(B). 在实验浓度范围内, CURC和姜黄素对·OH的清除作用均存在明显的剂量依赖关系, 但CURC的清除率显著低于等剂量姜黄素, 进一步计算得二者的EC50分别为0.33和0.098 mmol/L, 表明CURC对·OH自由基的清除能力比原形药物姜黄素亦有显著降低.

超氧阴离子自由基(O-·2)具有很强的氧化能力, 在体内能通过脂质过氧化而导致多种疾病的发生和发展, 加速机体衰老. 在pH=8.2的弱碱性缓冲溶液中, 焦性没食子酸(PA)发生自氧化而生成O-·2及一种在320 nm处有特征吸收的中间产物. 体系中加入的抗氧剂会通过抑制O-·2的生成而降低中间产物的生成速率, 因此, 反应体系在320 nm处吸光度的变化程度可以间接反映抗氧剂对O-·2的清除能力. 基于对这一体系的光谱测定, 定量评价了CURC和姜黄素的O-·2清除能力, 结果见图6(C). 可见, 在实验浓度范围内, CURC和姜黄素对O-·2的清除作用均存在明显的剂量依赖关系, 但CURC的清除率显著低于等剂量姜黄素, 进一步计算得二者的EC50分别为0.38和0.056 mmol/L, 表明CURC对O-·2的清除能力比原形药物姜黄素显著降低.

以上研究结果表明, 姜黄素是一种高活性的天然抗氧剂, 对多种自由基均显示出强烈的清除活性, 尤其是对·OH和O-·2的清除作用显著高于公认的抗氧剂Vc. 自氧化反应产物CURC也显示出一定的自由基清除活性, 但在各模型上的作用强度比原形化合物姜黄素均显著降低. 从分子结构来看, CURC尽管保留了姜黄素原有的酚羟基, 但其中的长共轭链段结构和活泼亚甲基氢因氧化环合而消失, 抗氧化活性随之显著降低. 大量的构效关系研究结果表明, 姜黄素的直接抗氧化活性不仅与其分

子结构中的酚羟基密切相关, β-烯二酮链段中心的活泼亚甲基氢也具有十分重要的作用[15～17]. 本文结果也为这一构效关系结论提供了实验依据.

采用姜黄素为原料, 通过优化反应条件, 经碱性自氧化制得双环乙酰丙酮结构氧化产物, 并对该反应进程进行了定性和定量研究,运用UV, IR, NMR以及LC-MS等手段对其进行了检测和表征, 最终确定了氧化产物分子式、 结构及构型. 采用DPPH自由基(DPPH·)、 羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O-·2)3种不同体外自由基清除模型, 结合光度分析方法, 定量测定了姜黄素及其氧化产物的抗氧化活性并进行了比较. 结果表明, 自氧化产物CURC在各模型中均表现出较姜黄素显著更低的抗氧化活性. 此结果提示我们, 在姜黄素的深入开发应用过程中, 应严格控制条件, 防止自氧化的发生.

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† Supported by the National Major Scientific and Technological Special Project for “Significant New Drugs Development” during the Twelfth Five-year Plan Period, China(No.2014ZX09301306-006) and 2017 Graduate Science and Technology Innovation Fund of Yantai University, China(No.YDYB1725).