实验六ABO血型鉴定、血涂片的制作与血细胞显微观察(精)

实验六：ABO血型鉴定、血涂片的制作与血细胞显微观察

一、 实验目的

1 . 了解 ABO 和 Rh 血型分类系统的背景知识和遗传学原理

2. 掌握微量采血及血涂片的制作方法

3. 学习使用光学显微镜观察和区分红细胞与各种白细胞

二、 实验材料

1. 实验材料 ：医用采血针、酒精棉球、载玻片、血推片、消毒牙签

2. 实验试剂： 瑞氏染液、抗 B 血清、抗 A 血清、生理盐水、蒸馏水

3. 仪器设备： Motic 光学显微镜

三、实验内容和方法

1 ABO 血型鉴定

1.1 取一块清洁玻片，用记号笔标上记号。

1.2 用小滴管吸 A 型标准血清（抗 B ）一滴加入左侧，用另一小滴管吸 B 型标准血清（抗 A ）一滴加入右侧

1.3 以穿刺法自左手无名指指尖取血，在玻片的每侧各放入一小滴血，用牙签搅拌，使每侧抗血清和血液混和。每边用一支牙签，切勿混用。

1.4 静置室温下 10—15min 后，观察有无凝集现象，并据此判断血型。

2 血涂片的制作及血细胞观察

2.1 取末捎血一滴置于玻片的一端 , 左手持载玻片 , 右手以边缘平滑的推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。然后便推片与载片夹角保持 30-45 度平稳地向前移动 , 载片上保留下一薄层血膜

2.2 血涂片制成后可手持玻片在空气中挥动 , 使血膜迅速干燥 , 以免血细胞皱缩 . 2.3 用蜡笔在血膜两侧划线 , 以防染液溢出 , 然后将血膜平放在染色架上 . 加瑞氏

染液 2-3 滴 , 使覆盖整个血膜 , 固定 0.5-1.0 分钟 . 滴加等量或稍多的新鲜蒸馏水 , 与染料混匀染色 5-10 分钟 .

2.4 用清水冲去染液 , 待自然干燥后或用吸水纸吸干 , 即可置血涂片于显微镜下进行镜检。

2.5 白细胞分类计数: 选择涂片的体尾交界处染色良好的区域 , 在油镜下计数 100 个红细胞 , 按其形态特征进行分类计数 , 求出各类细胞所占比值。

注：

1. 瑞氏染液 : 瑞氏染料 1g 加甲醇 (AR)600ML 。将瑞氏染料放在清洁干燥乳钵

中 , 加少量甲醇 , 充分研磨使染料溶解 . 将已完全溶解的部分倒入棕色试剂瓶中 , 未溶解部分再加少量甲醇研磨 , 直至染料完全溶解于甲醇为止 .

新配制的染料偏碱 , 须在室温和 37℃ 下一定时间待染料成熟 , 主要美蓝逐渐增多为天青 B 后才能使用 . 贮存时间越久染色效果越好 , 因此 ,Deamgilliland 等采用吸光度比值 (rA) 作为瑞氏染料的质量规格 .rA 测定方法如下 : 取瑞氏染液 15-25ul( 视染液浓度而定 ) 加甲醇 10ml 稀释 , 混匀后以甲醇为空白管分别以波长 650nm,525nm 比色 ,rA=A650/A525。因为美蓝吸收峰为波长 650nm, 伊红吸收峰波长为 525nm, 天青 B 吸收峰也为 650nm, 但吸光度 A 约为美蓝的一半 . 所以新配制染料的 RA 接近 2, 随着美蓝逐渐氧化为天青 B,RA 也相应下降 ,RA 下降达 1.3±0.1 即可使用 . 瑞氏染料在贮存过程中必须塞严 , 以防甲醇挥发和氧化为甲酸 . 有人主张配方中加入 30ml 甘油 , 防止甲酸挥发 , 并可使细胞染色清晰 . 甲醇必须纯净 , 如甲醇中丙酮含量过多 , 染色偏酸 , 使细胞着色不良 .

2.磷酸盐缓冲液 (PH6.4-6.8) ：磷酸二氢钾 0.3g 加磷酸氢二钠 0.2g 再加蒸馏水至 1000ml, 配制成磷酸盐缓冲液调整 PH, 如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替 .

3. 白细胞分类计数正常参考值 细胞类别 成人

杆状核 0.01-0.05

分叶核 0.50-0.70

嗜酸性粒细胞 0.005-0.05

嗜碱性粒细胞 0-0.01

淋巴细胞 0.20-0.40

单核细胞 0.03-0.08

四、注意事项

1) 玻片的清洗：新玻片常有游离碱质 , 因此应用清洗液或 10% 盐酸浸泡 24 小时 , 然后再彻底清洗。 用过的玻片可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸 20 分钟 , 再用热水将肥皂和血膜洗去 , 用自来水反复冲洗 , 必要时再置 95% 乙醇中浸泡 1 小时 , 然后擦干或烤干备用。使用玻片时只能手持玻片边缘 , 切勿触及玻片表面 ;, 以保持玻片清洁 , 干燥 , 中性、无油腻。

2) 细胞染色对氢离子浓度十分敏感 , 在染色过程中玻片必须化学清洁 , 配制瑞氏染液必须用优质甲醇 , 稀释染液必须用缓冲液 , 冲洗用水应近中性 , 否则各种细胞染色反应异常 , 致使细胞的识别困难 , 甚至造成错误。

3) 一张良好的血片 , 要求厚薄适宜 , 头体尾分明 , 分布均匀 , 边缘整齐 , 两侧留有空隙。血片制好后最好立即固定染色 , 以免细胞溶解和发生退行性变。

4) 血膜未干透 , 细胞尚未牢固附在玻片上 , 在染色过程中容易脱落 , 因此血膜必需充分干燥 .

5) 染色时间与染液浓度 , 室温高低 , 细胞多少有关 . 染液越淡 , 室温越低 , 细胞越多 , 所需染色时间越长或应适当增加染液量 , 因此染色时间应视具体情况而定 . 特别

是更换新染料时必须经试染 , 摸索最佳染色条件 .

6) 染液不可过少 , 以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净 .

7) 冲洗时应用流水将染液冲去 . 不能先倒掉染液 , 以免染料沉着于血片上 .

8) 染色过深可用甲醇或酒精适当脱色 , 最好不复染 , 必须复染时 , 可将染液先稀释好再复染 .

9) 染色时应注意保护血膜尾部细胞 , 不能划掉 . 因为体积较大细胞常在此处出现 .

染色结果 : 在正常情况下血膜外观为粉红色 , 在显微镜下红细胞呈肉红色；白细胞胞浆能显示各种细胞的特有色彩 , 细胞核染紫红色 , 染色质清楚 , 粗细松紧可辨。染色结果偏酸 , 则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红 , 白细胞核呈浅蓝色或不着色；染色结果偏碱 , 则所有细胞染成灰蓝色 , 颗粒深暗，嗜酸性颗粒可染成暗褐色 , 甚至紫黑色或蓝色。嗜中性颗粒偏粗 , 偏碱 ( 紫黑色 ). 血片原处呈绿色 .

五、思考题

(1) 如何区别血液的凝集和凝固？其机理有何差别？

(2) 根据你的血型，判断你能接受何种血型并且能够给何种血型供血？

(3) O 型血人又被称为“万能供血者”，试根据 ABO 血型分型作出你对这一说法的理解

(4) 试根据父母的血型，写出后代的可能血型：