肌钙蛋白I的检测方法进展

肌钙蛋白I的检测方法进展

心肌肌钙蛋白(cardiactropnin，Tn)是1987年Cummins等诊断急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)时首次报道的，肌钙蛋白(Troponin，Tn)是心肌的主要结构收缩蛋白，由三个亚单位组成：肌钙蛋白C(TnC)、肌钙蛋白T(TnT)和肌钙蛋白I(TnI), 其中TnI又分为3种亚型：快骨骼肌亚型(fTnI)、慢骨骼肌亚型(sTnI)和心肌亚型(cTnI)，个体出生9个月后，心肌中仅存cTnI,无任何亚型，其分子量24kDa，由209个氨基酸组成，有超过40%的氨基酸序列与其他亚型有异源性,且氨基端多延伸出一段32个氨基酸组成的序列,所以cTnI具有高度的心肌特异性，已被临床广泛接受，不仅成为诊断急性心肌梗死的“金标准” ，而且已成为心肌疾病病情监测、疗效观察及预后评估的最合适标志物。本文就cTnI的实验室检测方法综述如下：

1酶联免疫吸附试验法

酶联免疫吸附试验 （enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法已成为一种经典的、被广泛应用于临床的免疫测定技术。此种方法用于cTnI的检测最初是在80年代中期由Cummins等报道的，采用了多克隆抗体竞争抑制法，交叉反应无法消除，存在较大的局限性。1992年Bodor等在此基础上对ELISA法进行了改良，筛选出一对与cTnI亲和力强的单抗，采用单克隆的双抗体夹心法，使灵敏度提高到0.5μg/L。1993年Larue等在Bodor等的研究基础上，从28种纯化的单克隆抗体中筛选出一种特异性很强的抗体用于免疫分析，以辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）取代碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP)，检测限精确至0.1～0.2μg/L，检测时间30min。目前，ELISA法已成为检测cTnI较为成熟的方法。

2 化学发光法

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化学发光免疫分析系统采用了双抗体一步夹心酶免疫分析的方法，以化学发光剂3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酸氧基)苯-1,2-二氧杂环丁氨(AMPPD)为底物，以ALP作为标记物，用单克隆抗cTnI IgG抗体包被的磁性微粒为固相载体, 检测时待测抗原与包被在固相载体的抗体及ALP标记的抗体形成夹心复合物, 发光剂AMPPD在ALP催化下脱去磷酸根基团生成具有荧光活性的AMPD，测定其发光强度，通过多点定标曲线计算cTnI浓度。最具代表性的是美国Beckman Coulter 公司的Access 微粒子化学发光免疫分析系统，该系统反应快速，最低检出浓度为0.03μg/L,CV<5%,准确度可达97.8%。何农跃等对化学发光酶免疫测定cTnI分析系统进行了实验条件的优化研究，使检测限达0.02μg/L。

电化学发光免疫分析系统是以细小的顺磁性微粒为固相载体,以小分子化学发光剂吖啶酯直接标记抗原或抗体, 反应洗涤后，碱性条件下检测其发光强度，从而对cTn-I定量。Bayer 公司的 ACS-180 电化学发光免疫分析系统最具有代表性。

3 荧光分析法

3.1 Stratus 检测法

Stratus 检测法是一种自动化双位点荧光酶免疫定量检测法，第一家通过美国FDA批准的检测系统是Dade StratusⅡ检测法，后来开发的cTnI分析系统较多是以它作为测定基准。这种方法使用两种cTnI单抗隆抗体，特异性高，检测低限0.35μg/L。

3.2 ELFA法

酶联荧光分析法（ELFA法）是由法国生物梅里埃公司开发的，采用一步免疫荧光法，以荧光剂4-甲基伞形酮磷酸盐(4-MUP)为底物，以标记ALP的抗cTn-I单克隆抗体包被固

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相载体(SPR)，吸入血清样品，与包被的cTn-I抗体结合，并固定于SPR内壁形成夹心，未结合的cTnI通过洗涤被除去, 4-甲基伞形酮磷酸盐被ALP催化水解成4-甲基伞形酮, 在450nm处检测其荧光值(relative fluorescence variation，RFV), 与标准曲线比较自动计算血清cTnI浓度,检测范围0.1～50μg/L，CV<5%, 检测时间15 min。

3.3 TRFIA法

时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA法），针对cTnI上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体，一个包被固相载体，另一个用Eu3+标记，经过免疫反应形成免疫复合物后，用增强液将Eu3+从复合物上完全解离下来，与另一种螯合剂结合，检测荧光信号；荧光信号强弱与cTnI含量成正比。

4 金标免疫法

金标免疫法主要是应用到与免疫层析技术相结合的金免疫层析法（GCIA）中，用两个单克隆抗-cTnI抗体的单一结合来检测游离cTn-I和复合cTn-I。当样本滴到吸收孔内，第一个抗cTn-I抗体/胶体金与cTn-I结合形成一个抗体/抗原结合体。第二个固定化的抗cTn-I抗体捕捉这个结合体，产生一个粉红色的颜色带，相对于无结合体出现，反应圈内就没有色带。周荣斌等采用胶体金免疫层析法检测急性心肌梗死患者血中cTnI，试验cTnI特异性为98．0％，相对敏感度为97．4％，能较好的检测患者血样中的cTnI，且操捷、简便，适用于临床特别是急诊科用于AMI的辅助诊断。但该方法易受主观因素的影响，于是有研究者开发了一种利用光度计及荧光计辅助检测的方法，以避免主观因素的影响。

近年来，在免疫金技术的基础上，有研究者增加了一个对标记物进行银染色放大的过程，使得免疫金标记的结合位点可以被很容易地清晰观察到，称为免疫金银染色法(IGSS)，

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该方法使检测灵敏度进一步提高，在cTn-I的检测中具有广阔的应用前景。

5 免疫比浊法

陈海彪采用胶乳增强免疫比浊法测定cTnI，该法将cTnI 与包被有特异性抗体的致敏胶乳颗粒结合,使相邻的胶乳颗粒彼此交联,测定一定波长下溶液浊度增加的程度与标本中的cTnI含量相关。这种方法灵敏度达0.3ng/ml，特异性强，重复性好，线性范围宽，操作简便、快速，具有一定的临床应用价值。陈浩全等比较了3种cTnI试剂在自动生化仪上的分析性能，结果显示胶乳增强免疫比浊法测定cTnI具有较高的精密度和灵敏度，与化学发光免疫分析具有良好的相关性。

6 飞行质谱法

又称为表面增强激光解析离子化（SELDI）,由蛋白质芯片、飞行质谱和分析软件组成，该技术是通过测定样品离子的质荷比( M/Z) 来进行成分和结构的分析，将样品点样到芯片后，芯片特异地和血清中的测定蛋白结合，选择性清洗后，加入能量吸收剂，使芯片上保留的蛋白形成晶体，晶体经特异激光照射发生解离作用，带电分子在通过质谱电场时加速向阴极飞去。每种蛋白飞行时间不同，其在图谱上的位置也不同，蛋白质量越轻，相对所带的电荷越多，则质荷比( M/Z)越小，飞行时间越短，这些信号经高速模拟数字转化器处理，可得到蛋白质指纹图谱。魏晓真报道了飞行质谱法检测 cTnI 的临床研究,研究表明飞行质谱法灵敏度、特异性高，可快速、准确诊断出早期AMI。

7 生物传感器

最早的生物传感器可以追溯到20世纪60年代发明的酶电极，其检测原理是待测物

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质与生物分子识别元件发生生物学反应后，产生的信息被相应的物理或化学换能器变成可定量和可处理的电、声、光等信号，再经二次仪表放大并输出，便可对待测物进行定性和定量分析。Kwon YC等采用表面等离子体共振免疫传感器（surface plasmon resonance ，SPR），将针对cTnI蛋白84～94氨基酸肽段的单克隆抗体P-II-13交联修饰到金属薄膜上，利用金属薄膜的光学耦合产生的物理光学现象进行测定，灵敏度达68 ng/ L，推动了SPR技术的发展。Kong T等采用CMOS兼容“自上而下”的硅纳米线场效应管，将cTnI单克隆抗体共价固定在硅纳米的表面，研制出无标记硅纳米线生物传感器，用于血清中cTnI的检测，其动态线性响应范围0.092 ng/mL～46 ng/mL，这种方法快速、灵敏，实用性强，值得推广。Zeng等采用多孔硅Bragg反射镜的光学生物传感器，将适配子通过3-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)交联技术固定到多孔硅的表面，当cTnI和适配子结合后，多孔硅的有效折射率发生变化，通过紫外可见分光光度计检测其反射峰位的变化量来确定溶液中cTnI分子的含量。研究显示，该传感器的线性检测范围为0.05～4.00 nmol/L，最低检测限0.05 nmol/L。

随着cTnI检测方法和检测技术的不断更新，在检测过程中也暴露出一些不容忽视的问题，cTnI测定系统缺乏标准化，使测定结果缺乏可比性，给临床应用和评价带来困扰，这种情况下，各实验室应选定一个检测系统，摸索自己的实验参考范围，建立相应的数据库，在检测过程中，注重比较cTnI的变化趋势，而不是比较其绝对浓度，使cTnI更好地发挥其诊断价值。

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