实验 酶学性质研究

一、实验目的

1、了解pH、温度、金属离子对酶的活性的影响机理；

2、掌握如何选择酶催化反应的最适pH、温度和获得最适pH条件的确定、以及Km常数的测定。 二、实验原理

酶促反应速度受介质pH的影响，一种酶在几种pH介质中测其活力，可看到在某一pH时酶促效率最高，这个pH称为该酶的最适pH。pH影响酶分子的活性部位的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心的结合与底物或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。酶的最适pH不是酶的特征性常数，如缓冲液的种类与浓度，底物浓度等均可改变酶作用的最适pH。

在一定温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而加快；但当温度高到一定限度时，酶促反应速率不仅不再加快反而随着温度的升高而下降，最终，酶因高温变性失去活性，失去了催化能力。在一定条件下，每一种酶在某一温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度

在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其他条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横坐标，反应速度为纵坐标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适pH。最适温度的实验方法和pH类似。

酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应

时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。V=Vmax[S]/Km+[S]，Vmax指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。双倒数作图（将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：1／V=Km／Vmax.1／[S]+1／Vmax，可知，1/V对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/V，在纵轴上的截距为1/Vmax，横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值 三、实验器材与试剂

1、试剂：磷酸二氢钠、柠檬酸、ABTS、酸性靛蓝。 2、器材：可见分光光度计、恒温水浴锅、试管、酸度计 四、操作步骤

1、 配置缓冲溶液

按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。

管号 1 2 3 4 5 6 7 0.2mol/L磷酸氢二钠（ml） 20.55 28.5 38.55 44.10 51.50 55.75 63.15 0.1mol/L柠檬酸钠(ml) 79.45 71.5 61.45 55.90 48.50 44.25 36.85 缓冲液pH 3 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 2、酶活测定：用上述缓冲液代替测酶活的缓冲液，然后测出酶活，进行比较。 3、温度设置：在冰箱中4℃保温，室温，用恒温摇床调不同的温度,35℃,40 ℃,45℃,50℃。将反应液放置在不同的温度下静置15分钟。然后快速测定其酶活，进行比较。

4、km值测定：加入不同的比例的ABTS溶液，0.03ml，0.06，0.09，0.12ml， 0.15ml，0.18ml，0.21ml，0.24ml，测出其酶活力。

5、酶对底物酸性靛蓝的反应动力学常数测定

配置不同浓度的酸性靛蓝（610nm），20mg/l, 40 mg/l, 60 mg/l, 80 mg/l, 100 mg/l。加入相同量的酶，在pH4.5的反应液中反应，记录下不同时间的610nm的吸光值。 五、结果与分析

1、以酶活为纵坐标，以pH为横坐标，绘制下酶活性与pH的关系曲线。分析曲线并确定酶的最适pH值。

2、以酶活为纵坐标，以温度为横坐标，绘制下酶活性与温度的关系曲线。分析曲线并确定酶的最适温度。

3、不同金属离子对酶活性的影响，计算出相对活力、抑制分数、激活分数 4、以酶活力对底物浓度的倒数作图，即用1/V对1/S作图，计算出表观K m、Vmax

5、通过数据拟合求出酶对酸性靛蓝的Kapp值和反应级数。 六、注意事项

1．研究酶的活力应以酶促反应的初速度为准。

2．本实验采用的是一种定量测定方法，为获得准确实验结果，应尽量减少实验操作带来的误差。因此，在配置各种底物浓度时，应用同一母液进行稀释，以保证底物浓度的准确性。各种试剂的加样量也应准确，并严格控制酶促反应时间。