耐高温酵母的诱变筛选及生理生化特性研究

第２２卷　第１期　湖北师范学院学报（自然科学版）　Ｊｏｕｒｎａ］ｏｆ　Ｈｕｂｅｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉ￣ｒｓｈｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｖｏ【．２２　Ｎｏ．１．２００２　耐高温酵母的诱变筛选及生理生化特性研究　董昌金　（湖北师范学院生袖系，湖北黄石４３５００２）　摘要：１臣筮酵母柽不同荆重的常外或许生地理后．在４ＯＣ一６０Ｃ不同温度条件下进行恒温培养．筛选出了　一棒时４５Ｃ高温的酵母茸棒．拄与出发茸糠进行产醢、产琦和庳素分解实罩｝比较．截茸棒酯醇、朦酶覆与产　蕾锕：耐高温酵母Ｉ诗变｛祥选；生理生化特性　文献标识码：Ａ　文章编号；１００９—２７１４（２００２）０１．００６９．０３　醢代谢造往相关的酶活性较高，在４５℃高温下产醢、产琦覆分解庳素的能力最强．　美中田分娄号　ＴＱ９２　酵母菌是单细胞真核微生物．生长温度４—３０　ｃ，最适２５—３０℃，在自然界分布很广．主要生长在　偏酸性的古糖环境中。酵母菌当前已广泛应用于生物工程中，如遗传载体，发酵工业、单细胞蛋白　（ＳＣＰ）饲料生产等。利用价值低廉的废料制取ＳＣＰ，作为动物饲料的来源，可以解决人与动物对高蛋　白植物食品的竞争。西德的Ｈｏｃｃｈａｓｔ公司利用甲醇为基质生产ＳＣＰ，瑞典在淀粉废物中混合培养囊　式拟内孢霉和产朊假丝酵母（ｃａｎｄｔｄａ　ｕｔｉｌｅ．ｓ）来开发生产Ｓｙｍｂａ。但对传统酵母菌株来说．其发酵温度　低、酶活性低，易污染杂菌，浪费能源。如酿酒酵母，传统菌株的发酵温度控制在２８—３４　Ｃ＋当温度超　过３５Ｃ时，生产和发酵能力大大减弱，且为了控制由于发酵热所引起的温度上升，需要大量冷却　水　。而对于耐高温酵母菌株来说，它们具有生长速度快，生产效率高的优点，而且不易污染杂菌，节　省能源。它们所合成的酶与适温同类酵母菌株产生的酶相比，高温时具有更高的酶活性。因此对于生　产那些质量指标要求较高的发酵产物和ＳＣＰ生产，耐高温酵母具有重要的地位和广泛的应用。　１材料与方法　１．１材料　１．１．１　茵种产朊假丝酵母（来源于武汉大学生科院）　①斜面培养基“　：葡萄糖２０ｇ．蛋白胨２０ｇ，酵母膏１０ｇ．琼脂２０ｇ．水１Ｏ００ｍ［　，　１・１－２培养基ｐＨ７・２；②产酸培养基。　：葡萄糖３０ｇ，ＣａＣＯ　３ｇ，酵母膏１２ｇ，琼脂１０．８ｇ，水６００ｍｌ　；⑧分解尿素培养　基。　：蛋白胨０．Ｉｇ，ＮａＣ１０．５ｇ．　Ｈ２ＰＯ‘０．２ｇ＋酚红０．００１２ｇ，琼脂２ｇ，Ｈ２Ｏ１００ｍＩ　，ｐＨ６．８。将配好的培　养基于每支试管中加２－７ｍＬ，灭菌后．再向每管中加人０．３ｍ［　经过滤除菌的２０％尿素溶液，混合后　搁置斜面。培养基为黄色。④产酯培养基：葡萄糖０．５ｇ．１０　豆芽汁１ＯＯｍｌ　１．２方法　１・２　１　茸种扩大培养与倒平板原始菌株经接种试管斜面和５０ｍ［　锥形瓶（液体摇床培养）扩大后，　用无菌吸管吸取０．５ｍ！　于平板内涂布接种，２８℃恒温箱中培养４８ｈ。　１・２・２　紫外线谤变　将接种好的培养皿分组在遮光的接种箱中进行紫外线诱变。紫外灯１５Ｗ．照射　［收藕日期）２ＯＯｌ～Ｉ】一ｌ７　（作者苘秆］董昌盘（１９６３～）．男．讲鲜．博士生　・６９・　维普资讯 http://www.cqvip.com

距离为２０ｃｍ，诱变时问分别为Ｉｍｉｎ、１・５ｍｉｎ、２ｍｉｎ、２・５ｍｉｎ、３ｍｉｎ　１．２．３　耐高温酵母的温度梯度筛选　将诱变后于２８　Ｃ遮光恢复培养２４ｈ的存活菌株分别置于　４０℃、４５　Ｃ、５０Ｃ、５５℃、６０ｃ恒温培养箱中培养４８ｈ后，将存活的耐高温菌株分别挑选保存于斜面试　管中。　１．２．４　产酸试验将供试菌株（包括出发菌株和耐高温菌株）转接于产酸平板培养基上，分别置于　２８Ｃ、４０Ｃ、４５　Ｃ恒温培养，观察是否有透明圈出现，并比较它们产酸能力的大小ａ　１．２．５产醋试验取装有２ｏｒａｌ产酯培养基的锥形瓶，接种供试菌株后，分别置于２８　Ｃ、４０Ｃ、４５　Ｃ　愠温培养，定期观察生长情况，通过比较其产酯的快慢，从而判断其产酯能力的大小。　１．２．６尿素分解试验将供试菌株分别接种分解尿素琼脂斜面培养基上，于２８Ｃ、４０Ｃ、４５Ｃ恒温　培养，定期观察生长情况，通过比较培养基颜色由黄变红时间的长短，从而判断各菌株在不同温度条　件下分解尿素能力的大小　２结果　２．１酵母菌紫外线诱变后不同温度培养结果　表１酵母菌紫外线诱变后不同温度培养结果　２８Ｃ　一　＋　＋　一　４０Ｃ　＋　＋　＋　＋　培　养　４５Ｃ　十　温　５０Ｃ　度　５５℃　６０ｃ　注，“＋　有茁落“一　无菌落　结果表明，紫外灯为１５Ｗ，照射距离为２０ｃｍ，诱变时间为２ｍｌｎ时，诱变效果最佳，筛选到一株耐４５　ｃ　高温的酵母菌株　当温度高于５０　ｃ时，蛋白质变性，酶失活，酵母菌死亡　２．２产酸能力测试结果　表２产朊假丝酵母在产睦培养基上的产睦情况　“＋　产酸　不产酸　从上表可看出，在适温（２８℃）下，出发菌株与目的菌株的产酸能力无明显差别，但在４０　Ｃ培养温度　下，出发菌株已失去产酸能力，随着培养温度的继续上升（４５　Ｃ），耐４０Ｃ温度的菌株也失去了产酸能　力，只有耐４５℃高温的菌株仍保持旺盛的产酸能力。这说明酵母菌菌株中的酶很易因热而失去活性，　温度越高，酶的失活也越快，而耐高温酵母菌株中酶的耐热温度高于一般酵母菌。即在高温条件下比　一般酵母菌具更高的酶活力。　２．３产酯实验结果　从表３看出，２８Ｃ培养温度下，出发菌株与目的菌株的产酯时间相同，在４０Ｃ培养温度下，出发　菌株失去产酯能力，而耐４５　Ｃ菌株比耐４０Ｃ菌株产酯时间提前６小时，而在４５　Ｃ下只有耐４５　Ｃ高温　・７０・　维普资讯 http://www.cqvip.com

的目的菌株有产酯能力，而且产酯时间提前为２４小时，即随培养温度的升高，开始产酯时间缩短，该　菌株的酯酶活性增高。　表３产朊假丝酵母在产蕾培养基上培养开始产蕾时间（ｈ）　２．４尿素分解实验结果　裹４产朊假丝酵母的尿素分解实验结果　从表４可看出，在２８｜Ｃ培养温度下，出发菌株与目的菌株均可分解尿素，但在４０　Ｃ温度下出发菌　株失去了分解尿素能力，脲酶活性为零，耐４５Ｃ菌株分解尿素能力增强，表明随着温度的升高，脲酶　活性增加。随着温度继续升至４５Ｃ出发菌株与耐４０Ｃ温度的菌株脲酶活性皆为０，只有耐４５　Ｃ高温　的菌株仍保持旺盛的分解尿素的能力。　３讨论　３・１在辐射距离为２０ｃｍｌ５Ｗ的紫外灯下对假丝酵母的出发菌株进行诱变，当诱变时间为２ｍｉｎ时，　诱变效果最佳，经不同梯度培养筛选出一株耐４５　Ｃ温度的高温酵母，该菌株产酯、产酸和分解尿素的　能力增强。　３・２耐高温酵母菌株具有快速生长，高温活性及热稳定性等特点，与适温酵母菌相比高温时具有更　高的酶活性，这在发酵工业及城市废物处理等方面具有特别的重要性“：，如利用高温酵母使更多的废　物转化成ＳＣＰ，不仅可以减少环境污染，而且可为动物提供蛋白质饲料来源。　参考文献　［１］蒋亚平，蔡盘芝．扬宝玉等．微生物学通报，１９９２．１９（１６）　［２］林维兰，黄秀梨现代微生物学与实验技术．北京；科学出版社　［３］杜连祥等．工业微生物实验技术．天津：天津科学技术出版社　［４］谢新东，胨济琛等．微生物学通报，１９９６，２３（２）　Ｔｈｅ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｔａｔｈｅｒｍａｌ　Ｙｅａｓｔ　ＤＯＮＧ　Ｃｈａｎｇ—ｊｉｎ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｂｅｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｂｅｉ　Ｈｕａｎｇｓｈｉ　４３５００２）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｕ－Ｖ　ａｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｅｖｅｒｙ　ｋｉｎｄ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｅｄ　ｙｅａｓｔｓ　ａｒｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｃａＩｔａｒｅｄ　ａｔ　４ｏｃ、４５Ｃ、５０Ｃ、５５Ｃ　ａｎｄ　６０Ｃ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｔｈｅｒｍａｌ　ｙｅａｓｔｓ　ａｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｔｈｅｒｍａＩ　ｙｅａｓｔ８　ａｂｉｌｌｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｅｓｔｅｒ　ａｎｄ　ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇ　ｔｉｒｅａ　ａｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ：ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｒａｄｉａｔｉｖｅ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｉｓ　２０ｃｍ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｄｏｓｅ　ｉｓ　２ｒａｉｎｓ｛ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｓｕｒｖｉｖｅ　ａｔ　４５　Ｃ　ｈａｖｅ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ａｂｉｌｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｉ“ｇ　ｅｓｔｅｒ　ａｎｄ　ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇ　ｕｒｅａ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍａｔｅｔｈｅｒａｍｌ　ｙｅａｓｔｔｍｕｔａｔｌｏｎ；ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａ他ｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　・７】・