SSR标记在甘蔗遗传育种中的应用

SSR标记在甘蔗遗传育种中的应用

黄振瑞 潘方胤 吴文龙 彭冬永 杨俊贤

（广州甘蔗糖业研究所，广州 510316）

摘 要 SSR (Simple sequence repeat)标记是建立在PCR基础上的一种新型DNA分子标记。SSR数量丰富，信息含量高，呈共显性遗传，易于分析，所以它是进行甘蔗遗传研究的理想工具。本文就SSR标记在甘蔗遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、鉴定品种和分子标记辅助育种等方面的应用进行了综述。关键词 SSR；甘蔗遗传；应用

组中二核苷酸(AC)n多达50000个，n的大小在

0 前言

我国甘蔗野生种质资源丰富，国内利用甘蔗有性杂交育种已经取得很大进展。通过引进优良甘蔗新资源，丰富了我国甘蔗品种资源库，较大幅度提高和改善了我国甘蔗的产量和品质，为甘蔗杂交育种提供了大量亲本和优良种质。为此，在分子水平上对甘蔗种属亲缘关系、真假杂种、遗传多样性等进行鉴定和分析对甘蔗遗传育种具有深远意义。SSR(Simple sequenc repeat)标记即简单序列重复又称微卫星（Microsatellite），是近几年发展起来的基于DNA变异的分子标记，它是一类由几个核苷酸（一般为2～4个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联序列。近年来，SSR分子标记技术已在甘蔗育种方面发挥了重要作用。

10～60之间，三核苷酸、四核苷酸也广泛存在于人类基因组中。从进化的角度看，物种间重复序列的差异是自然选择和生物对环境适应的结果，生物进化的水平越高，重复序列占DNA总量的比重就越大。如噬菌体基因组中重复序列占10％，细菌为20％，酵母为30％，小麦为83％，在人的基因组中这一指数高达90％[1]。同一类微卫星DNA可分布在基因组的不同位置上。由于微卫星中的重复单位数目是高度变异的，且SSR两端的序列一般是相对保守的单拷贝序列，因而根据其两端的序列可设计一对互补序列的寡聚核苷酸引物，通过PCR扩增产生重复序列长度多态性。1.2 SSR分子标记的特点

与其他分子标记（AFLP、RAPD、RFLP等）相比，SSR标记具有以下优点：①多态性高；②具有多等位基因的特性，其PCR产物在进行测序胶电泳分离时具有单碱基高分辨率，遗传信息量大；③每个位点由设计的引物顺序决定，便于合作交流开发引物：④由于SSR多态性仅由简单序列的重复次数的差异引起，通常为共显性标记，呈孟德尔方式遗传，具有很好的稳定性，因而对个体鉴定具有特殊意义；⑤仅需微量组织，DNA用量少，即使DNA降解也能有效地分析鉴定；⑥技术要求低，易于实现自动化。

虽然SSR标记技术相对其它分子标记具有更多优点，但也有其缺陷，主要在于SSR座位突变

1 SSR标记的原理和特点

1.1 SSR分子标记的原理

对SSR的研究始于动物基因组，最早发现的是有CA/GT重复多次构成的一段DNA。研究表明，在真核生物基因组中大约每隔10～50 kb存在着由1～4个碱基对组成的简单重复序列(Simplesequenc repeat)，主要以2～3个核苷酸为重复单位，如(GA)n、(AC)n、(GAA)n等，在人类基因

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甘蔗糖业 2006年第6期 Sugarcane and Canesugar

率高，对变异反应非常敏感，所以易受到趋同变异引起的平行演化程度的影响，从而给物种间亲缘关系的评估带来误差，且SSR是必须针对每个染色体座位测定并找到SSR两端寡聚核苷酸来设计引物，较费时耗力。

油菜扩增出来的条带片段大小一致。当然并不是100％的引物都能在近缘属中进行有效扩增，因此还需要进行核心引物筛选。2.2 SSR扩增

SSR的扩增是一种特异性扩增，在进行SSR分析时，首先要制备高分子量的基因组DNA。虽然对DNA的质量要求不是特别高，但在提取基因组过程中要加入蛋白酶和RNA酶消化去除其中的蛋白质和RNA，同时严格避免不同DNA之间的交叉污染。

SSR扩增虽然重复性和稳定性相对较好，但对于不同的引物对，其G+C的含量不同和扩增片段长度不同，不同物种的DNA扩增条件存在差异，其退火温度就要做适时的调整，同时也要通过对药品体系浓度、热循环程序次数等反应参数的调整来获得清晰可靠、方便统计分析的条带。

SSR经过PCR扩增所得的产物一般在100～300 bp之间，而且基因型间的差异仅为几个bp[4]，因此一般采用如下4种方法对扩增产物进行分离和检测：①将PCR产物进行荧光标记（如FAM，TET，HEX等），然后经过高温变性，在PEApplied Biosystem 310等遗传分析仪上利用毛细管电泳分离，并通过GeneScan Geno Typer等软件进行分析。该方法灵敏度高，但操作烦琐，技术要求较高。②变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测，其灵敏度和分辨率都很高，可以检测到1个碱基的差异，但是费用高且危险；③非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测显色，此法虽然分辨率略有下降，但降低了成本和难度；④高浓度的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，一般琼脂糖浓度为3％～4％，该法最为方便经济，但对多态的检出率最低。

2 SSR的实验技术要点

2.1 SSR引物的分析方法

目前最为常用和简单的SSR标记仍然是依托于PCR技术的分子标记。完成PCR扩增的基础工作之一就是获得引物，获得引物序列有好几个途径。最常用的方法是首先建立DNA文库，提取所要研究的目标物种的基因组DNA，把基因组DNA切成均匀的小片段进行凝胶电泳，回收大小为300～500 bp的片段。把回收片段克隆放大，然后用标记探针杂交，筛选出重复序列的克隆并对其测序证实重复序列的存在。对重复序列PCR扩增(用片段两端区域设计的引物)，然后对少量样本进行预实验，挑选出重复性好，具有多态性的微卫星位点。这种方法工作量大，需要较多的资金投入，目前只在少量模式生物中得到大量开发[2]。

通过互联网也是获得引物序列的最重要途径之一。人们可以在GENBANK、EMBL、DDBJ等DNA数据库中查找简单重复序列及其两端序列，用Primer，MacVecter或Oligo等软件设计引物。这个方法使SSR的数量迅速增加。尤其对于已经测序的物种，该方法已经慢慢取代了前面提过的方法。

还有另一个来源就是前人已发表的文章，其好处在于包含了现成的引物序列和PCR反应条件，不需要再花时间进行引物设计和条件优化实验，同时这些引物也可用于近缘属种的PCR扩增。周涵韬[3]等对不同作物间共用SSR引物进行了研究，用两对甘蓝型油菜引物对来自禾本科、十字花科、芸香科、锦葵科等12种经济作物的DNA进行PCR扩增，结果显示PCR扩增产物条带清晰，所有12份材料扩增出来的条带与甘蓝型

3 SSR标记在甘蔗育种中的应用

3.1 亲缘关系和遗传多样性的研究

微卫星标记具有高度多态性且信息丰富，能够准确区分大量的等位基因，因而可以区分同一

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黄振瑞等：SSR标记在甘蔗遗传育种中的应用

物种不同基因型，甚至是亲缘关系特别近的材料。Harvey等用10聚随机引物和DNA微卫星（Microsatellite）和Telomer序列作引物，评价20份甘蔗栽培种、6个野生近缘祖先种，10聚随机引物分析的结果表明，它们之间的相似系数在61％～95％，其中栽培品种之间的相似系数在80％以上，用微卫星和Telomer序列引物分析得到的相似系数差异很大，达21％～91％[5]。Cordeiro等[6]用SSR技术将甘蔗EST位点转移到高粱上，在21对SSR引物中，共17对引物扩增有多态性。Selvi等[7]用SSR分析甘蔗基因多态性和指纹检测，从玉米基因文库里获得34对引物，平均每对引物可获得7～14条带，平均为10条，多样性低的S. officinarum基因相似系数为82％，多样性高的S. spontaneum基因相似系数为69.7％。3.2 甘蔗遗传连锁图谱构建

遗传图谱既是遗传研究的重要内容，又是作物资源、育种及分子克隆等应用研究的理论依据和基础。SSR作为重复性好的共显性标记，可以填补连锁图谱上较大的间隙，从发现起就受到人们越来越多的重视。在其他作物，如水稻、玉米、大豆及小麦等农作物遗传图谱构建得到广泛的应用，是构建遗传图谱连锁行之有效的分子标记。但利用SSR进行的甘蔗遗传连锁图谱构建及重要农艺性状基因定位的研究报道还是很少。Aitken等[8]用SSR和AFLP分析栽培甘蔗和野生甘蔗的杂交种，采用SSR方法成功地将127个连锁群分成8个同源组，这些连锁群与染色体相关，这符合2个含有不同染色体数。Garcia等将64个SSR位点定位于甘蔗的一个种内重组自交作图群体分子连锁图谱上[9]。3.3 DNA指纹和品种鉴定

SSR标记对品种鉴定是一种很有效的标记方法。随着微卫星标记数目的增多，这种技术将会在品种鉴定方面发挥更重要的作用。Silva用20个SSR引物区别8个甘蔗品种[10]。Pan等[11]设计9对SSR引物对29个甘蔗品种进行区分鉴定。

研究表明，9对引物扩增出52位点的谱带，对29个甘蔗品种鉴别准确率达76％。劳等[12]采用SSR分子标记技术对甘蔗（Badila）与斑茅杂交后代F1及其回交后代进行鉴定分析，结果表明，引物mSSIR33能鉴定大多数杂交后代的真假，也能判断是否含有斑茅血缘，是一对理想的引物，证明SSR是鉴定斑茅杂交后代真实性的有效方法。3.4 分子标记辅助育种

植物育种中分子标记辅助选择是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在。通过SSR分析，可筛选出与目标基因（性状）紧密连锁的DNA片段作为辅助育种的分子标记。利用分子标记不仅可以定位目标基因，也可以利用与目标基因紧密连锁的分子标记追踪目标基因。其结果因不受其它基因效应和环境的影响而较为可靠，同时可在低世代及苗期进行选择。在甘蔗分子辅助育种方面，少数重要性状也正在用于辅助选择，如利用SSR标记进行甘蔗抗花叶病毒的标记辅助选择[13]。SSR技术与现有的育种程序相结合，大大加快育种进程，也有望成为商业育种中尽快取得经济效益的一种技术。

4 展望

随着以DNA变异为基础的分子标记数目的增多，甘蔗基因组的研究速度和效率已得到显著提高，SSR标记技术在甘蔗上的应用也取得快速发展。由于SSR标记具有共显性、技术简单、多态性丰富等特点，使得SSR标记在分析甘蔗遗传多样性和构建品质指纹图谱与品种鉴定方面有着极高的效率。近年来，我国通过国家“948”项目引进了多份甘蔗品种，加上自育的品种，存在品种混杂的现象。构建我国甘蔗品种的SSR遗传指纹图谱迫在眉睫，这将为今后推广优良品种、调整甘蔗产业的品种种植结构、制定品种资源的保育策略以及新品种的登记注册和产权保护等奠定基础和提供科学依据。因此，SSR标记将在在诸如QTL分析、亲缘关系鉴定、遗传多样性研究及

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甘蔗糖业 2006年第6期 Sugarcane and Canesugar

杂种优势预测中表现巨大的应用价值和优势。参考文献

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SSR Markers Application in Sugarcane Gentic Breeding

Huang Zhenrui , Pan Fangyin, Wu Wenlong, Peng Dongyong, Yang Junxian

（Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute, Guangzhou, Guangdong 510316）

Abstract: SSR (simple sequence repeat) is a new type of DNA molecular markers which is base on PCR. SSR arevaluable as genetic markers because they are abundant, informative, co-dominant and easily assayed bypolymerase chain reaction (PCR). SSR is the better method to study sugarcane gentic breeding. SSR markers insuch applications as genetic diversity, construction of genetic linkage map, variety identification, and moleculemarker assistant breeding in sugarcane were summarized in the paper.

Keywords: SSR; Sugarcane genetic; Application (本篇责任编校：李金玉)

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