蔗糖13g，琼脂1.5g，玉米粉17g，水（单蒸水就可以）180 ml。 乙酸2 ml（可少一点），酵母粉至少1.4g 培养基配制步骤：
（1）称取玉米粉17g装入烧杯1（要大一些的烧杯，如500 ml），量取水90 ml。先加少量水于烧杯中，搅拌成均匀的糊状，再加入其余的水，搅拌均匀。然后一边在电炉上加热，一边搅拌。直到完全煮熟。冒泡泡以后，火小点，免得溢出来。冒泡泡以后还是要再煮好一会。要充分煮熟，要不培养基在培养过程中，果蝇没有吃完就发酵了，果蝇会死的。煮好了放在一边。
（2）称取蔗糖13g，琼脂1.5g装入烧杯2，量取水90 ml。加入大半水于烧杯中，一边加热一边搅拌。完全煮溶。
（3）把烧杯2中煮溶的蔗糖和琼脂倒入烧杯1中，用步骤2剩余的水冲一冲烧杯，也倒入烧杯1中。（如果烧杯1小，就装不到了。）然后搅匀，继续搅拌加热，直到沸腾，充分混匀。
(4) 待烧杯1稍凉。这个时候把干燥好的三角瓶摆放旁边。将至少1.4g酵母粉加入烧杯1搅匀，将培养基倒入三角瓶中（要用卖油翁的技术，这个你没问题，就是不要把培养基沾到瓶壁或周围，浪费也不好看）。（按照敬老师的说法要待烧杯1凉到80度左右，我觉得稍凉就好了。因为加入酵母粉后还搅拌，就更凉了。倒入三角瓶时，到后边就太凉了有点凝固，不好倒，还会沾到瓶壁上。）
（5）把倒好的培养基放到超净工作台上，放2天，等待瓶壁和培养基上的水分挥发。有水残留的话，果蝇放进去翅膀打湿，飞不起来，就翘翘了。（我自己的做法是配培养基的时候少加10ml的水，等待一天，没有完全干，但也可以用）由于果蝇是吃里面生长的酵母，所以培养基放上三天，有酵母生长了就可以接种果蝇了。
（6）我自己收集果蝇的方法：放一点水果在矿泉水瓶子中，至少要四五天才会有很多果蝇。这几天的时间就赶快去准备其他的东西。培养基弄好了，就把瓶子收起来，带实验室去接种。
果蝇的培养条件是20-25度，25度以上的温度不好的，不记得原因了。20度以下生长慢。 一、实验目的
通过对链孢霉杂交所产生的子囊孢子的观察，了解分离和交换现象，并进行统计，计算交换值。 二、材料及生活史
1.材料：粗糙链孢霉(Neurospore crassa )属于真菌类，子囊菌纲，球壳目，脉孢菌属，又称为红色面包霉。
2.生活史：粗糙面包霉的营养体是由单倍性(n=7)的多核菌丝组成的。生殖方式有无性生殖和有性生殖两种。无性生殖是菌丝片段或分生孢子经有丝分裂直接发育成菌丝体。有性生殖是不同接合型的菌丝产生有性孢子的过程，主要有两种方式：(1)未受精的营养体菌丝上产生灰白色的原子囊果，可以接受另一不同接合型的分生孢子，通过杂交形成合子。(2)不同接合型的菌丝靠在一起，通过核融合产生异核体。两种有性生殖方式形成的二倍性合子都可以经减数分裂形成四个
子细胞，每个子细胞又经一次有丝分裂形成8个子细胞，进一步发育形成8个子囊孢子，并以一定顺序排列在子囊中，许多子囊又被包在黑色的子囊果中。若两个亲代菌株有某一遗传性状的差异，那么经杂交所形成的子囊必定有四个子囊孢子属于一种类型，其它四个子囊孢子属于另一类型。成熟的子囊孢子在适当条件下可发育成菌丝，形成新的一代。它们的子囊孢子的性状的分离比例是严格的1：1，而且有一定的顺序。不同接合型的子囊孢子具有黑色、白色两种类型，在子囊中8个子囊孢子常呈4黑4白的排列方式，因此可在显微镜下直接观察基因的分离现象。当基因发生了互换时，8个子囊孢子又会排列成2黑2白2黑2白或排列成2黑4白2黑或2白4黑2白，因此在显微镜下也可以观察基因的连锁互换现象。
三、材料的优点
1.野生型的子囊孢子成熟较早，在一定时期呈现黑色，赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较晚，在一定时期呈现灰白色。以上两种接合型的粗糙链孢霉杂交在适当时期可以观察到六种子囊类型。
2.子囊孢子排列的顺序固定，可直接观察到基因的交换。 3.可以计算基因与着丝粒的距离。
4.如果出现A6、a2、A5、a3则表示基因转变。 五、实验步骤
1.菌种活化：为使菌种生活得更好，先要进行菌种的活化。从冰箱中取出保存的野生型和Lys缺陷型的原种，在无菌条件下分别接种在两支完全培养基试管的斜面上，28℃温箱培养5-6天左右。直至在试管中长成许多菌丝，并且在菌丝上部有许多分生孢子时表明菌种活化成功。 2.杂交：取野生型和Lys缺陷型的少许菌丝接种到同一试管的玉米琼脂培养基上，共接两支试管；或者将两种菌丝分别接种到培养皿中“桥”的两侧。在25℃恒温箱中培养2-3周，直至在菌丝上有子囊果出现，子囊果为棕黑色，用镊子或解剖针触摸时有坚实感。 3.观察：
（1）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。
（2）取一载玻片，滴1-2滴5%次氯酸钠，然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上（若附在子囊果上的分生孢子过多，可先在5%次氯酸钠中洗涤，再移到载玻片上），有另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜下（10×15倍）检查，即可见30-40个子橐果。观察子囊中子囊孢子的排列情况。用载玻片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，若用盖玻片压，盖玻片就会破碎。如发现30-40个子囊果象一串香蕉一样，可加一滴水，用解剖针把子囊拨开。此过程无需无菌操作，但要注意不能使分生孢子散出。观察过的载玻片、用过的镊子和解剖针等物都需放入5%石碳酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。 附：实验用具及培养基配方
实验用具：显微镜、接种针、载玻片、试管、三角瓶 培养基：
1.基本培养基（又称土豆培养基，供接种野生型菌株）50ml用量
A 将土豆洗净削皮，挖去发芽部分，切成黄豆粒大小的碎块，每管放5-6粒。 B 称琼脂1.2克，蔗糖1克，加水到50ml，煮沸溶解。 C 将B分装到A中，每管放3-4ml。
D 做好试管塞，用牛皮纸包好，贴好标签。8磅条件下高压灭菌30分钟。 2.补充培养基（供接种Lys缺陷型菌株) 在基本培养基中加入少许Lys ，其它同上。 3.玉米琼脂培养基（供杂交实验用）
将玉米粒在水中浸泡24小时后晾干，每试管放2-3粒，配2%的琼脂放入蒸馏水中煮沸，每试管倒3-4ml，其它方法同基本培养基。 常用染色液的配制 1.醋酸洋红染液
取45％的醋酸溶液100ml，放入锥形瓶，加入洋红0.5-1g，煮沸约5分钟或加回流煮沸12小时，冷却后进行过滤，再加入1％-2％铁明矾水溶液数滴，直到此液变为暗红色不发生沉淀为止。也可悬入一小铁钉，过一分钟取出，使染色剂中略具铁质、增进染色性能。渺茫液放入棕色瓶中盖紧贮存，并避免阳光直射。 2.苯酚品红（石炭酸）品红染液
母液A：取3g碱性品红，溶解在100ml的70％洒精（可长期保存）。 母液B：取母液A10ml，加入90ml的5％苯酚水溶液。
苯酚品红染液：取45ml的母液B，加入6ml冰醋酸和6ml 37％甲醛。
改良苯酚品红染液：取2-10ml 苯酚品红染液，加入98-90ml 的45％冰醋酸和1.8g山梨醇（注意山梨醇多了，会呈现结晶，影响制片效果）。 改良苯酚品红染液配成后可立即使用，但着色能力差，一般在配制两周后染色能力显著增加。 3.苏木精染液
将苏木精0.5g放入95％洒精10ml 中使其溶解，再加入蒸馏水90ml。此液须经1-2个月成熟。瓶口盖以纱布数层或塞一棉塞以保持通气。临用时过滤。此液可以直接应用或用蒸馏水稀释一倍后使用，可反复使用数次（每次均需过滤）。若不能预先配成，在配时可加碘酸钠使其氧化成熟。苏木精0.5g需加碘酸钠0.1g，溶解后即可使用。 4.Schiff 试剂
取碱性品红1g，放入200ml煮沸的蒸馏水中，用玻璃棒搅拌使其充分溶解。冷至50℃时过虑，加入1mol/L盐酸20ml于溶液内，冷却到20-25℃，加入偏亚硫酸钠（钾）Na2S2O3（或无水亚硫酸氢钠NaHSO3）1-2g，封闭瓶口，置于暗处12-24小时，液体应成淡黄色或无色，若颜色过深可加适量活性炭，过虑后贮于暗处。
5. Giemsa 染液
取0.5gGiemsa粉末，加33ml 纯甘油，在研钵中研细，放在56℃恒温水浴中保温90分钟，再加入33 ml甲醇，充分搅拌，用滤纸过虑，于棕色细口瓶中保存，作为原液。用时以磷酸缓冲液稀释。
人群中ＰＴＣ味盲基因频率的分析 （3学时） 一、实验目的
1. 通过对PTC味盲基因频率的分析，了解群体基因频率测算的一般方法。 2. 加深理解遗传平衡定律，了解改变群体平衡的因素。 二、实验原理
苯硫脲(PTC)是一种人工合成化合物，不同人对其溶液的苦味有不同的尝味能力。这种尝味能力是由一对等位基因(Tt)所决定的遗传性状，其中T对t为
不完全显性。正常尝味者的基因型为TT，能尝出1/750,000mol/L～ 1/6,000,000 mol/L的PTC溶液的苦味；具有Tt基因型的人尝味能力较低，只能尝出1/48,000mol/L ～ 1/380,000 mol/L的PTC溶液的苦味；而基因型为tt的人只能尝出1/24,000 mol/L以上浓度PTC溶液的苦味。个别人甚至对PTC的结晶也尝不出苦味来，这类个体在遗传上称为PTC味盲。 三、实验器具、药品
PTC溶液及其不同浓度稀释液：称取PTC结晶1.3g，加蒸馏水1000ml，置室温下1-2天即可完全溶解。其间应不断摇晃以加快溶解过程。由此配制的溶液浓度为1/750 mol/L，称为原液，也就是1号液。2-14号溶液均由上一号液按倍比稀释而制成，具体配制方法见表1。 表1 PTC溶液的配制方法、浓度和基因型 编号 配制方法 浓度mol/L 基因型 1号 2号 3号 4号 5号 6号 7号 8号 9号 1.3gPTC+蒸馏水1000ml 1号液100ml+蒸馏水100ml 2号液100ml+蒸馏水100ml 3号液100ml+蒸馏水100ml 4号液100ml+蒸馏水100ml 5号液100ml+蒸馏水100ml 6号液100ml+蒸馏水100ml 7号液100ml+蒸馏水100ml 8号液100ml+蒸馏水100ml 1/750 1/1500 1/3000 1/6000 1/12000 1/24000 1/48000 1/96000 1/192000 1/380000 tt tt tt tt tt tt Tt Tt Tt Tt TT 10号 9号液100ml+蒸馏水100ml 11号 10号液100ml+蒸馏水100ml 1/750000 12号 11号液100ml+蒸馏水100ml 1/1500000 TT 13号 12号液100ml+蒸馏水100ml 1/3000000 TT 14号 13号液100ml+蒸馏水100ml 1/6000000 TT 15号 蒸 馏 水 四、实验步骤 1. 让受试者座于椅子上，昂头张口。用滴管滴3～5滴14号液于受试者舌根部，让受试者徐徐咽下品味，然后用蒸馏水做同样的试验。
2. 询问受试者能否鉴别此两种溶液的味道。若不能鉴别或鉴别不准，则依次用13号、12号溶液重复试验，直至能明确鉴别出PTC的苦味为止。
3. 当受试者鉴别出某一号溶液时，应当用此号溶液重复尝味三次，三次结果相同时，才是可靠的。
注意：测定时，应将PTC溶液与蒸馏水反复交替给受试者，以免由于受试者的猜想及其心理作用而影响结果的准确性。
五、 作业
1. 根据一个实验班的测定结果，求出该班群体中基因T和t的频率。
2. 应用χ2检验确定该实验班这个群体是否为平衡群体。如果不是平衡群体，可
能的原因有哪些?为了降低因样本含量少而引起的误差可综合多个班的结果进行分析。
附录6. 常用染料和试剂的配制与使用
附录 6. 常用染料和试剂的配制与使用
1. 碘－硫酸法
植物细胞细胞壁的主要成分是纤维素，纤维素被硫酸水解后，遇碘呈蓝色反应。因此用
碘－硫酸法可鉴定细胞壁的成分。 试剂配制方法：
1% 碘液 将 1.5 克碘化钾溶于 100 毫升的蒸馏水中，待完全溶解后，加入 1 克碘，震 荡溶解。
66.5% 硫酸 7 份浓硫酸加入 3 份蒸馏水配制而成。配制时要将浓硫酸慢慢地加入水中，
并不断地用玻璃棒搅拌，否则会因急剧发热，而使容器炸裂。
2. 苏丹Ⅲ反应
苏丹Ⅲ可将细胞中脂肪、栓质、角质染为桔红色，因此可用此染料显示出上述物质在细
胞中的分布和位置。
配制方法：将苏丹Ⅲ （或苏丹Ⅳ）染料 0.1 克，溶于 10 毫升 95% 酒精中，然后加入 10 毫升甘油。
3. 间苯三酚反应法
间苯三酚反应是植物显微化学中确定木质化细胞壁的最常用和最简单的方法。这一反应
的原理是当间苯三酚在酸性环境下与细胞壁中的木质素相遇时，发生樱桃红色或紫红色反
应。其方法是将要鉴定的切片先用一滴 1mol/L 盐酸浸透（间苯三酚要在酸性环境下才能与 木质素起作用），然后滴一滴 5-10% 间苯三酚的 85% 酒精溶液，木质化的细胞壁即发生颜色 反应。
4．碘液测试淀粉法
淀粉遇碘呈蓝色反应，它是鉴定淀粉的最常用方法。
碘液配制方法：将 2 克碘化钾放入 5 毫升蒸馏水中，加热使其完全溶解；然后加入 1
克碘，完全溶解后用蒸馏水稀释至 300 毫升，放入具有毛玻璃塞的棕色玻璃瓶
中，置于暗处 保存。
测定淀粉时，可将上述溶液稀释 2-10 倍，使染色不致过深，效果更好。 5. 压片法常用的染料
(1) 醋酸洋红 为压片法中最常用的染料。
配制方法是：先将 100 毫升 45% 醋酸水溶液放于烧瓶中煮沸，移去火焰，停止加热。
然后缓慢加入 1 克洋红粉末，全部加入后再煮沸 1-2 分钟。此时可将一枚生锈铁钉用棉线悬
入溶液中约 1 分钟后取出（铁为媒染剂）。静置 12 小时后经过过滤，放入磨口玻璃塞棕色瓶 中保存备用。
(2) 石炭酸---品红 为近年创用的一种优良核染色剂，将细胞核和染色体染为红紫色，
细胞质一般不着色，背景清晰。 其配制方法有二： 配方Ⅰ：
原液 A：取 3 克碱性品红溶于 100 毫升的 70％酒精中（此液体可长期保存）。
原液 B：取 10 毫升原液 A，加入 90 毫升 5% 的石炭酸(酚)水溶液中(可保存两周)。
染色液：取 55 毫升原液 B 加 6 毫升冰醋酸和 6 毫升 37% 甲醛。 此染色液因含有较多的甲醛，可使原生质体硬化，而能保持其固有的形态。但也因此不 易使组织软化，因而不太适用于植物组织的染色体压片染色（本染色液适于植物原生质体培 养中使用）。在此基础上加以改进的配方Ⅱ，则可普遍地用于一般植物组织的染色体压片的 染色。
配方Ⅱ：
取配方Ⅰ中的染色液 20 毫或加 80 毫升 45% 醋酸和 1.8 克山梨醇。 染色液配制后为淡品红色，如立即使用染色较浅。放置 2 周后，染色能力显著增强，而
且放置时间越久，染色效果越好。
6．铬酸－硝酸离析法
为了观察一个细胞完整的立体形态结构，可以用一些化学药品把细壁中的中层物质（果
胶质）溶解，使细胞分离散开，便于观察。
离析前先把材料洗净，用刀切成 1-2 毫米宽的狭条（如叶片）或切成火柴棍粗细的长约
1 厘米的小条(如根或茎)。然后把切好的材料放进小玻璃瓶中，加入离析液（加入量约为材 料的 20 倍），塞紧瓶塞，放于 30-40℃ 温箱中。浸渍时间因材料性质而异，叶
片和幼嫩的
根茎组织 3-4 小时即可，而有些次生结构（如木质部）则需要更长的时间。离析情况应随时
检查，检查的方法是取少许离析材料，放在载玻片上，加一滴水，盖上盖玻片，然后用解剖
针尖端轻轻敲打，如果材料分离则表明浸渍时间已够。浸渍时间超过一天以上时，应更换离
析液一次。离析时间已够的材料，用水洗净后放入 70% 酒精中保存。 离析液配方：
10% 铬酸 1 份 10%硝酸 1 份
两种溶液应在使用时才混合，混合均匀后再使用。 实验一
1、 洋葱根尖有丝分裂染色体标本制备及观察；2、植物多倍体人工诱导（３学时）
一、教学基本要求： 1. 掌握植物染色体压片法。 2. 掌握有丝分裂各时期的特征。
3. 掌握用秋水仙素诱发多倍体的一般方法 二、教学内容：
1、 洋葱根尖有丝分裂染色体标本制备及观察 〖目的和要求〗
本次实验通过对植物根尖的制片和观察, 要求学生初步学会对植物组织、细胞的固定、离析和压片方法，了解有丝分裂的全过程及其染色体的动态变化情况,掌握有丝分裂各时期的特征。 〖实验原理〗
有丝分裂是细胞均等增殖的过程, 是体细胞分裂的主要方式.在有丝分裂过程中.细胞内每条染色体都能复制一份, 然后分配到子细胞中,因此两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目,形态和性质上均是相同的，在各种生长旺盛的植物组织
中均存在着有丝分裂。
分生组织→固定→解离→染色→压片→观察（间期、早期、中期、后期、末期） 〖材料和方法〗 洋葱或大蒜或种子根尖 水浴锅、显微镜
卡诺氏固定液、石炭酸品红（或醋酸洋红）染色液，1N盐酸（或0.5%果胶酶+纤维素酶）,秋水仙素（0.1%） 1、取材：大蒜、洋葱根尖，恒温箱
2、预处理：药物处理（秋水仙素）或冷冻处理（冰箱） 3、固定：卡诺氏固定液
4、解离： 恒温水浴锅，1N盐酸或0?5％的果胶酶和纤维素酶
5、染色及压片：染色液（改良苯酚品红或醋酸洋红），载玻片、盖玻片 6、染色体观察：显微镜
7、永久封片（示范）：二甲苯、中性树胶 〖步骤〗
1、 取材：培养→（预处理）→切取（在分裂高峰期） 2、 固定：卡诺氏固定液12-24小时→70%的酒精中保存 3、 解离：水洗→盐酸60℃ 8-10’解离→水洗
4、 染色：切取分生区→吸水→染色液一滴，15分钟→分割 压片，镜检 〖作 业〗
1、绘出所观察到的有丝分裂图象，并注明时期。 2、预处理与未预处理的分裂相有何不同为什么？ 2、植物多倍体人工诱导 〖目的和要求〗
通过这一实验，要求进一步了解人工诱导多倍体的原理，并初步掌握用秋水仙素诱发多倍体的一般方法 。
〖实验原理〗
植物多倍体是指每个细胞内染色体组有三套以上的植物。人工诱发多倍体的方法有很多，本实验利用秋水仙素抑制纺缍丝的形成，使得染色体复制后不能向两极移动，同时细胞也不分裂，从而形成多倍体的原理，用适当浓度的秋水仙素处理洋葱或大蒜根尖，待根尖膨大后制片观察，可发现多倍体细胞。 〖材料和方法〗
1、材料：大蒜或洋葱根尖，玉米种子，植物幼苗。 2、仪器和药品：显微镜，秋水仙素。
3、基本方法：①大蒜或洋葱根尖的处理，玉米种子的处理，植物幼苗的处理。②按照植物有丝分裂实验进行染色体制片观察。 〖作 业〗
绘制四倍体细胞染色体在有丝分裂中其的图像，比较与二倍体细胞的异同。 实验二 果蝇唾腺染色体制片技术（３学时） 一、教学基本要求：
1、 学习果蝇幼虫唾腺染色体的制片方法。 2、 了解果蝇唾腺染色体的形态学及遗传学特征 二、教学内容： 〖目的和要求〗
要求学生掌握果蝇等幼虫唾腺剥取的技术和制作唾腺染色体标本的方法，观察掌握多线染色体的特征. 〖实验原理〗
果蝇唾腺染色体是处于体细胞同源染色体的配对状态，由于多次复制而不分开，因而形成具有1000-4000根染色体丝的巨大染色体,又称为多线染色体.，本实验利用剖离果蝇三龄幼虫的唾腺,，压制染色体玻片标本的方法，观察多线染色体的特征。 〖材料和方法〗
1、实验材料：大果蝇三龄幼虫
2、实验方法：用解剖针、双筒解剖镜剥取果蝇唾腺，醋酸洋红染色，染色10分钟后压片观察，制作玻片标本。
〖作 业〗绘制所观察到的唾腺染色体图，制作唾腺染色体永久玻片标本。
实验三 小鼠骨髓细胞染色体标本制作（4学时） 一、教学基本要求：
掌握小鼠骨髓细胞染色体标本的制作方法。 二、教学内容： 〖目的和要求〗
通过这一实验，要求学生了解哺乳动物染色体标本的制作方法，并对动物染色体进行观察。 〖实验原理〗
由于小鼠四肢骨内骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。 〖材料和方法〗 1、材料：小白鼠。
2、设备：天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。
3、药品：秋水仙素，姬姆萨染液，固定液，低渗液，生理盐水。 〖步骤〗
秋水仙素处理——取骨髓——低渗处理——固定——离心——再固定——再离心——滴片——染色——镜检——封片。 〖作业〗
选择染色体清晰，分散度好的细胞显微摄影，待做核型分析。 绘出所观察到的有丝分裂图像。
一、实验目的和要求 通过这一实验，要求学生了解哺乳动物染色体标本的制作方法，并对动物染色体进行观察。 二、实验原理
由于小鼠四肢骨内骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。 三、实验用品 1．材料：小白鼠
2．器具：注射器（1ml,5ml）、5号针头、解剖盘、解剖剪、镊子、玻璃吸管、10ml刻度的离心管、离心机、载玻片、盖玻片、显微镜、滤纸、擦镜纸、棉花、量筒、天平、恒温水浴锅
3．药品：0.01%秋水仙素、0.075MKCl、固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液、0.01M磷酸缓冲液(PH6.8)，0.85%生理盐水。 四、实验步骤
1．预处理：实验前2.5-3小时，按每克体重注射0.02ml，给小白鼠腹腔注射秋水仙素。
2．断颈处死动物，解剖小鼠内生殖器官，鉴别雌雄性别。 3．剥取股骨，剔去肌肉组织，剪去两端的股骨头
4．冲洗骨髓：吸取0.6ml生理盐水,注射器针头插入股骨一端,反复冲洗骨髓到8ml的离心管中.
5．低渗：加入4.4ml0.075MKCl溶液,37oC水浴低渗40分钟，中间（约20分钟）用吸管吹打一次，使细胞分散，悬浮于溶液中。
6．离心：1000rpm离心10分钟后弃去上清液，离心之前加1ml固定液并用吸管轻轻吹匀，进行预固定。
7．固定I：沿管壁慢慢加入固定液5ml，用吸管吹打成细胞悬液后，室温下静置30分钟，15分钟时吹打一次。
8．离心：1000rpm离心10分钟，弃上清液。 9．固定II：同固定I。
10．离心：同8离心后加0.3-0.5ml固定液，吸管吹打成细胞悬液。
11．滴片：用吸管吸取细胞悬液，滴在预冷的载玻片上，在酒精灯火焰上微微加热，室温晾干
12．染色：10% Giemsa染液染色30分钟； 镜检：低倍———高倍 。 五、注意事项
低渗与离心等步骤的操作要轻。 观察细胞的标准为：
1．细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上。 2．染色体形态和分布良好。
3．最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错。
4．所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。
在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响计数。 六、作业和思考 选择染色体清晰，分散度好的中期分裂相，计数染色体，显微摄影，打印出照片。
实验四 链孢霉四分子分析（３学时） 一、教学基本要求：
1、 了解粗糙脉孢菌的生活周期及特性。 2、 学习顺序四分子的遗传学分析方法 二、教学内容： 〖目的和要求〗
要求学生加深了解顺序四分子分析的原理和方法，增加链孢霉杂交的感性认识，并能进行有关基因的着丝粒距离的计算和作图。从而正确认识和验证分离和交换定律，并了解基因转变现象。
〖实验原理〗
1、原理：
基因分离 ——第二次减数分裂分离。
1交换型子囊数8重组型配子数2100%重组值100%总的子囊数8总的配子数交换型子囊数50%总的子囊数95101650%7.3%274
〖实验目的〗
通过对粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型和野生型杂交所得后代的表现型的分析，了解顺序排列的四分体的遗传学分析方法，进行有关基因的着丝粒距离的计算和作图。 〖实验材料〗
1．粗糙链孢霉野生型菌株，Lys+,接合型。 2．粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，Lys-，接合型a。 〖实验器具和药品〗
1．器具：显微镜，钟表镊，解剖针，接种针，载波片，试管，培养皿。 2．培养基
（1）基本培养基（野生型可生长，缺陷型不能生长）：50倍浓度的贮存液 柠檬酸钠2H2ONa3C6H5O72H2O 125克 KH2PO4 250克 NH4NO3 100克 MgSO47H2O 10克 CaCl22H2O 5克 生物素溶液（5毫克/100毫升） 5毫升 微量元素溶液
柠檬酸2H2OZnSO47H2OFeNH42SO426H2OCuSO45H2OMnSO4H2OH3BO3Na2MoO42H2O 蒸馏水500克5.00克1.00克0.25克5毫升0.05克0.05克0.05克100毫升
氯仿 1毫升
蒸馏水 1000毫升 氯仿（防腐） 2-3毫升
用前稀释贮存液，再加1.5%的蔗糖，PH5.8。如加2%琼脂，即成基本固体培养基。 （2）补充培养基：在基本培养基上补加一种或多种生长物质，如氨基酸、核酸碱基、维生素等。氨基酸用量一般是100毫升基本培养基中加5-10毫克。 本实验所用的补充培养基只要在基本培养基中加适量的赖氨酸，赖氨酸缺陷型菌株就能生长。 （3）完全培养基
基本培养基理论 1000毫升 酵母膏 5克 麦芽汁（亦可不加） 5克 酶解酪素 1克 维生素混合液
硫胺素核黄素吡哆醇泛酸钙对氨基苯甲酸菸酰胺胆碱肌醇叶酸 蒸馏水10毫克5毫克5毫克50毫克5毫克10毫升5毫克100毫克100毫克1毫克1000毫克
蔗糖 20克 （为获得大量分生孢子，可用1%的甘油代替蔗糖。） 如加2%琼脂，即为完全固体培养基。
（4）麦芽汁培养基：可以代替完全培养基，配方简单。8波美麦芽汁2份，蒸馏水1份，再加2%琼脂。
（5）马铃薯培养基：也可以代替完全培养基。将马铃薯洗净去皮，切碎，取200克，加水1000毫升，煮熟，然后用纱布过滤，弃去残渣，滤下的汁加2%琼脂，20克蔗糖，煮融，分装到试管中。也可将马铃薯切成黄豆大小的碎块，每支试管放3-4粒，再加入融化好的琼脂、蔗糖。
上述培养基都需分装到试管后，在8镑压力下消毒30分钟，取出斜摆，成为斜面备用。
（6）杂交培养基：
KH2PO4MgSO47H2OKNO3NaClCaCl22H2O1.0克0.5克1.0克0.1克0.13克
生物素 20微克（或5毫克/100毫升溶液0.4毫升） 微量元素溶液 1毫升
（成分同基本培养基中微量元素液配成4倍浓度的溶液稀释使用） 蒸馏水 1000毫升 蔗糖 20克 PH6.5
加2%琼脂即成固体培养基。 （7）杂交培养基：
将玉米在水中浸软，破碎，每试管放2-3粒，加入少量琼脂(0.1克左右)，再放入一小片经多次折叠的滤纸（长约3-4厘米），加上棉塞，消毒即成，不需摆斜面。
3．药品：5%次氯酸钠（NaClO），5%石碳酸。 〖实验步骤〗
1．菌种活化：为使菌种生长得更好，先要进行菌种活化。把野生型和赖氨酸缺陷型菌种从冰箱中取出，分别接在两支完全培养基试斜面上，28℃温箱培养5天左右。培养到菌丝的上部有分生孢子产生。 2．杂交：接种亲本菌株，可采用下述方法。
（1）同时在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝，25℃温箱进行混合培养。注意要贴上标签，写明亲本菌株及杂交日期。在杂交后5-7天就能看到许多棕色的原子囊果出现，以后原子囊果变大变黑成子囊果，在7-14天左右，就可在显微镜下观察。
（2）在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25℃培养5-7天后即有原子囊果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬浊于无菌水中（近于白色的悬浊液），将此悬浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面基本湿润即可（每支试管约加0.5毫升），继续在25℃培养。原子囊果在加进分生孢子1天后即可开始增大变黑成子囊果，7天后即成熟。 3．显微镜观察：
（1）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。
（2）取一载玻片，滴1-2滴5%次氯酸钠，然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上（若附在子囊果上的分生孢子过多，可先在5%次氯酸钠中洗涤，再移到载玻片上），用另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜下（10×15倍）检查，即可见到30-40个子囊。观察子囊中子囊孢子的排列情况。这里用载玻片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，用盖玻片压，盖玻片会破碎。也可在显微镜下用镊子把子囊果轻轻夹破，挤出子囊。如发现30-40个子囊象一串香蔗一样，可加一滴水，用解剖针把子囊拨开。此过程无需无菌操作，但要注意不能使分生孢子散出。观察过的载玻片、用过的镊子和解剖针等物都需放入50%的石碳酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。 操作步骤见图10-5。 4．实验步骤说明
（1）实验所用的赖氨酸缺陷型，有时接种在完全培养基上，也长不好，需要加适量赖氨酸。
（2）杂交后培养温度要控制在25℃；30℃以上即抑制原子囊果的形成。 〖实验结果〗
1．观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，计算Lys基因的着丝粒距离。
子 囊 类 型 ++++---- ----++++ ++--++-- --++--++ ++----++ --++++-- 合计 观 察 数 2．绘一显微镜下观察到的杂交子囊的图。
3．说明粗糙链孢霉中基因分离现象和高等动物、高等植物中基因分离的主要区别。
4．用图表示第六种子囊类型的形成。 5．实验结果说明：
（1）赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较迟，当野生型的子囊孢子已成熟而呈黑色时，赖氨酸缺陷型的子囊孢子还呈灰色，因而我们能在显微镜下直接观察不同的子囊类型。但是如果观察时间选择不当，就不能看到好的结果。过早，所有的子囊孢子都未成熟，全为灰色；过迟，赖氨酸缺陷型的子囊孢子也成熟了，全为黑色，就不能分清各种子囊类型。所以在子囊果形成期间，要预先观察子囊孢子的成熟情况，选择适当时间进行显微镜观察。
（2）有时观察到的子囊孢子的排列为++++++--，++------，+++++---，---+++++，即为6∶2或2∶6的分离比和5∶3或3∶5的分离比。排除上面第（10点说明
的原因外，这样的情况的出现是由于基因转变造成的。基因转变的频率因基因位点不同而异，但一般在1%左右。
（3）本实验用的赖氨酸缺陷型菌株为Lys5，Lys5基因座位于第六连锁群，着丝粒距离约为14.8图距单位。可供实验结果计算时参考。
实验五 人群中ＰＴＣ味盲基因频率的分析（３学时） 一、教学基本要求：
1、 学习和掌握群体中基因频率的分析方法。 2、 了解人类中的部分遗传性状。 二、教学内容： 〖目的和要求〗
通过此实验，要求学生掌握人群中ＰＴＣ味盲基因频率的分析方法，加深对群体遗传学中遗传平衡定律的认识。 〖实验原理〗
ＰＴＣ即苯硫脲，是一种无毒无副作用的化合物，ＰＴＣ尝味能力是一个遗传性状，受单基因控制，在不同人群中对该物质的尝味能力不同。利用这一原理，将ＰＴＣ配制成各种浓度的溶液，由低浓度到高浓度逐步测试学生的尝味能力，由此可区分出味盲（隐性纯合体）、高度敏感（显性纯合体）和介于二者之间的人（杂合体）。据此可对人群中味盲基因的频率进行分析。 〖材料和方法〗
1、配制苯硫脲溶液，对半稀释成14种浓度。
2、每人按浓度由低到高依次尝味，记录自己的基因型。
3、归纳全班同学的尝味结果，估计计算群体的基因频率，进一步估算群体的基因型频率，并做χ2检验
〖作 业〗
归纳全班同学的尝味结果，估计计算群体的基因频率，进一步估算群体的基因型频率，并做χ2检验，检验群体是否处于平衡状态。
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