总RNA提取的原理、步骤、逆转录cDNA及注意事项
1.原理及方法（异硫氰酸胍-酚-氯仿 一步法）
TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。
2.主要步骤
(1)细胞或组织，加入0.4ml RNAiso Reagent 后匀浆 (2)室温静置5分钟
(3)加入1/5 RNAiso Reagent 体积量的氯仿，剧烈震荡混匀 (4)室温静置5分钟，12000g 4℃离心l5分钟
(5)将上清液转移至新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀 (6)室温静置10分钟，12000g 4℃离心l0分钟，弃上清 (7)向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，12000g 4℃离心5分钟 (8) 弃上清保留沉淀，干燥 (9)溶解于11μl的DEPC处理水中
注意：以上操作应在生物安全柜内完成，以防止污染。
1.细胞或组织约60mg,加入TRNzol 1.5ml.匀浆。（匀浆器用75%Ethonol 泡五分钟，每匀一管样用75%酒精，DEPC水洗涤匀浆器）。
2. 10000rpm, 4℃,离心l0分钟，取上清(注意别吸入上层脂肪)。将1000ml上清转移到tube
3.加200 ml 氯仿，vertex 30s,ice cool 3min.
4. 10000rpm, 4℃,离心l5分钟,样品会分为三层：黄色有机相（DNA+PRO）,中间（苯酚），上层水相,RNA就在水相中，转移约550微升到新TUBE里。 5.加入等体积的异丙醇，混匀，4℃放40分钟。
6. 10000rpm, 4℃,离心l0分钟，弃上清，离心前RNA沉淀通常看不见。 7. 向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，吹打若干次。
8. 10000rpm, 4℃,离心5分钟，倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的液体用枪头吸出。 9.室温放置晾干，3min,加入100微升的DEPC水，反复吹打混匀，充分溶解RNA. 10.测OD值。
11.制1%胶60ml，90V电压，15min，上样10微升（约200ngRNA）不用MARKER.
注意：经常更换手套。配制溶液的水都是无RNase的水，即DEPC水。所有工具都是RNA-special.
3.RNA逆转录成cDNA
具体操作按照MBI Fermentas的RevertAidTM First Strand cDNA Synthsis Kit＃K1622。如果cDNA当天不使用，则要保存在-20℃或-70℃。
RNA逆转录成cDNA操作流程简图如下：（在冰盒上操作）
1.提取的RNA溶解于11 μl DEPC-treated water， 加入1 μl oligo(dT)18 primer(0.5 ug/ul)轻微震荡后离心3-5sec 在PCR扩增仪上70℃ 5分钟。
2.冰上冷却，并短暂离心，向反应体系中加入5×reaction buffer 4μl，RibolockTM Ribonuclease inhibitor (20 u/μl) 1μl，10 mM dNTP mix 2μl。 3.轻微震荡后离心3-5sec，在PCR扩增仪上37℃ 5分钟。
4.向反应体系中加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ul) 1μl，在PCR扩增仪上42℃ 60分钟，70℃ 10分钟。 5.收集反应产物，冰上冷却
4.注意事项
①全程配戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
②使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
③在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
④用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外，所有的操作应该在15 -30°C的条件下完成，试剂亦在15 -30°C的条件下。
⑤75%乙醇(用DEPC处理过的水配制：将水加入无RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至0.01% (v/v)。放置过夜并高压灭菌。)
⑥每50—100 mg组织加1ml的TRIZOL。匀浆化时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。 ⑦单层生长的细胞 直接往直径3.5 cm的培养板中加入1ml的TRIZOL溶解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIZOL量（每10 cm2加1 ml）。当TRIZOL量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。
⑧在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在–60—–70°C保存至少一个月。RNA沉淀（RNA洗脱）溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在–5—–20°C下至少可保存一年。 5.试剂盒：
①组织裂解液：TaKaRa RNAiso Reagent（大连宝生物Takara公司） ②逆转录试剂盒：Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（MBI公司） 6.所需实验耗材：
①无菌且灭活RNA酶的枪头（200μl和20μl）
②0.01% (v/v) DEPC处理水 ③冰盒 ④EP管
⑤0.2ml的PCR反应管 ⑥氯仿 ⑦异丙醇
⑧75%乙醇（用DEPC水配制）
实时荧光定量PCR（Real time-PCR）
一.原理：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。 二.几个重要概率： ①扩增曲线
扩增曲线 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度
每个循环进行一次荧光信号的收集
②荧光阈值
前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值 ③ Ct值
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数
C(t) value
Ct值的特点：
1）相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；
2）Ct值则极具重现性
三．实时荧光定量PCR 方法 ① SYBR Green法
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光
复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
反应体系的建立及优化:
SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化
反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同 ② TaqMan探针法
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)
探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光
TaqMan探针法PCR反应的建立 1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的确定： 一般为：94 ℃，10-20S
60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ℃，45 S，
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同
四．实时荧光定量PCR法定量方法
绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线
相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）公式： 2-△Ct 一般相对定量内参基因为GAPDH 五．试剂盒：
探针法： TaqMan® Universal PCR Master Mix（ABI公司） 荧光染料法：SYBR Green Master Mix（ABI公司） 六．所需实验耗材：
①无菌且灭活RNA酶的枪头（200μl和20μl）
②PCR反应8排管 ③EP管
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