一、 蛋白提取准备：
冰浴盒、冰、小烧杯、EP管（1.5ml）、小镊子、RIPA裂解液（4℃保存，试剂盒中含PMSF，-20℃保存）、蛋白酶抑制剂（protease inhibitor tablets）、磷酸酶抑制剂（phosphatase Inhibitor cocktail 3）、15ml离心管(裂解液)、移液器、超声粉碎机、低温高速离心机、BCA蛋白定量试剂盒、96孔板、酶标仪、4×蛋白上样缓冲液（分装1ml/管，-20℃保存）、 二、 蛋白提取操作：
1. -80℃取出组织，冰上复温；由冻存管移入1.5mlEP管，并重新编号；（1、2、3、4、5、6分别为sham、3h、12h、24h、3d、7d） 2. 加裂解液;
a、裂解液配制：(10mlRIPA（4℃）+100ulPMSF（-20℃）+100ul蛋白酶抑制剂（4℃ 10×、1×）+1-2ul磷酸酶抑制剂)
注：磷酸酶抑制剂作用是保护已磷酸化蛋白，避免其降解破坏，所以加之有益无害。
b、加入EP管，1mg：10-20ul；（400ul/EP管，不要求精确）
3. 匀浆； 机械（电动匀浆机）；
超声粉碎机
附：超声粉碎机操作：a、打开电源；
√
b、确认设置；（默认）
c、蒸馏水清洗机头；（每次换样本均要清洗、避免污染、并擦干）
d、匀浆；（电源键控制机头启停，装有标本的1.5mlEP管置入小烧杯冰浴中，匀浆过程反复上下活动，充分匀浆组织）
4. 冰浴静置30分钟；（再加裂解液600ul至总量1000ul；）
5. 预开机制冷，12000rpm，4℃，离心20分钟；离心结束后，取上清至新1.5mlEP管；
附：低温高速离心机操作：a、开机；
b、设置speed、time、temp，注意ROTOR内外对应；12154（1.5ml或2mlEP管）
c、温度降至预设温度后，配平，开始； 6. BCA试剂盒蛋白定量
a．配制工作液；BCA试剂：CU试剂=50:1
（5mlBCA+100ulCU）；（标准品数量+样品数量）×200ul；充分混匀，24小时室温稳定； b．各孔加BCA工作液200ul； c、稀释标准品；（0.5mlEP管）
①90ulPBS稀释液+10ulBSA标准品（-20℃），至100ul，浓度0.5mg/ml；
②加稀释后的标准品至96微孔板标准孔中： 20、16、12、 8、 6、 4、 2、 0 ul 加PBS补足至20ul：
0、 4、 8、12、14、16、18、20 ul 实际浓度：
0.5、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.05、0mg/ml d、样品稀释；（0.5mlEP管）（尽可能让样品点落在标准线1/2后）,样品量不能少于2ul，否则误差太大。
78ul裂解液+2ul样品=40倍稀释 38ul裂解液+2ul样品=20倍稀释 加20ul样品到96孔板的样品孔中。
e、37℃孵育30分钟；（包薄膜防止水分蒸发影响检测结果） f、酶标仪A562nm测定，绘制标准曲线，计算蛋白浓度；
附：酶标仪操作：a、打开电脑主机及酶标仪主机； b、打开softmaxpro软件；
c、open drawer置入96孔板，close；
d、settings：A562nm、96孔、area，Ok； e、read；将数据直接复制至excel中；
excel中操作：a、新建excel工作表，粘贴数据；
b、标准品后插入列，输入标准品品对应浓度值，同时选中吸光度值及浓度值，插入----散点图，在任意一散点上点右键，添加趋势线，（选中公式、卡方值），卡方值常在99%以上。
c、待测样品吸光度值后插入列，将上面得到的公式插入，得到样品浓度值，均×40得实际浓度值；上样浓度预调整至2ug/ul，按每凝胶上样孔40ug/20ul×10计算，总上样量200ul，4×buffer=200ul/4=50ul，样品：4×buffer=3:1，加样量+裂解液=150ul；加样量=400u/样品浓度，裂解液=150ul-加样量；从而得出调整后加样量及裂解液量；
7、 调整加样量；按BCA蛋白测定后调整的 加样量+裂解液量+4×buffer 50ul 加入EP管；
8、 100℃水浴加热、煮沸变性5-10min(Thermo shaker)；注：煮沸变性过程中会有样品溢出现象，EP
需先分装；离心(普通离心机，说明书上
管中样品若超过1ml，
10000-14000rpm离心
2-5分钟)，取上清，50ul/管分装，-80℃保存或直接上样；
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