植物转基因抗性策略研究进展

植物转基因抗性策略研究进展

作者：叶英林

来源：《湖南农业科学》2016年第10期

摘 要：通过转基因技术使植物获得抗病性是控制植物病毒感染的一种重要技术途径。RNA干扰技术的出现为植物转基因抗性策略的研究提供了新思路。植物转基因抗性产生方法主要是通过表达不同的病毒蛋白（外壳蛋白、复制蛋白、运动蛋白及其他病毒蛋白）、RNAs（反义RNA、卫星RNA、缺陷干扰RNA、发夹RNA及人工微小RNA）、非病毒基因（核酸酶、抗病毒蛋白抑制子及植物体）、宿主来源的抗性基因（显性抗性基因和隐性抗性基因）及各种宿主防御反应因子等。介绍了以上几种抗性策略并分析了目前尚存在的问题，以期为植物转基因抗性策略研究的学者提供参考。

关键词：转基因抗病性；卫星RNA；发夹RNA；人工微小RNA

中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2016）10-0126-05

Abstract：Transgenic resistance to plant virus was an important technology for control of plant virus infection. The development of RNA interference techniques lead a new way to the research on transgenic resistance strategies in plants. The approaches used to confer resistance in plants were based on the expression of various viral proteins （capsid proteins， replicase proteins， movement proteins and other viral proteins）， RNAs （antisense RNAs， satellite RNAs， defective interfering RNAs， hairpin RNAs， and artificial microRNAs）， nonviral genes （nucleases， antiviral inhibitors， and plantibodies）， host-derived resistance genes （dominant resistance genes and recessive resistance genes） and various factors involved in host defense responses. This paper chiefly introduced the strategies used to confer resistance in plants and analyzed the problem of this area， which in order to provide the reference for the researchers.

Key words： transgenic resistance； satellite RNA； hairpin RNA； artificial microRNA 自首次报道转基因植物表达植物病毒序列并表现抗病性以来，人们尝试了各种不同类型的抗性产生方法。这些方法主要包括表达不同的病毒序列、非病毒序列、宿主来源的抗性基因及各种宿主防御反应因子等。笔者主要围绕以上各种成分或序列介导产生的抗性展开综述。 1 病毒蛋白介导的抗性策略 1.1 外壳蛋白介导的抗性

外壳蛋白（Coat protein，CP）介导的抗性方法主要通过在转基因植株表达病毒的外壳蛋白基因从而获得抗此种病毒或相关病毒的能力。1986年Abel等[1]将烟草花叶病毒（TMV）的外壳蛋白编码序列导入到烟草中，获得了具有TMV抗性的抗病毒植株。随后，科学家们先后

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将黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y属病毒（PVY）、辣椒重症花叶病毒（PepSMV）等的外壳蛋白基因导入烟草植株后，均得到了抗病毒植株。

外壳蛋白介导的抗性可能是蛋白质水平介导的干扰或RNA水平的沉默的结果，也可能同时存在蛋白质和RNA两种作用机制。此外，当接种高病毒剂量或接种病毒RNA时，外壳蛋白介导的抗性普遍存在容易被打破的共性[2-4]。 1.2 复制酶基因介导的抗性

复制酶（Replicase）介导的抗性方法主要通过表达病毒复制酶通读序列、全长序列、突变序列及缺失序列获得具有抗病毒能力的植株。1990年Golemboski等[5]将TMV的54KD复制酶基因转入烟草植株，获得了高抗TMV的转基因抗病毒植株。研究表明，复制酶基因介导的抗性策略产生的抗性不具广谱性，接种非常高剂量的病毒时表现出强抗性，接种病毒RNA时也表现出高水平的抗性[6]，但是表达缺失型复制酶蛋白编码序列表现出广谱抗性[7]。 关于复制酶基因介导的抗性机制尚无定论。多数早期的研究认为复制酶基因介导的抗性是由蛋白介导的，稍后的研究却发现存在RNA介导的过程，也许复制酶基因介导的抗性在蛋白质水平和RNA水平存在互补或替换的过程[6]。 1.3 运动蛋白介导的抗性

运动蛋白（Movement protein，MP）介导的抗性方法主要通过表达失去功能的缺失形式运动蛋白编码序列而获得具有广谱抗性的转基因植株。Lapidot等[8]将TMV缺失突变的30KD运动蛋白导入烟草中，转基因烟草不仅可以抑制TMV的侵染，同时也能抑制其他科属病毒的侵染。Kaplan等[9]将具有功能的TMV和PVX运动蛋白导入到烟草中发现会促进病毒运动或者对病毒运动无影响。许多实验结果表明，只有表达缺失或异源形式的MP才能获得抗性植株[8-10]。

1.4 其他病毒蛋白介导的抗性

Harshmi等[11]将棉花曲叶病毒（CLCuV）的复制起始蛋白（Replication initiator protein，Rep）导入棉花中获得了转基因抗性植株。Maiti等[12]在表达烟草脉斑病毒（TVMV）的NIa蛋白的转基因植株中观察到了TVMV抗性。Germundesson等[13]将马铃薯A属病毒（PVA）的P1蛋白编码序列导入本氏烟中，获得了完全抗PVA的转基因植株。Savenkov等[14]将PVA的HC-Pro导入到本氏烟中，转基因本氏烟没有表现出初始抗性，但是上层没有病毒的叶片表现出了恢复表型，同时对PVA的超级感染具有抗性。HC-Pro介导的抗性程度及有效范围在不同的实验中存在较大的差异。HC-Pro介导的抗性取决于 HC-Pro蛋白和HC-Pro基因RNA沉默过程中合成的抑制子的表达，也可能受入侵病毒产生的HC-Pro和siRNA水平影响[6]。此外，HC-Pro的转基因表达也具有加强宿主防御反应的作用，可以增加宿主对不相关病毒的的抗性[6]。

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2 病毒RNA介导的抗性策略 2.1 非编码单链RNA介导的抗性

非编码单链RNA介导的抗性应用的RNA片段主要有三类：一是病毒基因组的非编码区域，如3'和5'非翻译区域或基因间区域；二是不翻译的正反义开放阅读框；三是非编码反义RNA或与包含病毒开放阅读框序列互补的DNA序列。通常3'和5'非翻译区域与相应的病毒基因序列同是反义或正义方向表达，所以每个部分的抗性贡献很难区分开。Zaccomer等[15]将融合有CAT基因的芜菁黄花叶病毒（TYMV）的3'非翻译区域100 bp序列导入到油菜中，转基因油菜表现出延迟感病，并且这种延迟存在剂量效应。Bendahmane等[16]将番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）Rep基因的反义RNA导入烟草，转基因植株对TYLCV表现出良好的抗性。Park等[17]构建水稻条斑病毒（RSV）CP基因的反义RNA表达载体转化水稻，63%的转基因植株表现出了RSV抗性。 2.2 卫星RNA介导的抗性

卫星RNA介导的抗性主要是利用具有减毒作用的卫星RNA变异株实现，即利用卫星RNA抑制病毒的感染、复制及症状表达。卫星RNA抗性策略生物安全性较高，但含有卫星RNA的病毒种类少，且只在农作物生长的晚期表现抗性。目前，局限应用于烟草、牵牛花、辣椒、番茄等茄科类转基因植物抗病性研究中。

关于卫星RNA介导的抗性机制，仍然存在不少争议。程英豪等[18]认为卫星RNA与病毒基因组在复制过程中争夺RNA复制酶，病毒的复制受到抑制。Cillo等[19]认为病毒复制水平的下调和转基因指导下的卫星RNA沉默是卫星RNA抗性策略的分子基础。Lin等[20]认为卫星RNA介导的抗性可能与转基因的转录水平有关。 2.3 缺陷干扰RNA/DNA介导的抗性

缺陷型核酸具有病毒复制不可或缺的序列，但在某些特定区域存在一定缺失，在某些病毒复制时会大量产生，可以大大地减少病毒全长基因组的积累，干扰了病毒的正常复制，进而表现出抗病毒特性[6]。Rubio等[21]将番茄丛矮病毒（TBSV）缺陷干扰RNA转化烟草，转基因植株表现出较为广谱的番茄丛矮病毒类病毒抗性，这些病毒具有高度的序列同源性。 2.4 核酶介导的抗性

包被在病毒RNA互补序列中的核酶分子以序列特异性方式切割病毒RNA并抑制病毒在宿主组织中积累，从而使植株表现抗病性。

Kwon等[22]将靶向CMV RNA1和RNA2保守前导序列的核酶结构转化烟草，转基因植株表现出了抗病毒特性。随后，Huttner等[23]设计出了能同时靶向WMV和ZYMV多核酶序列。

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2.5 双链RNA或发夹RNA介导的抗性

双链RNA（Double-strand RNA， dsRNA）中同时具有正义或反义序列，这些序列被内含子或其他间隔序列隔开。Waterhouse等[24]认为在转基因植物中同时表达正义和反义转录物可以提高转化和再生株系中抗性株系的比例。具有茎环结构的dsRNA在类Dicer原位核酸酶的作用下形成siRNA，siRNA进入RNA沉默机制使转基因植株获得抗性[25]。dsRNA的初始产物是hpRNA，所以这种策略又叫做hpRNA抗性策略。

Smith等[26]首次运用构建PVY NIa蛋白酶编码序列的hpRNA转化烟草，转基因植株表现出抗病毒特性。近年来，hpRNA抗性策略作为转基因植物抗性策略研究热点，已在多个科属的植物证实可以产生全抗的转基因植株，特别适用于转化和再生率低的作物，同时还可减少抗性株系的创制和筛选。通过构建嵌合、融合hpRNA在同一个转化载体中表达多种病毒序列，可以实现同时抗多种病毒。 2.6 人工微小RNA介导的抗性

人工微小RNA（amiRNA）抗性策略通过植物内源miRNA与靶mRNA以完全互补匹配的方式相结合，高度特异性地指导靶mRNA的沉默而使植物获得抗性。

amiRNA抗性策略中宿主植株的抗性水平的决定因素主要有3种：一是pre-miRNA骨架序列的选择，主要影响amiRNA的表达水平和转录后的剪接；二是amiRNA与靶向序列的互补水平，它决定了是否存在对相关病毒的交互保护作用；三是靶向的病毒基因组序列，直接影响病毒的抑制。研究表明，靶向病毒的RNA沉默抑制子的编码序列比直接靶向衣壳蛋白序列或其他基因有效。

aimRNA抗性策略介导的抗性水平高、稳定性强、安全性高，而且可以有效避免脱靶效应及重组病毒的产生，但是可以被打破。Lafforgue等[27-28]认为在aimRNA表达次佳时，TuMV可以产生抗性突破变异种。Martinez等[29]认为先被其他病毒感染后，TuMV可以克服aimRNA介导的抗性。 3 非病毒介导的抗性策略 3.1 核酸酶介导的抗性

Cao等[30]将大肠杆菌dsRNase转入玉米植株中，转基因玉米植株产生部分斐济病毒属水稻黑条矮缩病毒抗性（RBSDV）的抗性。Lee等[31-32]将具有催化特性的序列非特异性核酸酶导入到烟草植株中，转基因烟草植株表现出了较为广谱的抗性，并且植株的生长没有受到明显影响。然而，Zhao等[33]将同样的核酸酶导入到大白菜中却发现只有少部分植株获得了抗性，而且抗性很不稳定。

3.2 抗病毒抑制剂蛋白介导的抗性

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植物来源的抗病毒蛋白有很多，但是仅有少部分进行了转基因抗病毒研究并且表现出了抗病毒感染的特性。这些抗病毒蛋白主要包括核糖体失活蛋白（RIP）、病毒复制抑制剂蛋白（IVR-pro）、人工锌指蛋白（AZP）、肽适配体、阳离子肽等。

Lodge等[34]将美洲商陆抗病毒蛋白转入烟草和马铃薯中，转基因植株表现出优良的抗性。后续的研究结果表明，RIP不具介导高水平及广谱抗性的前景。RIP介导的抗性机制尚不明确，Wang等[35]认为可能是RIP直接作用于病毒RNA，同时诱导宿主防御反应而产生抗性。病毒复制抑制剂蛋白（IVR-pro）转入烟草中可不同程度地抑制TMV、CMV、PVX复制，而产生抗性，但是这种抗性很不稳定。Rudolph等[36]将融合有GUS基因的肽适配体转入本氏烟中，转基因植株表现出了较为广谱的抗性。Reyes等[37]认为肽适配体与传统抗性策略结合使用可以产生更强、更广抗性。Bhagava等[38]将经过修饰改造的抗菌肽及自然抗TMV的N基因一起转入烟草，转化植株叶片坏死斑少且病毒积累剂量低。由于已经存在一个自然抗性基因，所以这种抗性策略无法推测不具自然抗性植株的整体抗性。 3.3 植物抗体介导的抗性

Boonrod等[39]将靶向TBSV复制酶的scFv转入本氏烟中，转化株不仅表现出了TBSV抗性，而且也具有CNV和TCV等病毒的抗性。植物抗体抗性策略研究使用的抗体主要有：全长抗体、重链可变区域和scFv抗体。

早期的植物抗体介导的抗性水平并不高。在后续的研究中逐渐使用靶向复制相关蛋白和病毒复制酶等非结构病毒蛋白的植物抗体，其靶向性和稳定性得到了改善，介导的抗性水平有所提高。但总体上，植物抗体介导的抗性水平比以往使用的抗性策略都要低。 4 宿主来源的抗性策略 4.1 显性抗性基因

R基因以特异性的基因对基因的方式编码识别特异性病原物效应因子的蛋白，也称无毒蛋白，是植物内源的抗病毒基因。通常按域组织结构分为核苷酸结合的富亮氨酸重复抗性蛋白和细胞外富亮氨酸重复抗性蛋白两类，其中核苷酸结合的富亮氨酸重复抗性蛋白类是最丰富的。已知的显性抗性基因有N基因、Tm22、Sw5、Rx、HRT、RRT、CMR1等。此外，非病毒R基因Prf也可介导出TMV抗性。 4.2 隐性抗性基因

隐性抗性基因是植物编码病毒侵入所必需蛋白的易感基因发生等位基因突变，导致易感基因不能帮助病原体入侵反而使宿主形成病毒抗性。目前，已被克隆的隐性抗性基因大部分都与编码真核翻译起始复合体相关。研究发现，真核翻译起始因子（elFs）是RNA病毒侵染的决定因子，尤其是eIF4E和eIF4G蛋白家族。Cavatorta等[40]分离出eIF4E cDNA并进行抗性相

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关位点同源位点突变改造后导入马铃薯中，易感马铃薯植株产生PVY抗性。Wang等[41]将特异性靶向elF（iso）4E的短hpRNA转化欧洲李植株，转基因植株高抗PPV。 4.3 防御反应因子

转录因子（Transcription factors，TFs）是调控单个基因与基因簇表达的主要调节因子。它通过与靶标反式作用元件上的启动子结合来完成调控过程。它在调节宿主对环境压力的反应的过程中起着重要作用。因而，人们多次尝试通过在植物中过度表达TFs来获得对病原微生物的抗性。

参与防御反应的转录因子主要可以分为乙烯反应因子和非乙烯类反应因子。过表达乙烯反应因子元件相关基因可以使植物获得抗性。Fischer等[42]将编码N基因介导的超敏反应过程中转录因子的NtERF5基因导入到烟草植株中进行组成型表达，转化植株表现出抗性特征。非乙烯类反应因子主要有：MYB、WRKY、NAM、bZIP家族、GTP结合蛋白、dsRNA依赖的蛋白激酶、萌发素类蛋白、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶（SAHH）等。这类因子主要通过过表达编码防御反应相关蛋白的基因使植物对病毒产生一定抗性。Guevara等[43]在烟草中过表达黄灯笼辣椒萌发素类蛋白的基因（CchGLP），转基因植株表现抗性特征。 5 结 语

转基因抗性策略研究经过30年的积累，取得了不少丰硕的成果。然而，仍然面临不少亟待解决的问题。一是许多方法并未详细拓展，深入探究，特别是抗性机制，多数处于推测争论状态，未形成普遍认同性；二是很多转基因抗病性方法尚未进行大田实验抗性效果评估或者田间试验抗性效果不理想；三是大多数抗性策略介导出的抗性并不稳定，也不具广谱性，实际运用中具有较大的局限性；四是基因漂移、产品食用安全性等问题仍待进一步考究。RNA干扰、RNA沉默等技术的广泛应用或将推动amiRNA、hpRNAd等抗性策略的进一步深化研究。此外，舆论压力和政治阻力等外在客观因素也是转基因科研工作者需要克服和解决的问题。 参考文献：

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