色谱法又称层析法 (chromatography)，是一种物理或物理化学的分离分析方法，色谱法因具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快等优点而被广泛应用于各个领域，尤其在中药成分分析中，成为多组分混合物的最重要、最有效的分离分析方法。
色谱法的创立起源于用吸附柱色谱法分离植物色素，它是利用混合物中各组分物理化学性质的差异，使各组分不同程度地分布在固定相和流动相中。由于各组分受固定相作用所产生的阻力和受流动相作用所产生的推动力不同，从而产生差速迁移而达到分离的目的。经色谱法分离后的组分可采用合适的手段逐个进行分析。迄今为止色谱法仍是植物成分分离分析的一种重要手段。
中药中含有的成分很多，有些是有效成分，如生物碱、强心苷、黄酮、皂苷等，此外还含有大量的其他成分，这些成分随药用部位、产地和采收季节的差异而变化。对于种类繁多、复杂的化学成分群的分离与分析，色谱法有着无可替代的优势。
第一节 色谱法的分类
1 色谱法的分类
迄今为止，色谱法已派生出许多分支技术，从不同的角度，有不同的分类方法，通常按固定相和流动相的物理状态、固定相的形态和操作方法、分离机理及两相极性的相对强弱进行分类。
1.1 按固定相和流动相的物理状态分类
色谱法所用的流动相有气体、液体和超临界流体。以气体为流动相的称为气相色谱(gas chromatography, GC)，以液体为流动相的称为液相色谱 (liquid chromatography, LC)，每种流动相又可以与固体或液体固定相搭配。因此，气相色谱又可分为气-固 (GSC) 和气-液色谱(GLC) 两种；液相色谱也可分为液-固色谱 (LSC) 和液-液 (LLC) 色谱两种。当流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时，称为超临界色谱 (supercritical fluid chromatography, SFC)。
1.2 按固定相的形态和操作方法分类
固定相的附着方式，可以有几种不同的几何形状，分为柱色谱和平面色谱。柱色谱是把固定相装填在圆筒形柱管中，色谱过程在色谱柱内进行。按照色谱柱的粗细可以分为常规柱色谱和毛细管柱色谱。
平面色谱是色谱过程在固定相构成的平面进行色谱。把固体固定相涂敷在玻璃或金属板上的叫做薄层色谱 (thin layer chromatography, TLC)；用高分子材料制成的薄膜作固定相的叫做薄膜色谱 (thin film chromatography, TFC)；用滤纸作固定液载体的色谱叫做纸色谱 (paper chromatography, PC)。
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1.3 按分离机理分类
把色谱分为四种类型，分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱。分配色谱是基于被分离组分在固定相和流动相中的溶解度不同而造成的分配系数的不同进行分离；吸附色谱是基于被分离组分对活性的固定相表面吸附力的不同而分离的；离子交换色谱是利用不同离子与固定相上可交换基团的交换能力不同而分离的；空间排阻色谱是以凝胶为固定相的色谱法，又称为凝胶色谱，是利用固定相孔径的不同，把被分离的组分按分子大小分开的一种分离方法。
1.4 按照两相极性的相对强弱分类
按照使用的固定相和流动相相对极性大小的不同，流动相的极性小于固定相的极性的色谱体系称正相色谱，流动相的极性大于固定相极性的色谱体系，称为反相色谱。 2 中药分析中常用的色谱分析方法
色谱法起源于植物化学成分的分离，中药绝大多数来源于药用植物，因此在中药有效成分的分析中色谱法也得到最为广泛的应用。常用方法有：薄层扫描法、气相色谱法 (GC)、高液相色谱法 (HPLC)、毛细管电泳法 (HPCE)及最新发展起来的超高效液相色谱法(UPLC)，此外，与质谱检测器相连接而独立出来的气相-质谱联用和液相-质谱联用技术也得到了很好的应用。在下面的小节中将具体介绍各方法。
第二节 薄层色谱法
薄层色谱法 (thin layer chromatography, TLC) 是将作为固定相的吸附剂均匀地涂布于平面载板上，展开剂借助毛细作用流经固定相，使组分分离并保留在固定相上的分离分析方法，其灵敏度高、专用性强，具有指纹性，能够分离和直接测定成分。是现代中药及中成药鉴别的重要方法之一。在薄层色谱中，根据斑点的位置，计算Rf值可以进行定性分析；根据斑点的峰面积(或峰高)可以进行定量分析。
薄层色谱法的优点在于：所使用的固定相是一次性的，因此样品的预处理比较简单；被分离物质的性质没有限制，应用范围广；固定相特别是流动相选择范围宽，有利于不同性质化合物的分离；在同一薄层板上可根据被分离化合物的性质选择不同显色剂或检测方法进行定性或定量分析。薄层色谱法自问世以来就受到分析工作者的广泛重视，薄层色谱法迅速兴起和发展，先后出现了高效薄层色谱法、薄层色谱扫描仪、计算机化的现代仪器化薄层色谱法，使其发展成为一般实验室必不可少的分离分析方法，在中药色谱分析中该法占有重要地位。
1 薄层色谱的固定相 1.1 硅胶
硅胶通常用SiO2·XH2O表示，具有表面活性，略带酸性，一般pH 4~5，是至今薄层色谱中使用最广泛的吸附剂，90%以上的分离工作均可采用硅胶。硅胶是具有硅氧交联结构，表
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面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基是使硅胶具有吸附力的活性基团，被分离溶质的保留所需的相互作用发生在这些活性基团上，包括氢键相互作用、偶极相互作用、静电相互作用等。被分析物质由于极性和不饱和程度不同，和硅醇基相互作用的程度也不同而得以分离。硅胶中的硅醇基以游离羟基、束缚型和活泼型羟基三种形式存在于硅胶表面，这三种存在形式吸附力大小的顺序是活泼型>游离型>束缚型。因为多数活性羟基存在于硅胶表面较小的孔穴中，因此表面孔穴较小的硅胶吸附性能较强。水能与硅胶表面羟基结合成水合硅醇基而使其失去活性。但将硅胶加热到100 C左右，水能可逆地被除去，故将此水称为―自由水‖。硅胶的活性与含水量有关，含水量高，活度级数高，吸附力弱。通过将硅胶在105~110 ℃加热活化30分钟，可使硅胶吸附力增强。
硅胶的分离效率与其粒度、孔径及表面积等几何结构有关。硅胶粒度越小，均匀性越好，分离效率越高；硅胶表面积越大，与样品之间相互作用越强，即吸附力越强。
薄层色谱常用的硅胶有：硅胶GF254，表示含有黏合剂锻石膏和荧光剂；硅胶CMC，表示含有黏合剂羧甲基纤维素钠；硅胶HF254，表示不含黏合剂，含有荧光剂等，以上均为不定形硅胶，粒度40 μm左右。 1.2 氧化铝
氧化铝是仅次于硅胶的另一种重要的表面活性的吸附剂。色谱用氧化铝是由氢氧化铝于400~500 ℃灼烧而成的，因制备方法和处理方法的差别，有碱性、中性和酸性三种，其中中性氧化铝使用最多。碱性氧化铝(pH 9~10)，适用于碱性(如生物碱)和中性化合物的分离；中性氧化铝(pH 7~7.5)，适用于分离生物碱、挥发油、萜类、甾体以及在酸、碱中不稳定的苷类、酯、内酯等化合物的分离。凡是在酸、碱性氧化铝上能分离的化合物，中性氧化铝也都能分离。因此，中性氧化铝的用途较广。酸性氧化铝(pH 4~5)适用于分离酸性物质，如酸性色素、某些氨基酸等。
与硅胶一样，氧化铝的活性和含水量密切相关。活性的强弱用活度级(I~V)表示，活性I级吸附能力最强，V级最弱。在适当温度下加热活化，除去水分可使氧化铝的吸附能力增强。
用氧化铝作吸附剂进行色谱分析时应注意的是：有些天然化合物如黄酮类、含羧基的三萜等能与氧化铝结合，在氧化铝上会发生一些如异构化、氧化、皂化、水合以及脱水形成双键等副反应，这些情况下都不能采用氧化铝作吸附剂。
薄层色谱常用的氧化铝有：氧化铝G，表示含有黏合剂锻石膏；氧化铝H，表示不含有黏合剂；氧化铝HF254，表示不含黏合剂而含有荧光物质，在254 nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。 1.3 聚酰胺
聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子物质。色谱常用的是聚己内酰胺。色谱用聚酰胺粉是白色多孔的非晶型粉末，不溶于水、甲醇、乙醇、氯仿及丙酮等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，易溶于浓硫酸、冰醋酸和甲酸。
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聚酰胺的吸附原理一般认为是通过聚酰胺分子的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附强弱取决于各类化合物与聚酰胺形成氢键缔合的能力。由于聚酰胺与这些化合物形成氢键的能力不同，吸附能力也不同，从而使各种化合物得到分离。一般来说，能形成氢键基团数目较多的物质，吸附能力较强；成键位置对吸附力也有影响，易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附也相应减弱，如邻位基团间能形成分子内氢键者吸附力减弱；分子中芳香核具有较多共轭键时，芳香化程度高的，吸附能力增强，反之减弱。
聚酰胺对中草药中的黄酮类、酚类、醌类化合物的吸附是可逆的，分离效果好，吸附容量大，特别适用于这类化合物的制备；此外，对有机酸、生物碱、萜类、甾体、苷类、糖类、氨基酸衍生物、核苷类等也有广泛应用。由于对鞣质的吸附特强，几乎不可逆，也可用于脱去鞣质处理。
聚酰胺薄膜色谱在中草药成分分离分析方面应用非常广泛，其分离效果和灵敏度远远超过聚酰胺薄层板。常用聚酰胺商品名为锦纶、尼龙-6、尼龙-66和卡普隆等。 1.4 烷基键合相－反相固定相
反相固定相是以微粒多孔硅胶为基质通过化学合成反应制备的键合相载体，各种硅胶的粒径、形状、孔径、表面积都可在制备过程中控制，然后再以硅烷化试剂与硅胶表面大量存在的硅醇基进行键合反应。一般用不同碳数的烷基氯硅烷与硅胶反应，可得C2，C6，C8，C16，C18，C22等反相键合相。常用的是十八烷基主链(C18H37)的硅胶键合相填料，一般称之为ODS (octadecane silica)硅胶。由于较长的烷基链保护了基质，ODS硅胶稳定性较好，ODS也是中药分析时采用最为广泛的反相薄层层析和柱层析的填料。 2 薄层色谱的载板
薄层载板一般要求表面平整、厚度均匀，有一定的机械强度，能经受一定的温度、对溶剂和显色剂化学惰性。常用的材料有玻璃、铝箔和聚酯箔。玻璃在自制和商品预涂板中都有广泛应用。铝箔和聚酯箔多用于商品预涂板载板，其突出优点是能够很容易根据需要裁剪成需要的大小和形状。 3 薄层色谱的粘结剂
添加粘结剂主要目的是使吸附剂颗粒之间相互附着，使薄层固定相紧密地吸附在载板上。常用的粘结剂有煅石膏（CaSO4）和羧甲基纤维素钠（CMC-Na）。
已添加煅石膏的吸附剂一般以字母―G‖表示，如硅胶G，氧化铝G等；不含粘结剂的一般以字母―H‖表示，如硅胶H。其突出优点是耐酸碱和高温，但是也有一定弊端。由于石膏在短时间凝固，涂铺动作要迅速，否则影响薄层质量，其微溶于水，当展开剂含水时，薄层易脱离载板；用石膏做粘结剂的薄层强度较差，点样、展开、显色和扫描时比较容易损坏。
羧甲基纤维素钠（CMC-Na）在实验室自制板时比较常用。其使用方便、所铺薄层强度较高，具有较好的分离性能。一般实验室用5‰左右的CMC溶液自铺板。
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4 荧光指示剂
为了方便薄层色谱图上的那些既无颜色，又无特征紫外吸收的化合物斑点的定位，常在吸附剂中添加某种荧光指示剂，以便在适当的波长的激发光照射下，产生均匀的荧光背景，化合物的斑点则以暗色清晰的显示出来。常用的有短波长紫外指示剂（254 nm 紫外光激发下发蓝荧光的物质）和常波紫外指示剂 (365 nm)。含有荧光指示剂的吸附剂常以―F‖表示，并用下标表示激发光的波长，如硅胶GF254，HF365。 5 薄层色谱的展开剂
正相薄层色谱的展开剂一般由混合溶剂组成的溶剂系统。展开剂的选择应考虑被测物质的性质、吸附剂（或固定相特性）的活性和展开剂的极性三个方面。
单一溶剂展开剂的极性顺序为：石油醚 环己烷 二硫化碳 四氯化碳 三氯乙烷 苯 甲苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 醋酸乙酯 丙酮 正丙醇 乙醇 甲醇 吡啶 酸 水。
以下列出了几种常用溶剂系统以供参考(表1)：
表1 常见TLC展开溶剂系统
正己烷-醋酸乙酯 氯仿-甲醇 氯仿-丙酮-甲醇 正己烷-醋酸乙酯-甲醇 氯仿-甲醇-水 氯仿-甲醇-水-冰乙酸 醋酸乙酯-乙醇-水 醋酸乙酯-乙醇-氨水 甲苯-醋酸乙酯-乙醇
由两种以上多种有机溶剂组成的混合展开剂中，不同的溶剂各起不同的作用。一般占比例较大的溶剂往往起到溶解待测组分和分离的作用，占比例较小的溶剂则起到调整改善被分离成分与其他成分的 Rf 值等作用，有时还需加入少量酸、碱以使某些极性物质的斑点集中，减少拖尾，提高分离度。例如：在环己烷：丙酮：二乙胺：水（10：5：2：5）的混合溶剂系统中，水的极性最强，环己烷的极性较弱，它可以降低展开剂的极性，调节Rf值；丙酮可以使整个溶剂系统互溶及降低展开剂的黏度；少量二乙胺的加入可以控制调整展开系统的pH值，使分离的斑点清晰集中，减少拖尾现象。
反相薄层色谱最常用的展开剂是不同比例的甲醇-水或乙腈-水，当展开剂水含量超过10%时，薄层容易溶胀脱落，在展开剂中加入适量NaCl或CaCl2，情况会有所改善。
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配比 6:1, 3:1 95:5，9:1 8:1.5:0.5 50:45:5
8:2(3% H2O), 7:3(5% H2O) 80:16:3:1，70:25:4:1 8:2:1 7:2.5:0.5 3:4:1
化合物极性 弱极性化合物 具有一至三个羟基 具有一至三个羟基 具有二至三个羟基 多元醇或苷类 羧酸类 多元醇或苷类 生物碱类
具有一至三个羟基
6 薄层扫描法及其仪器
薄层色谱法由于操作简便、色谱结果直观，并具有分离鉴定双重功能，已成为中药分析的常用手段，随着色谱技术的发展、色谱质量的提高、药典收载的薄层色谱法已大大增加，中国药典95年版一部采用TLCS测定含量的品种有19种比90年版增加了6倍多，特别是目前用HPLC、GC较难分析的、无挥发性、无紫外吸收的成分，TLCS能将其定性定量。
薄层扫描法根据测定方式可分为薄层吸收扫描法和荧光扫描法。薄层吸收扫描法是用一定波长的光束对薄层板进行扫描，记录其吸光度随展开距离的变化，得到薄层色谱扫描曲线。曲线上的每一个色谱峰相当于薄层上的一个斑点，色谱峰高或峰面积与组分的量之间有一定的关系，比较对照品和样品的峰高或峰面积，可得出样品中待测组分的含量。荧光扫描法是利用薄层色谱斑点(组分)发出的荧光强度或利用荧光薄层板上暗斑的荧光淬灭程度进行定量的方法，在一定的点样量下，斑点中组分的浓度与其荧光强度成线性关系。相比于吸收扫描法，荧光扫描法的灵敏度要高1~3个数量级，但应用范围较窄。
薄层扫描法根据扫描方式分为直线式扫描和锯齿式扫描。在直线式扫描过程中，照射在薄层板上的光束与薄层板作直线相对运动。光束固定，扫描板台运动，是目前最常用的扫描方式；锯齿式扫描过程中，照射在薄层板上的光束与薄层板的相对运动轨迹成锯齿形或矩形，扫描速度较慢。
1972年日本岛津公司生产的第一台CS-900双波长薄层扫描仪，该仪器不具线性化；1976年，该公司生产了CS-910双波长薄层扫描仪，该仪器具有线性化器及背景校正，但主机体积大，开关键钮太多，操作繁复，且无微机来处理数据；1977年，CS-920问世，该扫描仪亦为岛津生产，缩小了主机体积，轻便且开关较少，并有微机处理数据，但为单波长，仅具反射吸收测定方式，且无线性扫描。此后，于80年代又相继出现了CS-930双波长薄层扫描仪、CS-9000型仪器及CAM-AG薄层扫描仪II型，它们的功能与自动化程度都有了很大的提高。80年代，我国也生产了170型双波长薄层扫描仪，填补了过去国内无薄层扫描仪生产的空白。
目前双波长薄层扫描仪在国内使用得较为普遍，工作原理是:从光源发出的光，通过两个单色器分光后，成为不同波长的和2，斩光器使它们交替地照射到薄层上，经透射或反射后分别由光电倍增管接收，再输出电信号，由对数放大器变换成吸光度，记录下的信号是两波长吸光度之差（Fig.1）。通常是选择斑点中化合物的吸收峰波长作为测定波长，选择化合物吸收光谱的基线部分，即化合物无吸收的波长作为参比波长。
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Fig.1 双波长薄层扫描仪光学线路示意图 L：光源；MC：单色器；CH：斩光器 P：薄层板；PM：光电检测器
7 薄层扫描定量方法 7.1 扫描定量中的标准校正
由于薄层是由许多细小的颗粒组成的半透明物体，光照射到薄层表面，除了透射光、反射光之外，还有不规则的散射光存在，所以与光照射全透明的溶液不同，吸光度与物质浓度的关系不服从 Beer-Lambert 定律，浓度与吸光度之间的曲线呈抛物线状，在高浓度时尤其严重。根据 Kubellka-Munk 理论，吸光度测定值与物质的量之间呈曲线关系，而曲线的弯曲度与散射系数(SX)有关，散射系数与吸附剂粒度和吸附剂层的均匀程度有关系，因此扫描定量中的标准校正很重要。根据散射参数SX的值，将浓度与吸光度之间的曲线校直后即可进行定量分析。许多薄层扫描仪均有线性补偿器，根据 Kubellka-Munk 理论用电路系统将弯曲的曲线校正为直线，用校正后的线性A-KX曲线测得吸光度值(A)，并以一定的扫描方式获得色谱峰面积(即斑点吸光度的积分值)，在一定的范围内，峰面积与斑点中物质的量(或点样量)成直线关系。 7.2 薄层扫描定量分析方法
薄层扫描定量分析主要采用归一化法、内标法和外标法，其中外标法更为常用。 (1) 归一化法 将样品中所有组分含量之和作为100%，计算其中某一组分的百分含量的方法。用下式计算组分 i 的含量： m(i)%=A(i)/∑A(i)×100%
薄层色谱的归一化法方便简单，点样量对结果没有影响，所有组分包括随流动相移动的和留在原点的，都可以被测量。但是由于展开距离的限制，复杂混合物往往得不到完全分离，使归一化法应用受到限制。
(2) 内标法 向待测样品中加入适当的物质作为内标，然后进行薄层展开，再用该内标校正
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求得样品中某组分含量的方法。内标法不需要得到那些不进行定量的组分的峰面积，避免了归一化法的缺点，但是对内标物要求较高，要与样品互溶，不与组分样品反应，且能与样品组分完全分开，与待测组分斑点邻近等特点。由于薄层色谱分离距离有限，往往较难找到合适Rf值的内标物。
(3) 外标法 是比较在相同分析条件下，用标准样与相应的待测组分比较进行定量的方法，是薄层定量的常用方法。在做出标准曲线，求出待测组分的线性范围后，可采用外标一点法或外标两点法，即将对照品与待测样品在同一薄层板上展开，用对照品对照样品进行定量。
外标一点法是采用一个浓度的对照品，同时在板上分别点样斑3~4个和对照品斑点3~4个，测得各自峰面积，并求出平均值，再用下式计算样品含量。
m样/m标 = A样/A标
式中: m样、m标分别为样品及对照品量； A样、A标分别为样品及对照品的峰面积。必须注意，只有当标准曲线通过原点时，才能应用一点法进行定量。
外标两点法是用两种浓度的对照品溶液或一种浓度两种点样量与样品溶液对比定量。样品中组分的量为
m样 = a + bA样
其中 b=(m1-m2)/(A1-A2), a=m1–bA1
式中: m1、m2 分别为对照品的两个点样量(或浓度); A1、A2、A样均可采用多点积分值的平均值。
8 分析实例
例：不同广豆根炮制品中苦参碱含量比较 [仪器] CS-9000薄层扫描仪(日本岛津)。
[色谱条件] 取硅胶G加0.7% CMC-Na溶液(1:3)，用电动搅拌器搅均后，薄层自动铺板仪铺板，规格为10 cm × 20 cm，厚度为0.6 mm，晾干，105 ℃活化1小时，置干燥器中干燥备用。展开剂为氯仿-甲醇-浓氨水(46∶6∶0.2)，显色剂为改良碘化铋钾溶液。
[薄层定性] 在同一块薄层板上分别点各炮制品供试液6 μL，苦参碱对照液2 μL，展开，展距10 cm，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液。可见光下观察，可见各炮制品在相同Rf值处分别与对照品均有相同橙黄色斑点。
[扫描条件] 对上述特征斑点进行光谱扫描，结果苦参碱在510 nm波长处有最大吸收，在650 nm波长处吸收最小，故采用S＝510 nm，R＝650 nm，双波长反射锯齿扫描。
[供试品液制备] 分别精密称取广豆根生品及各炮制品2 g，分别置于50 mL具塞三角锥形瓶中，加氯仿25 mL，浓氨水0.2 mL，冷浸16 h，过滤，滤液蒸干，分别用甲醇定容于5 mL容量瓶中即得。
[对照液制备] 精密称取苦参碱对照品2.00 mg于2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。
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[样品测定] 分别精密吸取各供试液6 μL，苦参碱对照液1 μL和2 μL交叉点于同一薄层板上，以上述展开剂展开，展距10 cm，显色，测定，用外标两点法计算含量，结果结果表明，苦参碱含量大小依次为：酒炙品 ＞ 盐炙品 ＞ 生品 ＞ 姜炙品 ＞ 米泔水炙品 ＞ 酯炙品 ＞ 蜜炙品，提示广豆根不同炮制法、辅料对广豆根中苦参碱含量有一定影响。
第三节 气相色谱法
气相色谱（Gas Chromatography，GC）法是现代分离分析的重要手段，具有快速、准确、分离效能高，一次测定能获得多组分的定量信息等优点，是中药分析常用方法之一，但由于受样品挥发性的限制，现主要用于中药挥发油的分析。气相色谱主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。简单来说，待分析样品在气化室气化后被惰性气体 (即载气)带入色谱柱，柱内含有液体或固体固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸，结果在载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后，在检测器中能够得到被测组分的量或浓度成比例的响应值（相应的电信号）。将这些信号放大并记录下来的图就是色谱图，它包含了色谱的全部原始信息。
1 气相色谱的分类
GC属于柱色谱，它可分为几类。最常见的分类方法有按色谱柱分类和按固定相分类。 按色谱柱分可分为填充柱色谱法和毛细管柱色谱法。
填充柱色谱法是将固定相填充在内径约4 mm的金属或玻璃管内，它是―实心‖的，其固定相是附着在柱管内壁上的。
毛细管柱色谱法使用内径为0.1~0.5 mm的玻璃或石英管。将固定相涂敷在毛细管内壁上，管中心是空的，称为开管毛细管柱。GC初期使用的都是填充柱，1958年才出现了毛细管柱。而毛细管柱的普遍使用则是1979年出现了弹性石英柱后才开始的。毛细管柱比填充柱有更高的分离效率。这是因为毛细管柱内没有固体填料，气阻比填充柱小得多，故可采用较长的柱管和较小的柱内径，以及较高的载气流速。这样，既消除了填充柱中涡流扩散的问题，又大大减小了纵向扩散造成的谱带展宽。而采用较薄的固定液膜又在一定程度上抵消了由于载气流速增大而引起的传质阻力增大。
按固定相状态分可分为气固色谱和气液色谱。前者采用固体固定相，如多孔氧化铝或高分子小球等，主要用于分离永久气体和较低分子量的有机化合物，其分离主要是基于吸附机理。后者则为液体固定相，分离主要基于分配机理。在实际GC分析中，90 %以上的应用为气液色谱。
按分离机理分为吸附色谱法（气-固色谱）和分配色谱法（气-液色谱）。
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2 仪器的基本组成
虽然目前市场上的GC仪器型号繁多，性能各异，但总的来说，仪器的基本结构是相似的，即由下面几部分组成(Fig.2)：
2.1 气路系统 包括载气和检测器所用气体的气源 (氮气或氦气、氢气、压缩空气等的钢瓶和/或气体发生器，气流管线)以及气流控制装置(压力表、针型阀、还可能有电磁阀、电子流量计)。
2.2 进样系统 其作用是有效地将样品导入色谱柱进行分离，如自动进样器、进样阀、各种进样口(如填充柱进样口、分流/不分流进样口、冷柱上进样口、程序升温进样口)，以及顶空进样器、吹扫-捕集进样器、裂解进样器等辅助进样装置。
2.3 柱系统 包括柱加热箱、色谱柱、以及与进样口和检测器的接头。其中色谱柱本身的性能是分离成败的关键。
2.4 检测系统 用各种检测器检测色谱柱的流出物，如热导检测器(TCD)、火焰离子化检测器(FID)、氮磷检测器(NPD)、电子俘获检测器(ECD)、火焰光度检测器(FPD)、质谱检测器(MSD)、原子发射光谱检测器(ACD)等。
2.5 数据处理系统与控制系统 即对检测的原始数据进行处理，画出色谱图，并获得相应的定性定量数据。控制系统主要是检测器、进样口和柱温的控制，检测信号的控制等。现有的较高档气相色谱仪均配置色谱工作站，将各种控制功能（包括温度控制、气流控制和信号控制）和数据处理功能集于一体，通过计算机来实现。
Fig. 2 GC仪器基本结构示意图
1：气源；2：气路控制系统；3：进样系统；4：柱系统； 5：检测系统；6：控制系统；7：数据处理系统。
3 色谱柱的类型和选择
气相色谱仪的核心部分是色谱柱，它关系到样品分析的成败。因此，本节主要介绍中药分析中常用的毛细管色谱柱。
一般将毛细管柱分为三种类型:壁涂开管柱 (WCOT)、载体涂渍开管柱 (SCOT) 和多孔
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层开管柱 (PLOT)。PLOT 柱主要用于永久气体和低分子量有机化合物的分离；SCOT柱所用固定液的量大一些，相比较小，故柱容量大一些。但由于制备技术较复杂，应用不太普遍。毛细管 GC中应用最多的是 WCOT 柱，其柱材料大多用熔融石英，即所谓弹性石英柱。柱内径越小，分离效率越高，完成特定分离任务所需的柱长就越短。但细的色谱柱柱容量小，在分析过程中要注意超载的问题。当然，同样内径的色谱柱也因固定液的膜厚度不同而具有不同的柱容量。这些都是我们在选择色谱柱时应考虑的问题。
常规分析工作中选择色谱柱主要是考虑固定液的问题。WCOT柱常用的固定液有OV-1、SE-30、OV-1O1、SE-54、OV-17、OV-1701、FFAP及PEG-20M等。由于固定液改性及涂渍工艺的不同，同一固定液的色谱柱在性能上也有区别。一个常规GC实验室只要购置三种毛细管柱，就可应付85%以上的GC分析任务。这三种柱是：OV-1(SE-30)、SE-54、OV-17(OV-1701)。如果再加一根PEG-20M柱，则可应付95%的GC分析工作。文献中常见的中药分析用的毛细管柱内径为0.20~0.35mm，长度为25~35m，有PEG-20M，OV-101，OV-17，SE-30等固定液的色谱柱。 4 检测器
中药分析中常用的GC检测器有火焰离子化检测器(flame ionization detector, FID)和NPD。FID的灵敏度高，最小检测量可达ppb级，响应快、线性范围宽、定量准确，主要用分析含C、H的有机物，目前应用最多；NPD亦具高灵敏度，对N、P、S有较好的选择性，应用范围少于FID。FID、NPD对于被测物仅能通过保留时间的比较加以定性、鉴别，而对于化合物结构可提供的信息较少，而GC-MS、GC-FTIR则可弥补这方面的不足。GC-MS，既发挥了空心柱的高分辨力的特点，又结合了质谱的结构鉴定的长处，特别适合于多组分混合物中未知组分的定性和定量，关于GC-MS在第五节中专门讨论。在中药研究方面GC主要用于挥发性成分的研究，如：蒎烯、龙脑、芳樟醇、柠檬烯等，涉及所有含挥发油的中药。下面对最为普遍的FID检测器进行简要介绍。
火焰离子化检测器是利用氢/空气火焰的热能和化学能，在检测器里使被测组分产生气相电离，产生微电流而响应的检测器，又称氢火焰电离检测器。它是众多的气相电离检测器之一，是破坏性的、典型的质量型检测器。FID的突出优点是对几乎所有的有机物均有响应，特别是对烃类灵敏度高且响应与碳原子数成正比。它对H2O、CO2和CS2等无机物不敏感，对气体流速、压力和温度变化不敏感。它线性范围广，结构简单，操作方便。它的死体积几乎为零，可与毛细管柱直接相连。因此，FID无论在过去的填充柱时期，还是毛细管柱逐渐普及的今天，均得到普遍的应用。
具体检测过程：从毛细管柱后流出的气体在喷嘴处与氢气以及尾吹气混合，用点火灯丝点燃氢火焰，并通入空气助燃。极化极和收集极通过高电阻、基流补偿和50~350 V的直流电源组成检测电路，测量氢焰中产生的微电流，通过微电流放大器放大后由记录器绘成谱图(Fig.3)。
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检测电路在收集和极化极间形成一高压静电场。当仅有载气从柱后流出时，因载气（N2）本身不会被电离，只有载气中的有机杂质和流失的固定液在氢火焰中被电离成正、负离子和电子。在电场作用下，正离子移向收集极 (负极)，负离子和电子移向极化极 (正极)。形成的微电流流经输入电阻R，在其两端产生电压降Uin。它经微电流放大器放大后，从输出衰减器中取出信号，在记录器记录下即为基流，或称背景电流，在谱图上为基线。只要载气流速、柱温等条件不变，该基流亦不变。如载气纯度高，流速小，柱温低或固定相耐热性好，基流就低，反之就高。通常，通过调节R，加上一个反向的补偿电压，使流经输入电阻的基流降至零，此即所谓 ―基流补偿‖。一般在迸样前均要用基流补偿，将记录器上的基线调至零。进样后，载气和分离后的组分一起从柱后流出，氢火焰中增加了组分被电离后产生的正、负离子和电子，从而使电路中收集的微电流显著增大，此即该组分的信号。读信号大小与单位时间进入火焰中物质的碳原子数成正比，即―等碳响应‖。 5 定量校正因子
气相色谱定量分析具有快速、灵敏、简便、定量准确度高、精密度好的特点。色谱定量分析的依据是被测组分量与检测器的响应信号(峰面积或峰高)成正比。但是同一种物质在不同类型检测器上往往有不同的响应灵敏度；同样，不同物质在同一检测器上的响应灵敏度也往往不同，即相同量的不同物质产生不同值的峰面积或峰高。这样，各组分峰面积或峰高的相对百分数并不等于样品中各组分的百分含量。因此引入定量校正因子，校正后的峰面积或峰高可以定量地代表物质的量。在用内标法定量时需要测定校正因子。
Fig.3 FID 系统示意图
1：毛细管柱；2：喷嘴；3：氢气入口；4：尾吹气入口；5：点火灯丝； 6：空气入口；7：极化极；8：收集极。
定量校正因子分为绝对定量校正因子和相对定量校正因子。在实验条件恒定时峰面积与
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组分量的关系为Wi=f'iA, f'i=Wi/Ai。
f'i称为绝对定量校正因子，即单位峰面积所代表的物质量。绝对定量校正因子的值随色谱实验条件而改变，因而很少使用。在实际工作中一般采用相对校正因子。其定义为某物质i与所选定的基准物质s的绝对定量校正因子之比，即:
fwi=f'wif'ws=Wi/AiWs/As=AsWiAiWs
上式中W以重量表示，因此fw又称为相对重量校正因子，通常称为校正因子(f)。 定量校正因子的测定: 气相色谱的定量校正因子常可以从手册和文献查到，但是中药中待测有效成分常常需要测定特定成分的校正因子。测定时，准确称取待测校正因子的物质(纯品)和所选定的基准物质S，混合均匀后进样，测得两色谱峰面积Ai和As，用上式求得待测成分i的相对重量校正因子。显然，选择不同的基准物质测得的校正因子数值不同。测定校正因子的条件(检测器类型)应与定量分析的条件相同。 6 分析实例
例 藁本挥发油中肉豆蔻醚的含量测定
[仪器] SP-2306气相色谱仪，SFW-3色谱数据处理器
[色谱条件] 色谱柱：5%OV-17，Chromsorb-102白色担体(60~80目)，4 mm × 3 m不锈钢柱；柱温：230 ℃；检测器温度：250 ℃；气化室温度：270 ℃；流速：240 mL/min；检测器：氢火焰离子化检测器。
[对照品溶液的配制] 精密称取肉豆蔻醚对照品，用无水乙醇配成56.2 mg/mL的溶液；内标溶液的配制，精密吸取二甲苯1 mL置100 mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀。 [校正因子的测定] 精密吸取对照品溶液1 mL置100 mL容量瓶中，加内标溶液5 mL，用无水乙醇稀至刻度，摇匀。按上述色谱条件进样5 μL，重复进样三次。以峰面积计算，求出肉豆蔻醚校正因子为1.4801，变异系数为1.026%。
[样品测定] 精密吸取藁本挥发油0.5 mL置10 mL容量瓶中，精密加入内标溶液5 mL，用无水乙醇稀至刻度，摇匀。按上述色谱条件进样5 L，根据色谱图求得内标物和待测组分的峰面
积，由校正因子计算出三批样品中肉豆蔻醚的含量分别为9.63%，10.31%和8.48%。
第四节 高效液相色谱法
高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)以经典的液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论和方法，流动相改为高压输送，采用高效固定相及在线检测等手段发展起来的分离分析方法。具有分离性能好、分析速度快速快、重现性好、适用范围广等优点，目前其应用已超过气相色谱法，尤其是对挥发性低、热稳定性差、分子量大的化合
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物及离子型化合物，更显示出它的优越性。目前中药分析研究报道中高效液相色谱法最为常用，特别是样品纯化技术的提高如采用液液萃取、液固萃取、超临界萃取，使得具有高分离效率的HPLC法能准确定量中药成分。如中国药典95年版一部采用HPLC法以C18为分析柱、以甲醇／水或甲醇／酸／水作流动相测定了化橘红、骨碎补、丹参、香加皮、黄芩、胡椒、筚芨、寥大青叶、护肝片、小儿消炎栓、愈风宁心片中有效成分的含量。现有许多文献报道HPLC法分离测定中药中生物碱类、苷类、黄酮类、有机酸类、酚类、内酯类等成分。
1 HPLC的关键部分-色谱柱
一台高效液相色谱仪包括储液器、高压输液系统、色谱柱、检测器和数据处理系统。色谱柱是高效液相色谱仪的核心部件，它决定着样品分析的成败，所以本节重点介绍色谱柱的种类和填料。色谱柱要求分离度高、柱容量大、分析速度快。要达到如此好的性能，不仅与固定相本身的性能有关，而且与色谱柱结构、装填和使用技术等有关。 1.1 色谱柱结构
色谱柱由柱管和固定相组成。管材料一般均采用优质不锈钢。柱内壁要求精细地抛光加工，有很高的光洁度，绝对不允许有轴向沟痕，否则会影响色谱过程的良好进行,引起色谱区带展宽，降低柱效。在理论上色谱柱的柱长与柱效成正比，增加色谱柱的长度可以提高柱效。但由于微粒固定相的采用，不得不对柱长有所限制，再考虑到目前的装填设备和技术，通常柱长在100~300 mm之间才能获得好的装填效果。
按规格不同分为分析型和制备型两类。
(1) 分析型色谱柱：常量柱内径2 mm，柱长10~25 cm；半微量柱内径1~1.5 mm，柱长10~20 cm。
(2) 实验室制备型柱内径20~40 mm，长10~30 cm。 1.2 色谱柱填料
填料的特性决定色谱柱的性能。填料颗粒的大小、形状、均匀性、表面积、孔径、孔体积等均影响色谱柱的效率。填料粒度小，颗粒均匀，球形规则，有利于提高柱效。掌握了各种填料的种类、对样品的吸附或分配特点有助于合理的选择不同类型的色谱柱，达到分离和分析的目的。现代液相色谱使用的柱填料按形态可分为两大类型：一种是表面多孔型(薄壳型)：是以内部为一个惰性的硬核(如实心玻璃球，一般粒径为20~50 μm左右)，在核的表面包有一层很薄的多孔物质，如硅胶、氧化铝、聚酰胺、离子交换树脂或化学键合相。表层多孔固定相机械强度高，渗透性好，有相当好的柱效，可以用于液-固色谱固定相，也可以涂敷固定液后用于液-液色谱固定相，还可用它做为基料制备键合固定相。缺点是样品容量小，不能用于制备色谱。
另一种是全多孔微粒型填料:分球形和无定形两种，颗粒直径为5~10 μm，筛分范围一般为1~2 μm。这是目前HPLC分析中广泛使用的一种填料。由于全多孔固定相粒径很小，柱
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效大为提高，而且由于它的全多孔性，柱容量要比表层多孔固定相大得多。因此，它已取代表面多孔固定相，是目前最常用的液相色谱固定相。常用的有硅胶，氧化铝和聚合物小球，其中微粒硅胶应用最广泛，无定形与球形的柱效相当，但球形的渗透性要优于无定形。同表层多孔型固定相一样，微粒硅胶常用作液-固色谱固定相，也可作为化学键合相的基质。
色谱柱类型按分离机理来分有正相、反相、凝胶渗透、离子交换和手性拆分等几种类型。掌握各种不同类型色谱柱填料的物理化学性质和分离特点，对于我们实际分析工作中色谱条件的摸索有着极为重要的作用。由于高效液相色谱方面的论著很多，相关内容都有很详细的论述，这里只对中药仪器分析中常用的正相和反相色谱作一介绍。
正相色谱是指流动相的极性小于固定相的分离分析体系。正相色谱柱的填料极性较高，如硅胶、三氧化二铝、二醇基、氨基和氰基键合固定相等。其流动相通常是非极性的有机溶剂加入适当的极性有机溶剂的混合溶液，如正己烷-醋酸乙酯、环己烷-异丙醇等。正相色谱的分离机理主要基于被分离化合物的极性基团与固定相极性基团相互作用的差别。基于正相色谱的特点可以推断正相色谱比较适用于以下几类样品的分离分析：(1)由反相色谱法很难分离的异构体可以采用以硅胶为固定相的正相色谱分离分析；(2)根据被分离化合物的极性差别进行族类分离；(3)易于水解化合物的分离分析；(4)在极性有机溶液中溶解度很小的高脂溶性化合物（如只有一个羟基或没有羟基的萜类和一些芳香性天然化合物）的分离分析。
反相色谱是指流动相的极性大于固定相的分离体系。反相色谱最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料；在分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。反相色谱所采用的流动相通常是水或缓冲液与极性有机溶剂如甲醇、乙腈的混合溶液；在分离分析疏水性很强的实际样品时，也可采用非水流动相而提高其洗脱能力。反相色谱的分离机理主要基于被分离溶质与固定相疏水作用力的差别，通过调节固定相和流动相的性质，反相色谱可分离分析的样品非常多，据文献报道，约70%~80%的高效液相色谱分离分析是在反相色谱上完成的。
现在市售的色谱柱按填料分主要有两大类：一类为上面提到的全多孔微粒型填料，主要为球形硅胶，颗粒直径为5~10 μm，国内厂家有青岛海洋化工厂的YWG和YQG，天津试剂二厂的YWG等。国外产品种类繁多，有YMC、Agilent、Alltech和Waters等公司生产的Si-60， Zorbax，LiChrosorb等多种类型的填料。在进行色谱柱选择时，一定要厂家提供相关的分析资料，了解具体某种填料的性能，并查阅与待分离化合物相同或相似结构类型的相关分析分离的文献，以最大程度地保证色谱柱选择的恰当。
另一类为用途最为广泛的化学键合固定相。化学键合固定相是利用化学反应把带有不同化学基团的分子化学结合到基料上去。由于硅胶表面上带有活性基团羟基，所以微粒硅胶是最为常用的化学键合相的基料。依据键合到硅胶表面上的官能团的不同，可分为极性、非极性和离子交换三种类型。在中药化学成分的分离与分析中，使用较为广泛的是反相（烷基键合相，C18，C8）、氰基和氨基键合相。
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反相键合相是以甲醇/水、乙腈/水或四氢呋喃/水作为流动相的反相模式用来分离非极性或中等极性的化合物。固定相的选择性是基于C18、C8等疏水基团。中等极性的氰基（CN）键合相，保留比硅胶弱，但选择性相似。对含双键的化合物有选择性，在氰基柱上，用乙醇/戊烷流动相分离了脂溶性纤维素、香精油和极性更高的同系物。强极性的氨基(-NH2)键合相有独特的选择性，以水/乙腈流动相成功分离了糖、肽类等极性化合物。
2 检测器 2.1 紫外检测器
紫外检测器 (ultraviolet detector, UVD 或UV) 是高效液相色谱应用最早、最普遍的检测器，直到现在，几乎所有色谱仪都配有这种检测器。紫外检测器的原理是当一束单色光透过流通池时，若流动相不吸收光，则待测组分的溶液对该单色光的吸收服从 Lambert-Beer定律。
紫外检测器有高灵敏度、精确度，线性范围较好，对强吸收物质的检测下限可达1ng，并且对环境温度、流速波动、冲洗剂组成的变化不甚敏感，因此无论等度或梯度冲洗，都可使用；此外，紫外检测器不破坏样品，可用于制备样品检测。
但紫外检测方法有其局限性：①其只能对有紫外吸收的样品进行检测，即只能对具有π-π或p-π共轭结构的化合物进行检测；如芳烃、稠环芳烃、芳香基取代物、羧基化合物等；在检测p-π共轭结构的化合物时，需要用末端吸收检测；②流动相的截止波长必须小于检测波长；③对于成分较为复杂的中药，干扰物质与被测物质可能会呈现相似甚至相同的保留时间，即使改变色谱柱类型、调整流动相组成或比例，亦无法加以区分；④常用的紫外检测器有固定波长型和可变波长型，但由于各有效成分彼此的最佳检测波长各异，以单波长检测无法兼顾，要以不同波长分析数次才能达到良好分离，增加了工作量；⑤紫外检测只能靠保留时间定性，确认及鉴定的信息欠充分。
针对紫外检测器的这些弱点，20世纪80年代研制出了一种新型的紫外检测器-二极管阵列检测器，是HPLC检测手段的一大进步。它应用现代光电矩阵技术，在进行分离分析的同时，可在选定波长范围内对被检测化合物进行紫外光谱的扫描。 例：对《中国药典》2000年版I部白芍中芍药苷含量测定方法的探讨
[仪器] HP1100系列高效液相色谱仪(四元泵，紫外检测器)，Agilent化学工作站，
[色谱条件] 色谱柱为YWG-C18柱10 μm (250 mm × 4.6 mm)，检测波长230 nm，流动相为甲醇:水=30:70，流速1 mL/min，柱温为室温。
[标准曲线的制备] 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每mL含0.49 mg的对照品溶液，精密吸取对照品溶液1，2，4，6，8，10 μL分别进样2次，以芍药苷对照品进样量为横坐标，峰面积均值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为Y = 1.514X 2.3714，相关系数r = 0.9995。结果表明，芍药苷在0.49~4.9 μg范围内线性关系良好。
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[供试品制备] 取白芍粉约0.6250 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加人70%的乙醇约23 mL，不经浸泡，直接超声处理30 min，取出，放冷，加70%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[样品测定] 分别吸取供试品和对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，测定。 此方法线性关系良好(r=0.9995)，平均加样回收率为101.518%，RSD为1.682%。
2.2 二极管阵列检测器（Fig.4）
紫外吸收检测器一次分析一般只能得到在一个波长下的色谱图。二极管阵列检测器(photodiode array detector, DAD)是采用光电二极管作为检测元件，构成多通道并行检测，在10 ms的时间内就可得到200~ 800 nm范围内较均匀地散射。不同波长的散射光经凹面镜及反射镜后，按波长顺序形成聚焦平面。二极管阵列与聚焦平面相吻合，因此阵列上各个元件同时收到不同波长的线。对二极管阵列快速扫描采集数据，即可得到如下图所示的三维色谱图（Fig.5）。
这种检测器具有以下特点:
① 分析结束后，即可获以时间、波长、吸收度为三轴的三维图谱；
② 通过对各峰的紫外光谱的分析，可判定各峰的光谱纯度，以分辨有无其他物质的干扰；
③ 通过将被检测样品各峰的UV图谱与现有的或自建UV图谱库的对照，使化合物的定性在对照保留时间的基础上又增添了有力的判定依据；
④ 对标准对照物进行分析时，除可确定其保留时间、吸收系数、UV光谱之外，亦可同时依据其UV光谱选择最佳测定波长，而不必另行配制浓度较高的标准溶液，以UV分光光度计进行扫描，节约了对照品；
⑤ 一次分析可同时使用多个波长，大大提高了分析效率。
Fig.4 二极管阵列检测器示意图
1：氘灯；2：消色差透镜；3：斩光器；4：流通池； 5：光电二极管阵列；6：全息光栅
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Fig.5 连翘药材的三维色谱图
例：水芹中槲皮素和异鼠李素的含量测定
[仪器] 高效液相色谱仪：Waters 600E 泵，Waters PAD996二极管阵列检测器；Waters Millennium 工作站
[色谱条件] 色谱柱：Diamonsil C18柱(250 mm × 4.6mm，5 µm，迪马公司)；流动相：甲醇-0.5%磷酸溶液(55∶45)；检测波长：367 nm；柱温：室温；体积流量：1.0mL/min。在该色谱条件下，槲皮素和异鼠李素对照品保留时间分别约为8.2、13.7分钟，供试品色谱中槲皮素和异鼠李素峰与杂峰分离良好。
[对照品溶液的制备] 取对照品槲皮素3.58 mg，异鼠李素2.57 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀；精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，摇匀，即得对照品溶液。
[供试品溶液的制备] 取水芹药材粉末(过60目筛)5.0 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇30 mL提取4小时，提取液水浴蒸干，残渣加甲醇-25%盐酸(4∶1)溶液20 mL，加热回流30分钟，用0.45 μm滤膜滤过，滤液于25 mL量瓶加甲醇至刻度，即得。 [测定法] 精密吸取供试品溶液10 μL进样，以峰面积积分值计算。
2.3 示差折光检测器
示差折光检测器 (refractive index detector, RI) 也称光折射检测器，是一种通用型检测器。是利用组分与流动相的折射率之差进行检测。溶液的光折射率是溶剂(流动相)和溶质 (样品)各自的折射率乘以各自的摩尔浓度之和。溶有样品的流动相和流动相本身之间光折射率之差即表示样品在流动相中的浓度，原则上凡是与流动相光折射指数有差别的样品都可用它
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来测定，其检测限可达10-6~10-7 g/mL。由于几乎所有的物质都有各自不同的折射率，所以示差折光检测器是一种通用型检测器。
根据检测器光路系统的结构，可分为偏转式和反射式示差折光检测器两种。具体特点是偏转式示差折光检测器样品池体积较大(约20 µL)，结构复杂,但被测样品的折光指数范围宽，大约n=1.0~1.75，线性范围宽，多用于分子排阻色谱和制备色谱分离时的检测。
反射式示差折光检测器池体积小(仅3 µL)，但所测样品的折光率范围窄(n=1.33~1.63)，适用于分析型的高效液相色谱。
示差折光检测器的通用性强，但灵敏度较低，对流速和温度变化敏感。温度变化1oC，能引起折光指数变化约10RI。同时，由于不同溶剂折光率不同，所以不能用于梯度洗脱。 例：RP一HPLC示差折光检测法测定复方知母胶囊中菝葜皂苷元的含量
[仪器] Waters高效液相色谱仪(美国Waters公司，包括515泵，2410示差检测器，7725i进样器，Millennium32色谱工作站)
[色谱条件] 色谱柱：Hypersil ODS(4.6 mm × 150mm，5 μm)不锈钢柱；流动相为甲醇；流速0.9 mL∙min-1；柱温30 ℃；进样量：20 μL；灵敏度：4 × 10-6 AUFS。
[供试品溶液的制备] 取复方知母胶囊内容物约50 mg，精密称定后，置25 mL量瓶中，加乙醇约20 mL，超声提取40 min，取出后，加乙醇稀释至刻度。滤过，精密吸取滤液20 mL置圆底烧瓶中，加盐酸l mL，置水浴上用蒸气缓慢回流1.0 h，放冷，加15 mL水，回收溶剂至无醇味，用氯仿萃取4次，每次20 mL，合并萃取液，回收氯仿，残渣用甲醇溶解，稀释至10 mL的量瓶中，0.45 μm滤膜过滤作为供试品溶液。
[对照品溶液的制备] 精密称取菝葜皂苷元对照品适量，加甲醇配制成0.5 mg∙mL-1的溶液，即得。
[线性关系考察] 精密吸取菝葜皂苷元对照品溶液适量，加甲醇溶液定量稀释成50，100，150，200，250，300，350 μg/mL的溶液，按色谱条件进样测定，测定峰面积，以菝葜皂苷元对照品的微克数为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y = 9139.5X + 33.286，相关系数r = 0.9998。结果表明，菝葜皂苷元在1.0~7.0 μg 范围内的质量与峰面积具有良好的线性关系良好。
[样品测定] 取3个批号(批号011021，011022，011023)的复方知母胶囊，按供试品溶液的制备操作，每次进样20 μL，计算含量。
2.4 蒸发光散射检测器
蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector, ELSD）是20世纪90年代出现的通用型质量检测器，对所有固体物质均有几乎相等的响应，其检测限一般为8~10 ng。由于有些化合物没有紫外吸收，而示差折光检测器对温度变化及流动相的梯度变化又极为敏感，使他们的实用性与适用性大受限制，蒸发光散射检测器是它们理想的替代品。其工作原
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理是：将洗脱液引入已经通入高压气流(常为高纯氮，或过滤后的压缩空气)的蒸发室，加热，流动相及低沸点的组分被蒸发除去，而样品组分形成气溶胶进入检测室。用强光或激光照射气溶胶，光束穿过散射池时被散射，测定散射光强度而获得组分的浓度信号。
当测定体系的流动相流速恒定时，散射光强度（I）与检测器的化合物量有下述关系： I = km 或 lgI = blgm + lgk
式中：k和b为与蒸发室（漂移管）温度、雾化气体压力及流动相性质等实验条件有关的常数。上式表明散射光的对数响应值与组分质量的对数成线性关系。
ELSD具有多方面的优点，与紫外检测器相比，主要体现在以下几个方面：
①应用范围广，UV检测器对于无紫外吸收或检测波长下吸收系数小的化合物，如：聚合物树脂、糖类、磷脂等无法加以测定。而ELSD作为一种通用型质量检测器，对所有非挥发组分均可产生响应。
② 可消除流动相及杂质的干扰。样品中的某些杂质：其含量并不高，但在测定波长下呈现较大的吸收系数而干扰检测；ELSD检测信号强弱仅与检测器中的化合物的颗粒多少有关，可最大限度地减小杂质的干扰。某些样品的紫外吸收波长较短，与流动相的末端吸收接近而影响测定。用ELSD检测，流动相被蒸发气化，不会对测定造成干扰。
③ 可更准确地反映组分之间的质量关系。以ELSD为检测时其对所有组分的响应因子几乎相同，因此无需测校正因子即可检测出各组分之间的准确的质量组成情况，这对于含未知杂质的中药样品分析尤为适用。
④ 与示差折光检测器相比，ELSD可避免流动相梯度改变及温度差异造成的干扰，使灵敏度大大提高。ELSD因其独特的优点，在中药有效成份分析方面应用越来越广。
ELSD 的主要缺点是：①对于有紫外吸收的组分进行检测灵敏度比紫外检测器低约一个数量级；②只适用于流动相能挥发的色谱洗脱系统，如甲醇-水，乙腈-水等，对于有缓冲盐的流动相，由于缓冲盐不能挥发，本底高，影响检测。 例：天冬中天冬皂苷甲的含量测定
[色谱条件] 色谱柱：Alltima ODS柱（C18柱250 mm × 4.6 mm，All-tech，美国）；流动相：甲醇-水(75: 25)；流速：0.5 mL/min。 ELSD参数：漂移管温度：105 ℃，载气流速：1.6 L/min。 [对照品溶液的制备] 精密称取天冬皂苷甲对照品4.24 mg，置于5 mL棕色量瓶中，用无水乙醇溶解定容，配成0.848 mg/mL的对照品溶液。
[供试品溶液的制备] 取样品粉末（过40目筛）约0.3 g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入丙酮-水(8∶2) 10 mL，振摇，密闭，放置12h。滤过，减压浓缩(45 ℃以下)后，转移至5 mL棕色量瓶中，加无水乙醇稀释定容，作为供试品溶液。
[线性关系的考察] 将对照品溶液稀释成5个不同浓度，各取相同体积进样，进样量分别为0.848，1.656，2.2048，2.544，3.0528。以峰面积的自然对数为纵坐标(Y)，进样微克数的自然对数为横坐标(X)，绘制天冬皂苷甲标准曲线。回归方程为：Y = 1.5679X + 12.5810，相关
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b
系数r = 0.9992，线性范围为0.848~3.053 μg。
[测定法] 分别精密吸取对照品溶液与用微孔滤膜滤过的供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，记录HPLC色谱图，用外标法计算天冬皂苷甲含量。
2.5 电化学检测器
电化学检测器（electrochemical detector, ECD）是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的。主要有极谱、安培、库仑和电导四种。前三种可统称为伏安检测器，以测量电解电流的大小为基础，后者以测量液体的电阻变化为根据。其中，应用最广的是安培检测器(ampere detector, AD)，又叫电流检测器。
电流检测器的工作原理是组分发生氧化还原反应，会产生电流变化，其经过电极表面时，若电极材料和溶液之间存在电位差，则在电极表面发生电极反应，形成电流，经微电流放大器放大后记录下来，得到色谱图。在电极表面上电子转移所产生的电流符合法拉第定律: Q = nFN，式中n为1 mol电活性物质在电极反应中转移的电子数，F为法拉第常数，N为发生电极反应的电活性的物质的量，Q为电荷量。此式为电流检测器的定量基础。电流检测器能检测具有氧化还原性的物质，如有机含氧化合物及醛酮等。该检测器的优点是：结构简单、池体积小(1µL)、响应快、噪声低、灵敏度高(约10-9 g/mL)、选择性好；但是不能检测不能氧化还原的物质。
流动相的极性、pH值、离子强度和电活性对成功的安培检测十分重要。安培检测主要用于使用极性流动相的反相色谱和离子色谱分离。通常正相色谱流动相的极性小，不能达到电化学反应要求的离子强度。为了扩大流动相的使用范围，也可以柱后添加电解质溶液。许多电极的氧化或还原反应中有质子的吸收或释放，因此流动相的pH值很重要，一般流动相中电解质和缓冲液浓度要在0.01 mol/L~0.1 mol/L之间。pH值对色谱分离和电化学检测都有影响（酸度高时需要更高的氧化电势），流动相pH值的确定有时需要二者兼顾。另外，流动相溶剂和电解质的纯度对减小背景电流和噪声水平至关重要。氧化反应时，高电势条件下流动相的溶解氧会产生很大的背景噪声，因此；流动相的脱氧很重要，可以采用化学或电化学的方法除氧，或者使用双电极操作除氧。对复杂体系的样品，电池及包括电极表面的清洗十分必要，尤其是生物样品中的蛋白质和磷脂等，应事先去除以避免电极吸附。
在分析中药化学成分中的酚类、醌类、生物碱、苷类、多糖、肽类、氨基酸和活性蛋白极性大的化合物，这些化合物分子上都带有能在工作电极上起电极反应（氧化或还原）的基团，因而安培检测器有其不可替代的优势。 2.6 荧光检测器
目前使用的荧光检测器（fluorophtometric ditector, FD）多具有流通池的荧光分光光度计。其检测限可达10-10 g/mL，比紫外检测器灵敏度还要高，但是只适用于能产生荧光或是其衍生物能发荧光的物质。由于其灵敏度高，是体内药物分析常用的检测器之一。多用于氨基酸、
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多环芳烃、甾类化合物的检测。
第五节 超高压液相色谱法
随着科学技术的发展，对液相色谱技术的要求也在不断提高，又有了新的需求，例如代谢组学分析，大量的样品需要在很短的时间内完成；生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；与MS及MS/MS等检测技术联用时，对连接的质量提出了更高的要求等，因此单从技术的角度改进已有液相色谱已经不能满足需求，这就需要从理论高度对液相色谱重新认识。因此，超高效液相色谱 (ultra performance liquid chromatography, UPLC) 的概念得以提出， UPLC是用HPLC的极限作为自己的起点，从而把分离科学推向了一个新领域。
UPLC可以更快的速度和更高的质量完成以往HPLC的工作，从而节省宝贵的时间和日常溶剂消耗； UPLC的高分离度可以从容面对复杂组份（如天然产物或中草药等）分离的挑战；UPLC的高灵敏度帮助用户检测更加痕量的目标化合物；UPLC快速的分离使用户轻松分析大量样品，实现高通量。 1 UPLC原理基础
早在1956年，J.J van Deemter就发表了他的著名理论：Van Deemter曲线及其方程式。最早这个理论是用在气相色谱上的，但是后来发现该理论同样适用于液相色谱。
由研究著名的Van Deemter 方程式及其曲线可以得到以下几点启示： (1) 填料粒径越小，柱效越高；
(2) 不同粒径的填料有各自最佳柱效的流速；
(3) 更细粒径的填料使最高柱效点向更高流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围。
Van Deemter 方程为UPLC提供理论支持，由此给出启示是更细粒径的填料不但能提高柱效，同时还能提高分析速度。但在实际分析分离工作中，高流速必然会使系统压力升高，从而受到色谱柱填料耐压及仪器耐压的限制；反之，如果不用到最佳流速，小颗粒度填料的高柱效就无法体现。此外，更高的柱效需要更小的系统体积（死体积）、更快的检测速度等一系列条件的支持，否则小颗粒度填料的高柱效同样无法充分体现。因此，要真正使UPLC走向实际应用领域，必须解决以下几个问题：
(1) 大幅度提高色谱柱的性能：首先要解决小粒径填料的耐压问题；其次要解决小粒径填料的装填问题，包括粒径的分布以及色谱柱的结构；
(2) 高压溶剂输送单元（超过15000psi）；
(3) 完善的系统整体性设计，降低整个系统的体积，特别是死体积，并解决超高压下的耐压及渗漏问题；
(4) 快速自动进样器，降低进样的交叉污染；
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(5) 高速检测器；优化流通池以解决高速检测及扩散问题；
(6) 系统控制及数据管理，解决高频率数据的采集、仪器的控制问题。 2 新型的色谱填料及装填技术
基于上述问题的出现，UPLC分离只有在新型的、耐压而且颗粒度分布范围很窄的1.7µm颗粒填料合成出来之后才有可能实现。
色谱柱技术应该涵盖几个方面的内容：
（1）填料的合成，以得到高质量的填料颗粒，包括：耐高压、耐酸碱等等； （2）颗粒的筛选，选出颗粒度分布尽可能窄的填料；
（3）装填技术，以保证既能堵住颗粒不使其外流，又不至于引起反压的大幅升高。 目前市场上能满足以上条件的色谱柱有Waters公司推出的ACQUITY UPLC®BEH C18、C8、苯基和ShieldRP18、 HILIC 及HSS T3 色谱柱，其中尤以ACQUITY UPLC® BEH色谱柱使用了更严格的筛分技术，使1.7µm填料的分布很窄，并且使用了全新筛板、柱管及其连接件等其它色谱柱硬件设备，在超过20,000psi的压力下装填而成，因此ACQUITY UPLC色谱柱的性能及质量比目前的HPLC柱有了质的飞跃，它的出现，从而使UPLC的实现成为可能。 3 UPLC的优势 (1) 超高分离度
HPLC 与UPLC 的基本分离理论，说明了颗粒度大小和分离度密不可分的关系。UPLC系统使用1.7 μm 颗粒填充的色谱柱，其提供的柱效比5 μm颗粒提高了3 倍，从而显著增高了柱效。因为分离度与粒度的平方根成反比，1.7 μm 颗粒的分离度比5 μm 颗粒提高了70％。在梯度分离中也具有同样的优越性，此时分离能力用峰容量衡量。UPLC用1.7 μm颗粒提高了分离能力，可以分离出更多的色谱峰，从而对样品提供的信息达到了一个新的水平。而且又最大地缩短了开发方法所需的时间。 (2) 超高速度
由于UPLC系统用1.7 μm颗粒，柱长可以比用5 μm颗粒时缩短3倍而保持柱效不变，而且使分离在高3倍的流速下进行，结果使分离过程快了多倍而分离度保持不变。其快速分析亦节省了以往一向耗时的方法认证的时间，使方法认证变得简单快速。 (3) 超高灵敏度
UPLC使用小颗粒技术可以得到更高的柱效（因而改善了分离度）、更窄的色谱峰宽，即更高的灵敏度。因为色谱峰变得更窄，峰高也就更高了；同样，当UPLC用于快速分析、用较短色谱柱而使柱效不变时，色谱峰高会相应增加。因此，使用UPLC技术，不仅可以在保持与HPLC相同分离度时提高峰高，而且在改善分离度的同时亦可提高峰高即灵敏度。
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综上，基于1.7 μm小颗粒技术的UPLC不仅比传统HPLC具有更高的分离能力，而且结束了人们多年来不得不在速度和分离度之间忍痛割舍的历史。使用UPLC可以在很宽的线速度、流速和高反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果。
下面的两个图文章中缺乏标出部分，图中的颜色可否都为黑色。已改如下
此外，UPLC用1.7μm颗粒提高了分离能力，可以分离出更多的色谱峰，从而对样品所能提供的信息达到了一个新的水平。而且又极大地缩短了开发方法所需的时间。
4、UPLC与质谱联用技术
由于低流速下色谱峰扩散不大，增加了峰浓度，有利于提高离子源的效率，因而使灵敏度至少提高了3倍。除UPLC技术本身带来的速度、灵敏度和分离度的改善外，UPLC的超
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强分离能力有助于目标化合物与之竞争电离的杂质的分离，从而可以使质谱检测器的灵敏度因离子抑制现象的减弱或克服而得到进一步的提高。故使用UPLC－MS联用，可以获得灵敏度较HPLC－MS联用系统大有改善的分离结果，获得更多、质量更好的信息。
6、分析实例
例1：UPLC-MS/MS法同时测定人血浆中黄芩苷和绿原酸
[仪器与材料] 美国Waters公司UPLC Quattro Primer液质联用仪，配有电喷雾离子源及Masslynx 4.1数据处理软件。色谱柱为Acquity UPLC BEH C18(50 mm × 2.1 mm ID，1.7 μm)；黄芩苷 (baicalin)、绿原酸 (chlorogenic acid)和山柰素 (kaemperol)对照品，均购自中国药品生物制品检定所。
[色谱与质谱条件] 流动相：A(水，0.1％ 甲酸)，B(甲醇，0.1％ 甲酸)；梯度洗脱(0-5 min，A：95％- 20％ ；B：5％- 80％ )；流速：0.35 mL·min-1。电喷雾离子源，多反应监测(MRM)，正负离子同时检测。黄芩苷：[M + H] ，m/z 447271；绿原酸：[M - H]，m/z 353191；山柰素：[M + H]+ ，m/z 287287。喷雾电压：黄芩苷、山柰素，3.0 kV；绿原酸，2.0 kV；雾化气流量：600 L·h；碰撞能量：18 eV；碰撞气流量：0.16 mL·min；脱溶剂温度：400 ℃；离子源温度：120 ℃ 。在本实验条件下，黄芩苷保留时间为3.33 min，绿原酸保留时间为1.45 min，内标山柰素保留时间为3.95 min。黄芩苷、绿原酸和内标山柰素峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳。
[血浆样品处理] 在离心管中先加入5％Na2S2O5 10 μL，精密加入血浆200 μL，不同浓度黄芩苷、绿原酸对照溶液各20 μL，精密加入内标山柰素溶液(1．388 μg∙mL )25 μL，涡旋30 s，加入甲醇755 μL，涡旋3 min，于12000 g·min-1 离心10min，吸取上清液150 μL，进行UPLC-MS/MS分析，进样量2.5 μL。
[标准曲线和线性范围] 按―血浆样品处理‖项操作，加入对照溶液，配成含黄芩苷的质量浓度分别为9.6，19.2，38.5，77，154，385，770和1 540 ng·mL，含绿原酸的质量浓度分别为7.5，l5，30，60，120，300，600和1200 ng·mL-1 的血浆。记录色谱图，计算黄芩苷峰面积A1 、绿原酸峰面积A2 和内标峰面积As 的比值Y(黄芩苷：Y =A1/As；绿原酸：Y = A2/As)，以Y对血药浓度 作回归计算，得回归方程：黄芩苷：Y = 0.0110344X + 0.042670 5，r = 0.9974，W=1/X；绿原酸：Y = 0.00229513X 0.0007394，r = 0.9994，W=1/X。按该方法测得的黄芩苷血药浓度的最低定量限为：9.6 ng·mL-1；绿原酸血药浓度的最低定量限为：7.5 ng·mL-1。
例2 UPLC-UV测定细辛地上和地下部位中的马兜铃酸A
[仪器与材料] Acquity Ultra performance LC色谱仪，Acquity PDA检测器，Acquity UPLC HSS T3色谱柱(50 mm × 2.1 mm ID，1.8 μm)。马兜铃酸A(中国药品生物制品检定所，供含量测定用)
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[色谱条件] 流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸(B)；梯度洗脱：0～5 min，A 30％ ～60％；5～7min，A 60％ ～100％。流速为0.5 mL·min；检测波长251 nm；柱温40 ℃，样品室温度20 ℃。 [对照品储备液] 精密称定马兜铃酸A对照品适量，加甲醇制成145 μg∙mL-1 溶液，冷藏备用。 [供试品溶液] 取细辛药材粉末(过65目筛)约2 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加10％ 甲酸：甲醇(20：80)至刻度线。密塞，超声提取30 min。放冷后，用提取液补足减少的体积，在4 000 r·min下离心5 min，吸取离心后的上清液9 mL转移至l0 mL量瓶中，加12 mol·LNaOH 350 μL。加水至刻度，摇匀，得pH在l0以上的供试品溶液。
[线性关系] 取马兜铃酸A对照品贮备液(145 μg∙mL )，用甲醇：水(1：1)混合液进行稀释，制成18.1、72.5、290、580、l l60和l 450 ng·mL系列对照品溶液，各进样5L，测定马兜铃酸A的峰面积值，回归处理所得数据，回归方程为：Y = 4.89X 220，r = 0.9999。结果说明马兜铃酸A的含量在18～1450 ng·mL-1 与峰面积积分值(Y)呈良好的线性关系。
[马兜铃酸A的检测] 取待测的细辛药材，制备供试液，供试品溶液分别进样5 μL，记录色谱图，结果表明，7批细辛根中马兜铃酸A的含量均在百万分之四。
第六节 高效毛细管电泳法
高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis, HPCE)是一种高效分离分析技术，是近几年分析化学发展最为迅速的领域之一。它具有高效(每米理论塔板数在10以上)、快速(分析时间一般为十几分钟至几十分钟)、进样体积小(一般为 nL级)、溶剂消耗少和抗污染能力强等特点，不仅广泛用于离子型生物大分子，如核酸、多肽和蛋白质等的分析，在中药有效成分的分析方面也显示出一定的优势。 1 毛细管电泳的分离模式：
分离模式包括毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)、胶束电动毛细管色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC)、毛细管等速电泳(Capillary Isotachophoresis, CITP)、毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis, CGE)、毛细管等电聚焦电泳(Capillary Iso-electric Focusing, CIEF)及近年刚刚兴起的毛细管电色谱(Capillary Electrochromatography, CEC)。其中应用较多的是CZE和MECC。
2 毛细管电泳的原理
HPCE是从传统电泳发展而来的，它以高压(可达30 kv)下产生的强电场为驱动力，以小内径的石英毛细管为分离通道，依据各组分之间电泳淌度或分配系数的差异实现分离。毛细管中充满具有一定离子强度的缓冲液后，在其两端加上高电压，带电粒子在电场作用下以不同速度向其所带电荷反方向迁移，当pH＞3时，毛细管内壁的石英分子因H2SiO3分子的解离，而在表面形成一层负电荷，吸引缓冲液中的正离子，形成一个双电层。在高电压作用下，双电层水合阳离子层引起整个溶液在毛细管中向负极方向移动，形成电渗流。带电粒子在毛细
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管内的电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流二者的矢量和，因此阳离子首先从负极流出；中性离子的速度等于电渗流速度，随后流出；而由于电渗流速度大于电泳速度，因此阴离子最后流出。 3 毛细管区带电泳(CZE)
当缓冲溶液的pH＞4时，毛细管内壁带上负电荷，相应地缓冲溶液带上正电荷，形成双电层。在高电场的作用下，溶液相对于毛细管壁向负极方向移动，这就是电渗流(EOF)，EOF在HPCE中有重要意义。溶液中带正电荷的柱子，它的运动方向与EOF相同，所以首先洗脱：中性粒子随EOF一起移动；带负电荷的粒子运动方向与EOF相反，在EOF的作用下最后流出毛细管柱。CZE中，离子的迁移顺序与所带电荷的类型(正、负)、荷电量的多少及离子半径的大小有关。由于中性粒子的淌度差为零，所以CZE不能分离中性粒子。CZE模式主要用于中药中一些能解离成分的含量测定。
例：毛细管区带电泳法测定厚朴药材及其超临界流体萃取物中厚朴酚、和厚朴酚的含量 [实验条件] 运行缓冲液为加20 mol/L硼砂液(pH =10.0)；柱温为25 ℃ ；分离电压18 kv，极性为正极到负极；压力进样，进样压力为4000 Pa．时间为5秒；检测波长为294 nm；药材的提取溶剂为甲醇，样品溶剂为甲醇与水的混合液。样品溶液和运行缓冲液均经过0.45 μm微孔滤膜过滤。每次进样前,先用0.1 mol/L-1 氢氧化钠液冲洗1分钟，再用水冲洗2分钟，最后用运行缓冲液冲洗平衡3分钟。在选定的电泳条件下，磺胺甲噁唑峰形良好且与被测定样品中各组分分离完全，故选择磺胺甲噁唑作为内标物。在此条件下和厚朴酚、厚朴酚和内标的保留时间分别为6.6，8.5和9.5分钟。
[对照品溶液的制备] 精密称定厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，置同一量瓶中，用甲醇溶解后定容，用0.45μm滤膜过滤。两组分的浓度分别为360和420 μg/mL。
[内标溶液的制备] 称取磺胺甲噁唑约0.2 g，加氢氧化钠试液少许，用甲醇适量溶懈后，水定容至100mL，用0.45μm滤膜过滤。
[线性范围考察] 精密量取对照品溶液0.1，0.3，0.5，0.7，0.9mL，各加入内标溶液0.1 mL，用水补充至1mL，摇匀。按选定的电泳条件进样测定，分别以对照品与内标峰面积的比值(Y)为纵坐标，以其浓度(x)为横坐标，各组分的线性范围和回归方程为：厚朴酚：Y = 0.2024 + 0.01262X，r = 0.9936；和厚朴酚：Y = 0.2903 + 0.01224X，r = 0.9926。由实验可知，厚朴酚在36~324 μg/mL和厚朴酚在42~378 μg/mL的浓度范围内线性关系良好。
[厚朴药材测定] 取厚朴药材，粉碎，研细，精密称法细粉约0.5g，置具塞锥瓶中，精密加入碱性甲醇(甲醇100mL，加氢氧化钠试液2 mL)50 mL，称定重量。放置16小时后，超声提取30分钟。补足损失溶剂，摇匀。滤过，精密量取滤液5 mL，加入内标溶液1 mL，水定容至10 mL，摇匀，滤膜过滤后，按选定的电泳条件进样测定。
[超临界流体萃取物测定] 精密称定萃取物约0.25 g，置50 mL量瓶中，加氢氧化钠试液少许，超声振荡使其分散后，加甲醇适量，超声溶解30分钟后，用甲醇定容。滤过，精密量取滤液
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1 mL，加入内标溶液1 mL，水定容至10 mL，摇匀。滤膜过滤后，按选定的电泳条件进样测定。
4 胶束电动毛细管色谱（MECC）
在缓冲溶液中加入表面活性剂，可以将色谱技术和电泳技术结合起来，这结束了HPCE不能分离中性粒子的历史。这种模式结合了电泳技术与色谱技术的特点，使毛细管电泳不仅可分离离子型化合物，而且也能分离中性化合物，从而大大拓宽了电泳的应用范围。
MECC的分离机理：在缓冲溶液中加入表面活性剂，其浓度要大于临界胶束浓度。表面活性剂分子是一端具亲水性、一端具疏水性的物质。当它们在水中的浓度达到其临界胶束浓度时，疏水性的一端聚在一起朝向里，避开亲水性的缓冲溶液，亲水性的一端则朝向缓冲溶液，形成胶束。比如MECC中常用的阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)，当浓度在8~9 mmol/L时,SDS单个分子靠彼此间的疏水作用聚集形成网状结构的带负电的胶束。带负电荷的SDS胶束不溶于水，在毛细管中作为独立的一相向阳极迁移。由于在中性或碱性条件下电渗流淌度大于胶束淌度，所以SDS胶束的实际移动方向和电渗流相同，最终在阴极端流出。
在MECC中，中性溶质根据亲水性不同在缓冲溶液与胶束之间分配。疏水性强、亲水性弱的溶质分配到胶束中的多，分配到缓冲溶液中的少；反之，亲水性强、疏水性弱的溶质，分配到缓冲溶液中的多，分到胶束中的少。溶质进入胶束时，以胶束的速度向阳极迁移;溶质进入缓冲溶液时，以电渗的速度向阴极迁移。在胶束中分配系数越大的溶质，在柱中迁移时间越长，保留性越强。以上作用使亲水性稍有差别的中性物质在电泳中得以分离。MECC实质上是以电渗流作驱动力，以胶束作为\"固定相\"，溶质在准固定相和水相间分配的液-液分配色谱与电泳的结合。其中，中性粒子分离机理只是它与胶束间的相互作用,而对于带电离子则同时有电泳迁移、静电作用、两相分配等多种分离机理。 例：胶束电动毛细管电泳法测定柑橘属药材中柚皮苷和橙皮苷的含量
[电泳条件] 石英毛细管，直径50 μm，长度64.5 cm，有效长度56 cm；缓冲液pH = 9.0，0.02 mol/L的硼砂，0.05 mol/L十二烷基硫酸钠(SDS)，10％的乙腈，电压20 kV；温度25℃；检测波长λ = 213 nm；进样量为10 kPas。在上述条件下，各药材中柚皮苷、橙皮苷及内标物迁移时间分别为6.5、6.8和10.4分钟。
[对照品溶液的制备] 精称取柚皮苷和橙皮苷适量，用50%甲醇溶解，滴加氨水调pH值8~9，分别制成200 mgL-1和92mgL-1的溶液。
[内标溶液的制备] 精密称取苯甲酸钠，加水溶解成200 mg/L的溶液，备用。
[样品溶液的配制]橘红、佛手剪成极细条，陈皮、青皮、枳实、枳壳等粉粹成细粉，过筛，分别称约0.5 g，置于50 mL容量瓶内，加50%甲醇超声提取30分钟，放冷至室温，补充损失的溶剂，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。
[线性关系考察] 分别吸取柚皮苷、橙皮苷、苯甲酸钠不同浓度的混合液，进样，以柚皮苷、
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橙皮苷的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。柚皮苷在200~l000 μg/mL、橙皮苷100~600 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程：柚皮苷为Y = 0.185X 0.824，r = 0.9995；橙皮苷为Y = 0.106X 0.994，r = 0.995。
[测定法] 取上述6种药材每份约0.5 g，精密称定，按上述方法提取并测定3次，用内标峰面积法计算。
5 毛细管柱
毛细管是由熔融石英加工制成的(内径20~100 m，长度为20~100 cm)，外壁涂有一层聚二酰亚胺以增加其柔韧性，内壁通常直接和溶液接触，有时也可根据需要涂上一层高聚物。与平板凝胶电泳类似，毛细管内也可填充支持介质，如琼脂糖，聚丙烯酰胺及甲基纤维素等。
溶液的pH值明显影响石英毛细管内壁表面特性，从而使电渗流随溶液pH值明显变化；同时，毛细管内壁表面特性明显影响壁表面对一些溶质的吸附作用。因此，改变壁表面特性可以改变溶质的电泳行为，减小吸附，提高分离效率和分析结果的重现性。改变石英毛细管壁表面特性的方法除了动态脱活如改变缓冲溶液pH、往缓冲溶液中加入适当添加剂以外，还可采用毛细管内壁涂层的方法，即用物理吸附或化学键合的方法在毛细管内壁覆盖一层聚合物薄膜，以达到减小吸附、抑制电渗流的目的。
按形成涂层的方法，毛细管内壁涂层可分为物理吸附涂层和化学键合涂层两大类:一类是物理吸附涂层。甲基纤维素涂层、聚乙烯亚胺涂层等都是物理吸附涂层。这类涂层涂渍方法简单、容易，在一定pH范围内能减少吸附、抑制电渗流，但是涂层的稳定性和重现性较差。
另一类是化学键合涂层。是指用化学键合的方法在毛细管内壁形成稳定的涂层。一般用具有双功能团的化合物如各种有机硅烷作偶联剂，先使其亲水基团与管壁上的游离烃基反应，与管壁形成共价键而牢固地附着在管内壁；再用偶联剂的疏水基团与自身单体或其他涂渍物聚合，形成均匀、稳定的薄膜涂层。常用的偶联剂有三甲基氯硅烷(TMCS)、甲基丙烯酰基丙氧基三甲氧基硅烷、己烯基三氯硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷、甘油丙基多聚硅氧烷等。
6 检测方法
用于毛细管电泳的检测方法有紫外吸收法、激光诱导荧光法、荧光法、电化学检测、质谱法、放射法、拉曼光谱法等多种（表2）。HPCE进样量小、分离速度快的特点要求校测器应具有灵敏度高、空间分辨率高、响应快及在线检测的功能。目前，光学检测器(紫外、二极管阵列和荧光)较为成熟，电化学检测器及放射性同位素检测器已开始应用。HPCE-MS联用因灵敏度高也得到发展。应根据所分析物质的特点选用相应的检测方法，以达到精密、准确和灵敏的分析要求。
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表2 各种检测方法比较
检测方法 紫外 荧光
激光诱导荧光 电化学
质量检测极限 10-13~10-16 10-15~10-17 10~10 10~10
-18
-19
-15
-20
优缺点
通用性强，快速扫描，提供信息较多 灵敏，但样品需要衍生
极其灵敏，但样品需要衍生，费用高
灵敏，只能用于电活性分析，需要专门的电器元件和毛细管改良柱
质谱 拉曼光谱
10-16~10-17 2×10
-15
灵敏，能提供结构信息，CE和MS之间的界面复杂
在中药有效成分分析中，较为常用的是紫外和二极管阵列检测器，另外还有很有发展前途的是电化学检测器，这在高效液相色谱一节中已经介绍。
7 HPCE在中药有效成分分析上的应用
中药的有效成分多为生物碱类、黄酮类、有机酸类、香豆素类及各种苷类，这些成分都可以用HPCE法进行分析：已经研究过的中药材有麻黄、黄连、黄柏、黄芩、芍药、大黄、甘草、柴胡、厚朴、当归、马钱子、丹参、吴茱萸、淫羊藿等。 7.1 生物碱类
生物碱类广泛分布于植物中，特别是防已科、麻黄科和毛茛科等，是一类有显著生物活性的重要成分。生物碱类成分能解离带上正电荷，一般用CZE模式分析。在一定的pH值下，使生物碱在缓冲液中带有部分正电荷而实现分离。有时加入有机溶剂，如乙腈，甲醇等作为改性剂来改善电渗流、选择性以及峰形。需同时分离分析其它组分时，亦有采用MECC模式的。已经建立了测定麻黄中6种生物碱：麻黄碱、伪麻黄贼、去甲昧黄碱、去甲伪麻黄碱、甲基麻黄碱、甲基伪麻黄眩的CZE方法。用均匀设计法优化小檗碱、巴马汀、药根碱的分析条件，最优分析条件是：60 mol/L磷酸氢二钠(pH 7.0) - 35％甲醇，14 kv电压，30℃，分析时间6分钟。以0.5 mol/L醋酸钠(pH 4.6) - 50％乙腈为电解液，9分钟内可分离黄柏中的6种生物碱：小菜碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱、黄柏碱和小檗红碱。长春花叶子中的长春新碱和长春碱的结构和pKa值都十分接近，需要较高浓度为0.2 mol/L的醋酸铵缓冲液才能分离。 例：苦参中生物碱的含量测定
[电泳条件] 毛细管柱50 μm × 64.5cm，0.02 molL-1磷酸缓冲液pH 7.0，电压20 kV，温度25 ℃，检测波长201 nm，进样量10 kPas
[对照品溶液的制备] 精密称取苦参碱、氧化苦参碱对照品适量，0.01mol/L-1盐酸溶解成35mg/L (苦参碱)、250mg/L (氧化苦参碱)。
[样品溶液的制备] 精密称取粉碎成粗粉的苦参1g，加入具塞50 mL锥形瓶中，加氯仿50 mL，
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浓氨水0.6 mL，超声提取40分钟，补充损失溶剂量，振摇后放置，滤过取20 mL蒸干，残留物0.01 mol/L盐酸溶解，定容至50 mL，0.45 μm滤膜过滤。
[线性关系考察] 吸取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL分别置于l mL容量瓶中，加0.01mol/L盐酸至刻度。浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。苦参碱在70~350 μg/mL、氧化苦参碱在50~250 μg/mL与峰面积呈良好线性。回归方程苦参碱为A = 0.893110X + 1.66613，r=0.99965；氧化苦参碱为A = 0.793797X + 0.824089，r = 0.99996。
7.2 黄酮类
黄酮类化合物有很多重要的生理活性，广泛存在于植物中，多用MECC模式分离。也有以碱性硼酸盐缓冲液为载体，使黄酮苷类组分中的顺式二醇基与硼酸形成带负电的硼酸酯类配合物，再以CZE模式进行分离。以MECC模式已经成功分离了黄芩中的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩素-7-O-葡糖苷酸、木蝴蝶素A和木蝴蝶素A-7-O-葡糖昔酸。 例：密蒙花中的橙皮素、木犀草素和芹菜素的测定
[电泳条件] 1229型高效毛细管电泳仪，配有固定波长紫外检测器；检测波长214 nm，未涂层弹性石英毛细管柱（55 cm × 50 μm，有效长度42 cm）；工作电压14 kV，静压力进样(高度10cm，时间8秒)；背景电解质为pH 9.5的50 mol/L 硼砂缓冲溶液（用0.2 mol/L HAc和0.1 mol/L NaOH溶液调pH），使用前超声脱气10分钟。
[供试品的制备] 将密蒙花样品在烘箱中60 ℃干燥4小时，然后粉碎，过74 μm筛。准确称量大约3.0 g粉末，加入50 mL甲醇，在水浴75 ℃回流5小时。冷却后将残渣过滤，残留物用10mL甲醇清洗2次。将提取物和清洗液合并，真空浓缩至大约10 mL，在25 mL容量瓶中稀释至刻度。
[线性范围的考察] 橙皮素、木犀草素和芹菜素三种物质分别在0.01~0.50、0.02~0.70、0.04~0.80范围内与峰高呈良好的线性关系。利用三倍噪音法得到检出限分别为3.5、4.5和5.0 μg/mL。
7.3 蒽醌类和香豆素类
此类化合物结构中多有羟基和羧基，用CZE和MECC模式都能分析。将25mmo1．L-1的3-环己氨基-1-丙烷磺酸与25 mmolL-1 SDS-乙腈(100:10)混合作为电解液(pH 10.96)可分离大黄中5种蒽醌类化合物，并测定掌叶大黄、唐古特大黄和藏边大黄中的芦荟大黄素、大黄素和大黄酸。以CZE分离了野菊花中7种香豆素类化台物，包括7-甲氧基香豆素(hernarin)、香豆素、伞形花内酯(umbelliferone)、香豆酸(coumarinicacid)、4-羟基香豆素(4-hydroxycoumarin)、6，7-二羟基香豆素(aesculetin)和二氢香豆素(dihydrocoumarin)。 例：中药大黄及青海野生大黄茶中活性蒽醌类成分的含量
[电泳条件] 熔融石英毛细管柱(75 μm × 50.0 cm，有效长度42.4 cm)；缓冲体系为15.0
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mmol/L 硼砂-30.0mmol/L SDS-10％乙醇，pH 9.60，分离电压20 kV；检测波长254 nm；温度(25 ± 0.3) ℃；进样时间为5.0秒(高度差为10.0 cm)。
毛细管第1次使用前依次用1.0 mol/L HC1冲洗5分钟，蒸馏水冲洗3分钟，0.1 mol/LNaOH冲洗10分钟，蒸馏水冲洗3分钟，缓冲溶液冲洗10分钟。2次运行之间毛细管依次用蒸馏水冲洗1分钟，0.1 mol/LNaOH冲洗2分钟，蒸馏水冲洗1分钟，缓冲溶液冲洗2分钟。为了保证重现性，缓冲溶液每运行3次后要进行更新。
[对照品溶液制备] 精密称定大黄素、芦荟大黄素、大黄酸适量，分别以氯仿-乙醇(1:1)为溶剂，配制成标准储备溶液（大黄素200 mg/L，芦荟大黄素200mg/L，大黄酸100 mg/L），在冰箱中保存。在使用前，按要求稀释为不同浓度的工作溶液。用0.2 mol/LHC1或0.2 mol/L NaOH调节pH值。用乙醇作电渗流标记物。
[供试品溶液制备] 分别将一定量的大黄药材及青海野生大黄茶研磨成粉末，然后准确称取大黄药材2.000 g、青海野生大黄茶5.000 g，分别以氯仿-乙醇(1∶1)作溶剂超声提取20分钟，然后过滤挥干，重复3次。提取物以氯仿与乙醇(1∶1)溶解并定容至10 mL。进样前用0.45 μm滤膜过滤。
[线性关系考察] 分别吸取大黄素、芦荟大黄素、大黄酸3种对照品储备液各0.1，0.3，0.5，0.7，1.0，2.0，4.0 mL，置5 mL量瓶中，加氯仿与乙醇(1:1)至刻度，摇匀，制得系列对照品溶液。横坐标X代表浓度(mg/L)，纵坐标Y代表峰面积，大黄素、芦荟大黄素和大黄酸3种有效成分的峰面积与浓度分别在4~120，10~200，2~100 mg/L呈良好的线性关系。3种有效成分的线性回归方程分别为：大黄素，Y = 1639 + 278.93X，r = 0.9921；芦荟大黄素，Y=762.75 + 63.37X，r=0.9970；大黄酸，Y = 751.41 + 757.80X，r = 0.9971。在3倍信噪比下，3种有效成分的检测限分别为0.3，1.2，0.1 mg/L。
7.4 苷类
这类化合物由于糖的部分拥有多个羟基，易溶于水，用CZE和MECC模式都能分析。已经成功分离了7种人参皂苷Rbl、Rb2、 Rc、 Rd、 Re、 Rf、Rg等。在硼砂缓冲液(pH l0.0)中加入30 mmolL-1 SDS和10 mmolL-1 CD，成功地分离了5种柴胡皂苷a、d、c、b1、b2等。 例：连翘、槐花中连翘苷和芦丁、槲皮素的分离测定
[电泳条件] 以20 mmol/L Na2B4O7（H3BO3调节至pH 8.40）30 mmol/LSDS-乙腈(1: 9)组成的缓冲溶液为电泳介质，未涂层弹性石英毛细管(50 μm i.d.，总长50 cm，有效长度为40 cm)。所有溶液使用前均用0.45 μm滤膜过滤，每次运行后依次以0.10 mol/L NaOH溶液、蒸馏水及电泳缓冲液清洗毛细管10分钟，然后进行分离测定。采用重力进样，进样高度10 cm，进样时间5秒，分离电压12 kV，检测波长254 nm。所有实验均在室温下进行。
[标准溶液的制备] 准确称取芦丁、槲皮素和连翘苷对照品，分别用适量乙醇溶液，使质量浓度为1.0 mg/mL，以0.45 μm滤膜过滤后备用。
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[供试样品溶液的制备] 连翘样品粉碎，过筛(200目)后，准确称取10.6010 g，加入50 mL乙醇，水浴加热回流4小时，趁热过滤，滤液稀释到50 mL，槐花样品粉碎，过筛(200目)后，准确称取1.3905 g，加入20 mL乙醇，水浴加热回流4小时，趁热过滤，滤液稀释到25 mL。所有样品溶液，以0.45 μm滤膜过滤后备用。
[样品测定] 精密吸取6份样品溶液，每份2.0 mL，以缓冲溶液定容于10 mL容量瓶中后，依上述实验条件分别测定连翘和槐花中芦丁、槲皮素和连翘苷的含量。
第七节 色谱-质谱联用技术
色谱技术分离能力强，分析速度快，检验灵敏度高，能将复杂的混合物分离成一个个纯的组分，但其对未知组分定性能力较差；而各种定性分析方法，如质谱(MS)、红外光谱(IR)、核磁共振波谱(NMR)等，具有很强的鉴定未知物结构的能力，却只能对纯组分进行定性分析，而对于复杂的混合物就无能为力了。如将色谱仪器和定性分析仪器通过特殊的―接口‖联接起来，将色谱分离后的一个个纯组分通过接口送入定性分析仪器，进行定性分析，就可以将色谱仪器的分离能力和定性分析仪器的定性分析能力结合起来，就能够实现对复杂混合物的分析。
另一方面，一种分离模式的色谱往往只能分离某些种类的化合物。面对自然界存在的成分复杂的混合物，特别是中药、中成药，有时用单一分离模式色谱无法将其组分完全分离开来。这时将不同分离模式的色谱通过特殊的接口联接起来，发挥不同分离模式色谱各自特有的分离能力，就可以将许多个成分复杂的混合物的所有组分分离开来。
当前，色谱联用技术应用开发最早、也最成熟的是色谱-质谱联用技术。气相色谱-质谱联用仪是色谱联用技术中最早商品化的仪器，现已成为一般有机分析实验室的常规分析仪器；随着电喷雾电离/大气压化学电离接口技术的成熟，以及生物大分子分析的需求，近年来液相色谱-质谱联用技术有了迅速发展，仪器也已商品化。
1 气相色谱 - 质谱联用技术
在色谱联用仪中，气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪是开发最早的色谱联用仪器。由于从气相色谱柱分离后的样品呈气态，流动相也是气体，与质谱的进样要求相匹配，最容易将这两种仪器联用。因此最早实现商品化的色谱联用仪器就是气相色谱 - 质谱联用仪。 1.1 仪器特点
不同于单纯的气相色谱仪和质谱仪，气相色谱-质谱联用仪不仅增加了接口的气路和接口真空系统，而且还要求质谱仪有较高的扫描速度。
通常气相色谱仪的色谱柱出口端为大气压力。质谱仪中样品气态分子在具有一定真空度的离子源中转化为样品气态离子。这些离子包括分子离子和其他各种碎片离子在高真空的条件下进入质量分析器。在质量扫描部件的作用下，检测器记录各种按质荷比分离不同的离子，
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其离子流强度及其随时间的变化。因此，接口装置是要把气相色谱柱流出物中的载气，尽可能多的除去，保留或浓缩待测物，使近似大气压的气流转变成适合离子化装置的粗真空，并协调色谱仪和质谱仪的工作流量。
另外，普通质谱仪一般对扫描速度要求不高。和气相色谱仪联接的质谱仪，由于气相色谱峰很窄，有的仅几秒钟时间。一个完整的色谱峰通常需要至少6个以上数据点。这样就要求质谱仪有较高的扫描速度，才能在很短的时间内完成多次全质量范围的质量扫描。 1.2 质谱仪简介
由于气相色谱仪在第三节中已做介绍，这里简要介绍中药分析中常用的电子轰击质谱仪。质谱仪器一般由真空系统、进样系统、离子源、质量分析器和计算机控制与数据处理系统(工作站)等部分组成（Fig.7）。其中联用仪的接口和色谱仪组成了质谱的进样系统。样品由色谱进样器进入色谱仪，经色谱柱分离出的各个组分依次通过接口进入质谱仪的离子源。有一些联用仪除了色谱进样外还有直接进样系统，这样还可以起到独立的质谱仪功能，可以直接进样，进行纯化合物的结构分析。
Fig.7 质谱仪器工作方框图
离子源的作用是将被分析的样品分子电离成带电的离子，并使这些离子在离子光学系统的作用下，会聚成有一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被分离。离子源的结构和性能与质谱仪的灵敏度和分辨率有密切的关系。样品分子电离的难易与其分子组成和结构有关。为了研究被测样品分子的组成和结构，就应使该样品的分子在被电离前不分解，这样电离时可以得到该样品的分子离子峰。为了使稳定性不同的样品分子在电离时都能得到分子离子的信息，就需采用不同的电离方法。由于在中药分析特别是挥发油的GC-MS分析中使用最为广泛的是电子轰击电离源(electron impact ionization source，EI)，这里就EI作一简要介绍。
利用热灯丝发射的电子被加速通过电离盒，射向阳极，此阳极用来测量电子流强度。改变灯丝与电离盒之间的电位，可以改变电离电压 (即电子能量)。当电子能量较小 (即电离电
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压较小，如7~144 eV)时，电离盒内产生的离子主要是分子离子。当加大电子能量(如电离电压加大到50~100 eV，常用70 eV)，产生的分子离子由于带有多余的能量，会部分产生断裂 (电子轰击分子产生分子离子后多余的一部分能量会使分子离子产生断裂)，成为碎片离子。虽然降低电子能量可以减少碎片离子，但电子能量太低，电离效率也降低，产生的分子离子将很少，使检测灵敏度大大降低。所以现有的标准电子轰击电离谱图(EI谱图)都是用70eV电子能量得到的。因此在用计算机用标准图谱进行检索时，电离电压必须使用70eV。
电子轰击电离的特点是稳定，操作方便，电子流强度可精密控制，电离效率高，结构简单，控温方便，所形成的离子具有较窄的动能分散，所得的质谱图是特征的，重现性好。因此，目前绝大部分有机化合物的标准质谱图都是采用电子轰击电离源得到的。由于不同结构的天然有机化合物在电子轰击质谱下都有其特异的碎片离子裂解过程，因此EI质谱图就成为鉴定天然有机化合物结构的重要手段。 1.3 在中药挥发油分析上的应用
在中药研究方面GC主要用于挥发性成份的研究，如：蒎烯、龙脑、芳樟醇、柠檬烯等，涉及的中药分用唇形科、伞形科、姜科、五加科、菊科，如干姜、淫羊霍、砂仁等；GC亦可用于中药中的其它成份的研究及测定，如对独角莲、薏苡仁油中脂肪酸的分析。
例1：辛夷挥发油的气质联用分析
水蒸汽蒸馏法提取辛夷挥发油(收油率为2.9%)，进行毛细管气相色谱分析，共分离出37个峰，以归一化法计算了各个峰的相对含量，用气相色谱 - 质谱法对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得到质谱图，经过质谱计算机数据系统检索、人工图谱解析，按各色谱峰的质谱碎片图与文献核对，查对有关质谱资料，对基峰、质荷比和相对丰度等方面进行直观比较，同时还对一些主要组分采用标准物质对照，分别对各色谱峰加以确认，综合各项分析鉴定，确定出辛夷挥发油化学成分。辛夷挥发油的主要组分是桉树脑，为辛味成分。相对含量34.81%。倍半萜烯类组分如蒎烯、茨烯、月桂烯、石竹烯、大香叶烯等，相对含量为；共从中鉴定了个成分，占挥发油总组分的以上。例2：丁香罗勒油的气质联用分析
[气质联用系统条件] HP-5(5%苯甲基硅酮)毛细管柱(0.25 mm × 30m)，载气：氦气，分流比：40: 1，流量1.0 mL/min，柱温：起始120 ℃；保持5分钟后以5 ℃/min升温至150 ℃保持7分钟，检测质荷比范围10~425，离子源温度300 ℃，倍增电压1500 eV。
[气质联用分析] 取精油0.2 μL，按气质联用条件直接进样，结果在上述条件下，从丁香罗勒油中分得42个成分，鉴定了38个成分，占全精油的97.6%。
2 液相色谱-质谱联用
液相色谱-质谱联用(LC-MS)要比气相色谱-质谱联用困难得多，主要是因为液相色谱的流动相是液体，流动相液体不能直接进入真空状态下的质谱系统内进行质量分析。因此液相
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色谱-质谱联用技术的发展比较慢，出现过各种各样的接口，但直到电喷雾电离(ESI)接口和大气压电离 (API)接口出现，才有了成熟的商品液相色谱-质谱联用仪。由于有机化合物中的80%不能气化，只能用液相色谱分离，所以LC-MS比GC-MS应用更为广泛。
LC - MS即是将化合物以液相色谱法进行分离后，将洗脱成分导入质谱检测器进行测定。但具体实现过程要解决接口技术的问题：如何去除洗脱成分所夹带的流动相，仪器的色谱部分处于常压环境，而质谱检测器内部却处于高真空状态，这两部分的界面亦成为决定仪器是否能正常工作的关键。下面介绍两种类型的离子化技术：电喷雾(electrospray) 和大气压化学离子化技术(Atmosphere pressure chemical ionization，APCI)，这是一项非常实用、高效的软离子化技术，被广大分析工作者称为LC-MS技术甚至质谱技术的革命性突破。LC-MS的关键是液态样品的离子化技术，它决定了分析测试样品的种类和分析结果的成败。 2.1 电喷雾电离
电喷雾的过程实际上是使带电液滴逐渐收缩所产生的排斥作用而从流动相中分离出(单纯的)待测组分离子的过程，这一过程亦称为离子蒸发(ion evaporation)。电喷雾一般需以气流助动而使处于较高流速流动相中的洗脱物更易于处置。如果被测组分在洗脱物中以离子形态存在，则更可提高其灵敏度。这种电离适用于可带多电荷的化合物，如蛋白质、肽、低核苷酸等，也可适用于可带电荷的小分子物质。离子化过程简单概括如下：
以一定流速进入喷口的样品溶液及液相色谱的流动相，经喷雾作用被分散成直径约为1 – 3µm的细小液滴。在喷口和毛细管入口之间设置的几千伏特的高电压的作用下，这些液滴由于表面电荷的不均匀分布和静电引力而被破碎成为更细小的液滴。在加热的干燥氮气的作用下，液滴中的溶剂被快速蒸发，直至表面电荷增大到库仑排斥力大于表面张力而爆裂，产生带电的子液滴。子液滴中的溶剂继续蒸发引起再次爆裂。此过程循环往复直至液滴表面形成很强的电场，而将离子由液滴表面排入气相中。至此，离子化过程完成。进入气相的离子在高电场和真空梯度的作用下进入玻璃毛细管，经聚焦单元聚焦，被送入质谱的质量分析器进行质谱分析。 2.2 大气压化学离子化
APCI是在气态下通过电晕放电(corona discharge)而使流动相及被测组分离子化的技术，其间涉及电荷由溶剂转移至被测物分子的过程。要求被测成分有一定的挥发性及热稳定性，较适用于中等极性、中等分子量的物质，对于非极性物质，APCI比电喷雾更适用。由于电喷雾及APCI之间的互补性，LC - MS可适用于极性由低至高、分子量较为广泛的化合物的分析。
关于APCI接口工作原理可做如下简述:
在ACPI蒸发器出口处增加了一根电晕放电针，并将其对共地点的电压设置为1200~2000 V，其功能为发射自由电子并启动后续的离子化过程。用加热干燥气体对喷雾气体加热。（由于对喷雾气体的加热以及APCI的离子化过程对流动相的组成依赖较小，故APCI
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操作中可采用组成较为简单的，含水较多的流动相。）然后放电针所产生的自由电子首先轰击空气中O2、N2、H2O产生如O2、N2、NO、H2O等初级离子，再由这些初级离子与样品分子进行质子或电子交换而使其离子化被送入质谱的质量分析器进行质谱分析。 2.3 常用的质量分析器
常用商品化的LC - MS质量分析器有四极杆和离子肼质量分析器。 (1) 四极杆质量分析器
四极杆质量分析器是由四根笔直的金属或表面镀有金属的极棒与轴线平行并等距离地排列着构成，棒的理想表面为双曲面。整体式的四极杆设计，可使四极杆的空间结构做到理想的双曲面结构。
在四极杆的x与y各两支电极上分别加上高频电压，离子从离子源出来后沿着与x,y方向垂直的z方向进入四极杆的高频电场中。这时，具有一定能量的离子(代表不同的质荷比)才能通过四极杆到达检测器，其他离子则撞到四根电极上而被―过滤‖掉。当改变高频电压的幅值或频率，也就是用电压幅或电频率扫描时，不同质荷比的离子可陆续通过四极杆而被检测器检测（Fig.8）。
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Fig.8 四极杆质量分析器示意图
1：阴极；2：电子；3：离子；4：离子源；5：检测器
四极杆质量分析器具有重量轻、体积小、造价低廉等优点，因此发展很快。由于提高了四极质量分析器的分辨率和测定质量范围，因此目前的色谱-质谱联用仪中的质谱仪大部分采用了四极杆质量分析器。 (2) 离子肼质量分析器
离子肼质量分析器的结构如Fig.9所示，环形电极和上下两个端盖电极都是绕z轴旋转的双曲线，并满足r02=2z02(r0为环型电极的最小半径，z0为两个端盖电极间的最短距离)。在环形电极和端盖电极之间加上高频电压,两端盖电极皆处地电位。与四极质量分析器类似，当高频电压的电压和频率固定为某一值时，只能使某一质荷比的离子成为肼内的稳定离子，轨道振幅保持一定大小，可长时间留在肼内；这时其他质荷比的离子为肼内的不稳定离子，轨道振幅会很快增加，直到撞击电极而消失。当在引出电极上加负电压脉冲，就可将在肼中的
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稳定离子引出，再由检测器检测。离子肼质量分析器的扫描方式和四极质量分析器相似，即在恒定的直交比下，扫描高频电压V这样就可获得质谱图。
Fig.9 离子肼质量分析器示意图
1：灯丝；2：端帽；3：环形电极；4：电子倍增管；5：计算机； 6：放大器和射频发生器（基本射频电压）； 7：放大器和射频发生器（附加射频电压）
离子肼质量分析器的特点是:结构小巧 (环形电极的最小半径r0仅为2 cm左右)，重量轻，能在极低压强下长时间储存离子。
LC-MS有广泛的应用前景，可用于紫外吸收较弱化合物的分析。对于其它检测器难以检测的化合物，LC -MS提供了一种解决问题的可能性。有些化合物很难通过HPLC与干扰物很好地分离，但LC-MS只需要检测物与干扰物存在着分子量的差异，即可获得较为准确的定量。LC-MS另一个长处在于其可提供结构方面的信息。大气压离子化(API)是一种软性离子化技术，通过产生的是分子离子。同时又可通过诱导解离碰撞(CID)产生特性离子碎片。CID发生在毛细管出口处与第—级锥孔(接口部位)之间的特定区域，被测化合物离子与氦气分子碰撞，导致其解离，从而产生离子碎片。通过调节毛细管出口处与第一级锥孔之间的电压，可选择该区域的离子能量，从而对CID加以控制。较高的离子能量可导致高能量碰撞，产生更多的碎片；而较低的离子能量产生少量碎片，而使分子离子占据较高的丰度。在定性方面，LC-MS通过分子离子峰的m/z值，给出化合物的分子量；同时通过对由CID产生的特性碎片离子的解析，可揭示化合物的结构信息，在定量方面，特征的确认性碎片离子可增加定量的专一性。
已有报道表明，运用液质联用研究了金银花复方制剂有效成分绿原酸的含量变化并初步鉴定了制剂中两个未知峰的化学成分。在液相色谱图中发现绿原酸峰相对减少，而其他两个未知峰明显增大，由于其他两峰没有对照品，故采用液质联用对其研究，初步确定为咖啡酸，异绿原酸。液相色谱条件，采用Waters Alliance HPLC为液相色谱部分，进行液相分析，即由C18高效液相色谱柱反相分离，电喷雾和大气压化学两种电离源，电喷雾流速为0.2
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mLmin-1；大气压化学电离流速为0.2 mLmin-1。在采集到的质谱图中以负电离子(M-H)-LCMS联用质量色谱图为佳，这与金银花中的有效成分绿原酸，异绿原酸，咖啡酸等均为有机酸容易失掉质子，即负离子状态较稳定，在与咖啡酸，绿原酸，异绿原酸的标准分子量进行比较中LC-MS联用质量色谱图均要减少一个质量单位。
液质联用是目前解决中药有效成分含量低、对照品少、复方配伍复杂等影响中药物质基础研究的一个有力武器，灵敏度高，适用范围广，对复杂样品提供十分有用的结构信息。 例：丹参及丹参注射液指纹图谱的HPLC-MS研究
[色谱条件] 色谱柱：Alltima C18柱(250 mm × 4.6 mm, 5µm)；流动相：甲醇-水-醋酸梯度洗脱系统；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：281nm；柱后分流0.4 mL/min进质谱仪；MS同时记录总离子流(TIC)色谱图。离子极性：ESI(-)；扫描范围：80~800；干燥气流速：10 L/min；雾化室压：40 psi；毛细管电压：4 kV；传输电压：70V。
[供试品的制备] 药材供试品的制备：取2.0 g丹参药材粉末(过40目筛)，加40 mL水，热回流2小时，滤过，取滤液20 mL，加乙醇20 mL，放置12小时，滤过，再用0.45 μm微孔滤膜滤过后作为丹参药材供试品。
[丹参注射液供试品的制备] 取丹参注射液，用0.45 μm微孔滤膜滤过后作为丹参注射液供试品。
[测试法] 取供试品各20 μL分别注入HPLC-MS联用仪进行测定。
第八节 中药分析样品的前处理
色谱分析样品的前处理过程包括了色谱分析样品的采集和制备，其中既涉及到样品中待测组分的分离，也涉及到样品中待测组分的富集。整个色谱分析的选择性和灵敏度往往取决于样品前处理效果和色谱仪器性能的高低。因此，如果样品的前处理不能够除去足够多的干扰杂质和以高回收率富集待测组分，就必须使用灵敏度高、测定范围宽的检测器和分离效率高的分离柱，才能达到色谱分析要求的选择性和灵敏度。如果样品前处理比较成功，即使色谱分析时使用灵敏度不高的检测器和分离效率较低的分离柱，也能获得很好的色谱分析结果。
色谱样品的前处理过程是一个非常耗时、繁琐和容易引入分析测定误差的过程。现代仪器分析的灵敏度、测定精度和分析测定的自动化程度越来越高，这就对样品前处理技术的要求也越来越高，耗时、费力和效率低的色谱样品前处理过程已经成为色谱分析整个过程的瓶颈。近年来，许多传统的样品前处理方法和技术得到了进一步改进，新的处理方法和技术也相继出现，快速、有效、简单的色谱分析样品处理方法和技术是我们分析工作者的研究目标。
色谱分析样品处理技术主要包括:采样技术和采样后的色谱分析样品制备技术。如对样品中的待测组分进行预分离、浓缩 (富集)、纯化、衍生化等，将采集的样品转化成适合于各种色谱分析测定的形态。随着科学技术的发展，需要色谱分析的样品种类越来越多，待测
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组分的含量越来越低，这就对色谱分析样品的采集方法和分析样品的制备方法提出了新的更高的要求。目前，新的样品制备技术不断出现，诸如:气体萃取技术 (顶空技术)、膜萃取技术、固相萃取技术、微捕集技术、微波提取技术、超临界萃取技术、固相微萃取技术、微透析技术、微量衍生化技术等等。此外，已有技术的联用或者两种或数种处理方法的组合用于组成非常复杂的样品，如中药、中成药的分析。
在中药样品的处理过程中，分析样品的制备往往是由色谱工作者完成，而中药材、中药分析样品的采集通常不是由分析人员去做的，是由其他研究人员去做的。但是，我们应该对药材的产地、中药原料药的来源和采集的方法和采集过程应该有所了解，这样我们可以根据可能含有的杂质干扰或中成药生产过程中产生的特异杂质，选择适当的样品前处理方法并对色谱分析的结果的准确性、精密性做出正确的评价。 1 前处理方法的选择
样品处理的好坏直接影响色谱分析的最终结果，好的样品制备方法及其技术不但能最大限度地发挥现代色谱仪器的分析测定功能，而且利用这些技术同样也提高了用色谱仪器测定各种样品的综合分析能力。目前，色谱分析样品制备方法正处在多种处理技术并存、已有的技术和新开发出来的技术不断组合的局面下，其目的和结果就是要实现快速、有效、简单和自动地完成分析样品制备过程。现代色谱分析样品制备技术的发展趋势就是处理样品的过程要简单、处理速度要快、使用装置要小、引进的误差要小、对待测定组分的选择性和回收率要高。
根据所需采集的原始样品和样品基体的性质、所要获得的信息(分析测试的目的)、允许的分析时间和色谱仪器对所分析样品的要求等，决定样品的采集和制备方法及其程序。某些样品(或者粗产品)由于浓度含量较高，可以直接取其一部分母体物质，直接进行色谱分析即可获得满意的结果，而无需预先进行待测组分的分离和浓缩。但是，大部分的原始样品不适合色谱仪器直接分析测定，需要对原始样品进行一些处理，制备成适合于色谱仪器分析的样品。很明显，用色谱仪器对这些通过一系列处理后制备的样品进行定性和定量分析，其结果的可靠性和准确性将取决于这些处理过程是否会将待测组分丢失或使待测组分发生一些不可预测的变化。满意的定性和定量结果，需要严格而周密的分离和富集方法，如果样品处理过分粗糙，可能会导致样品中待测组分质的变化或损失，同样会影响定量的误差，使色谱分析的定性和定量结果不准确。另外，某些样品中的某种组分会对色谱分析样品中共存的其它待测组分产生测定干扰，这样就必须预先分离和除去干扰物，才能完成准确的色谱测定。在许多情况下，可以提供给分析人员的样品量 (体积)很少(或者很有限)，而且，样品中待测组分具有较大的不稳定性 (或者化学活性)，需要经过样品制备才能获得可靠的测定结果，因此，选择和制定周密的样品处理程序和完成准确无误的操作是非常重要的。
由于采用色谱分析的目的不同，诸如痕量分析、物质组成的定性分析、多组分体系中的选择分析、纯度分析、定位分析和结构分析等，使用的样品制备方法和技术也不相同。气相
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色谱通常采用的样品处理技术有气体萃取、溶剂萃取、固相萃取、超临界萃取、衍生化、膜分离、蒸馏、吸附等技术；液相色谱通常采用的样品处理技术有溶剂萃取、固相萃取、衍生化、微透析、蒸馏等技术。
传统的中药供试样品制备方法有利用有效成分或组分在互不相溶两相的分配系数不同进行分离的液-液萃取、用于提取中草药挥发油的水蒸气蒸馏、用各种不同极性有机溶剂加热回流和索氏提取器提取法，以及超声波提取法等。
近年来，出现了下列几种新的样品前处理技术： 2 固相萃取
固相萃取(solid-phase extraction, SPE)是近些年发展起来的一种样品预处理技术，是以液相色谱分类机理为基础发展起来的分离和纯化方法。固相萃取的优点：（1）安全性，可以避免使用毒性较强或易燃的溶剂；（2）不会发生传统萃取中的乳化问题，萃取回收率高，重现性好；（3）操作简便、快速，可以同时进行批量样品的预处理；（4）可以选择的固相萃取填料种类多，应用范围广，易于实现自动化。
中国药典2000年版与1995年版相比，应用固相萃取进行定性与定量所使用的次数增长、且所使用的固定相种类更丰富、被测成分的种类更多，可以看出固相萃取法在中药分析中，其应用和发展前景十分广阔。 2.1 固相萃取剂的种类
(1) 吸附剂 氧化铝、硅胶等是传统的吸附剂，一直用于样品的预处理。其作用机制是溶质在吸附剂表面的吸附作用。样品多溶于己烷、甲苯、二氯甲烷等有机溶剂。非极性或小极性杂质先出柱，用适当极性的溶剂洗脱待分离组分，强极性杂质仍吸附在柱上。新型的吸附剂如多孔碳、石墨碳是典型的非极性吸附剂，适用于醇、酮、醛等的富集。
(2) 高分子大孔树脂 能用于痕量组分的富集和样品纯化。如X-5树脂是一种新型的国产非极性高分子大孔吸附树脂，吸附量大，适用范围广。
(3) 离子交换树脂 将各种形式的离子交换树脂引入聚四氟乙烯（PTFE）薄膜，得到固相萃取剂。可用于除去样品中金属离子，常用于萃取样品溶液中可离解的化合物。
(4) 键合硅胶 与HPLC中的键合硅胶固定相类似，平均粒度较大（30~60μm）。种类很多，弱极性或非极性基团：C1，C2，C8，C18，环己烷，苯基等；极性基团：-NH2，-OH，-CN等；离子性基团：-COOH，-SO3H等。 2.2 固相萃取的作用机理
固相萃取中溶质与键合硅胶固相萃取剂间的作用机制大致可以分为非极性作用、极性作用、离子作用和共价作用。这些作用决定固相萃取的选择性。固相萃取是色谱分离的过程，但是，固相萃取跟通常的色谱，例如薄层、高效液相、气相色谱相比，更突出强调的是―开关‖的性能，是一种对不同成分有不同选择性的―开关式‖色谱，可以选择性地―关闭‖某些组分，同时对另外的一些组分则可以完全开通，从而除去干扰物，纯化、浓缩所需要的某些组
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分；而通常的色谱主要是连续色谱，组分分离的是按一定的顺序连续洗脱出来。
与色谱的分离机理一样，固相萃取也分为以下几种洗脱方式：
(1) 正相色谱方式，极性小的组分先被洗脱，随着流动相极性的加大，被洗脱的组分极性也越来越大，滞留在固定相上的组分．是极性最大的组分；固态上样的方式，多属于正相色谱；如大黄素HPLC测定，前处理用硅胶吸附固态上样，然后用低极性溶剂洗脱大黄素与大黄酚。硅胶上滞留的组分极性大，这与大家所熟知大黄素的薄层色谱相似，分离度不受原点上大极性组分影响。
(2) 反相色谱方式，则极性大的组分先被洗脱下来，极性小的组分被固定相吸附。上样溶液极性最大，洗脱液的变换极性递减。
(3) 极性大的成分，如酸性或碱性物质，可以通过调节pH值来调控其保留行为。 (4) 离子交换方式：保留机理是离子作用，固定相带有正或负电荷(通常分为阴离子或阳离子两类交换相)，当分析组分带有与固定相相反的电荷时，就会发生离子间相互作用，通过调节洗脱剂pH、离子强度、反离子强度这三个主要参数来调节保留或洗脱。 2.3 固相萃取的模式
(1) 固定相吸附杂质，而待测成分完全不被保留，供试液得以除杂纯化；
(2) 固定相吸附待测成分，而杂质不被保留，洗去杂质后换强溶剂将待测成分洗脱； (3) 固定相吸附待测成分，而部分杂质不被保留，洗去该部分杂质后，换强溶剂将待测成分洗脱，而作用更强的另一部分杂质仍然保留在固定相上。 2.4 常用固定相与装置
常用固定相填料有：C18、C8、C2、C1、苯基、氰基、氨基等硅胶键合相，硅胶、硅藻土、聚酰胺、氧化铝(中酸碱)等吸附剂，还有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、苯乙烯乙烯基苯(SOVB)聚合物等。
常见装置是一种小玻璃柱，在形状上有针头形、针筒状、片状等；管体、筛板材料有：聚丙烯、聚乙烯、特氟龙、不锈钢。以玻璃为管体、PTFE为筛板，可有效消除增塑剂(苯二甲酸盐)的污染、适合在此方面有特殊要求的样品；填料装量一般为100mg~lg。市售商品小柱的填料粒度细，吸附效率高，但是，由于其填装量一般不大于1g，相对于成分复杂的中药，吸附总容量还是太低。因此，在中药分析中仍较多地根据需要自行填装，从数克到数十克。 2.5 应用
例：固相萃取-反相高效液相色谱法测定地钱中的芹菜素
[色谱条件] 色谱柱：Kromasil C18柱 (250 mm × 4.6 mm i.d，5 μm)；流动相为乙酸-甲醇-乙腈-磷酸-水（10: 200: 100: 10: 200）；流速0.60 mL/min，检测波长350 nm；柱温25 ℃；进样量6.0 μL(自动进样)。
[对照品溶液的制备] 精密称取芹菜素对照品0.0100 g，置250 mL容量瓶中，加甲醇约60 mL，微热溶解，冷却室温，加少量冰醋酸，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为40.00 mg/L
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的对照品溶液。
[供试品溶液的制备] 取粉碎后的地钱干燥品约20 g，精密称定，80％乙醇100 mL 70℃下回流提取0.5小时，重复3次，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，蒸干，加20mL甲醇溶解，拌入处理后的硅胶30 g，水浴60 ℃缓慢加热，挥发去溶剂，蒸干，干法装于固相萃取小柱中，先用100 mL氯仿-甲醇（25∶12）混合液萃取，再用100 mL氯仿-甲醇(25: 20)混合液萃取，收集后者的萃取液，减压蒸馏，浓缩至50 mL即得地钱黄酮提取物的供试品溶液。
[线性关系考察] 取芹菜素对照品贮备液适量，用流动相稀释，制成质量浓度(mg/L)分别为1.60、3.20、6.40、8.00、9.60和12.80的对照品溶液，依次进样测定，以质量浓度c (mg/L)为横坐标，峰面积响应A(mVs)为纵坐标，得回归方程A = 1.013×10c-5.448×10，r = 0.9995，表明在1.60~12.80 mg/L浓度范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系。
3 超临界流体萃取
超临界流体萃取 (supercritical-fluid extraction, SFE)是上世纪70年代开始用于工业生产中有机化合物萃取的，它是用超临界流体作为萃取剂，从化学组成复杂的样品中，把所需要的组分分离提取、制备成适合于色谱分析的样品的一种分离提取技术。其中超临界CO2是最常用的一种超临界流体。用超临界CO2萃取天然产物，具有较佳的提取、分离效能，并具有集提取、分离、浓缩为一体、整体操作成本低、无残留溶剂、无污染、节约能源、操作简便等优点，国内外已应用于食品、香料、石油、化工、医药工业等领域。用超临界CO2作溶剂，以取代传统的溶剂提取方法正在普遍受到中药研究工作者的重视。 3.1 基本原理
超临界流体是介于气体和液体之间的一种非气态，又非液态的物质。这种物态只能存在于温度和压力都超过其临界点的情况下。 超临界流体的性质，如密度、粘度和扩散度等，都处于气体和液体之间。超临界流体的密度与液体相近，大致是气体的100 - 1000倍，因此超临界流体的分子间作用力比气体强，它与溶质分子的作用力也很强，与液体一样，很容易溶解其他物质；另一方面超临界流体的粘度即使在40 MPa下也只略高于气体，溶质在超临界流体中的扩散系数比在液体中大的多，传质速率很高，这也有利于物质在超临界流体中的溶解。同时超临界流体的表面张力很小，很容易渗透到样品基质内，并能保持较高的流速。温度略高于临界点时，超临界流体的压缩系数最大，压力的微小变化就能导致较大的密度变化，控制密度就可以控制超临界流体对溶质的溶剂能力，因此同一超临界流体在不同温度和压力下能萃取极性或分子大小都不同的化合物。 3.2 超临界流体的特性
当超临界流体的温度略高于临界温度时，超临界流体的压缩系数最大，此时压力的微小变化，就能导致它的密度的变化，调节压力就可以控制它的密度，就可以控制它对溶质的溶解能力。这样在稍高于临界温度的情况下，改变超临界流体的压力，就可以把样品中的不同
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组分按它们在超临界流体中的溶解度大小不同而先后提取出来。在低压下溶解度大的组分先萃取，随着压力增加，难溶成分逐渐与基体分离而被萃取。所以利用程序升压，超临界流体不但可以从复杂样品中萃取各种组分，而且也可以使这些组分得到初步的分离。
温度的变化也可以改变超临界流体的萃取能力。这是由于随温度变化超临界流体的密度和被萃取溶质的蒸气压都在改变。这主要取决于在高温下被萃取组分的蒸气压变化而导致溶解度的增加。当温度升高，进入高温区时，虽然温度升高，流体的密度仍在降低，但此时被萃取的溶质的蒸气压升高迅速，挥发度提高，这时的萃取能力不会下降，而有增加的趋势。
根据上述压力和温度对超临界流体萃取能力的影响，针对被萃取溶质的极性和分子大小，可以选择一个最佳的温度和压力来进行萃取。
除温度和压力外，在超临界流体中加入少量其他溶剂也可改变它对被萃取溶质的溶解能力。通常加入量不超过10%，而且以极性溶剂，如甲醇、异丙醇居多。少量其他溶剂的加入，可使超临界萃取技术的使用范围进一步扩大到极性较大的化合物。 3.3 超临界流体萃取的分类
超临界流体萃取具有速度快、萃取效率高、节省溶剂的特点，易于自动化，能与色谱、光谱等仪器连用。超临界流体萃取可以离线操作也可以在线操作，前者比较简单，但当样品有限，需要高灵敏度检测时最好采用在线超临界流体萃取。
超临界流体萃取可以分为动态和静态萃取。动态超临界流体萃取是连续不断的用超临界流体冲洗样品，流速一般控制在0.1~4 mL/min，需要仔细选择最佳流速。通过改变温度和压力改变流体密度，从而对样品实现组分分馏。此法可以用于离线操作，也可以用于在线操作。静态超临界流体萃取不如动态应用广泛，但在溶解度测定和动态超临界流体萃取条件的选择时非常有用。 3.4 应用
由于高效、快速、后处理简单等原因，超临界流体萃取作为色谱样品的制备方法具有经典方法无法比拟的优点，它可以缩短处理时间1~2个数量级，避免使用大量溶剂，降低对样品污染的可能性，特别适合于生物、中药等方面的组成复杂、组分易变的样品，广泛用于从各种香料、草本植物、中草药中提取有效成分。其中，中药、中药材中挥发油测定时，传统的水蒸气蒸馏法存在出油率低、提取温度高和时间长等问题，采用超临界萃取能达到提取率高、时间短和成分不易分解等优点。例如从柴胡中提取柴胡挥发油来制成柴胡注射液。传统的水蒸气蒸馏柴胡挥发油需12小时，得到得率为0.2%左右的淡黄色的柴胡油，而用超临界二氧化碳萃取4小时即能得到黄褐色的得率为1.8%左右的柴胡油，提高了8倍，可见用超临界二氧化碳萃取优势十分明显。这主要得益于超临界二氧化碳对脂溶性成分的高溶解率、高渗透性、高传质速率，且在萃取过程中损失极少，萃取温度不高，最大限度地保留了原有物质的特性。
例：超临界流体萃取(SFE)-气相色谱法测定丁香药材中丁香酚的含量
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[色谱条件] 气化温度250 ℃，检测器温度270 ℃，柱温160 ℃，载气N2，柱头压55 kPa，分流比100:1，内标为麝香草酚，进样量1 μL。
[对照品溶液的制备] 精密取丁香酚适量，用醋酸乙酯配成浓度为4.87 mg/mL的标准溶液。 [SFE萃取液的制备] 精密称取粉碎后过100目筛的丁香药材样品提取粉末100 mg，置萃取池中，按最佳萃取条件操作，用适量醋酸乙酯吸收，精密取内标溶液0.5 mL，定容至10 mL备用。
[超声溶剂法萃取液的制备] 精密取上述粉末100 mg，加入适量醋酸乙酯，超声提取60分钟，冷却至室温后精确加入内标溶液0.5 mL，以乙酸乙酯定容到10 mL量瓶中。
[索氏提取法萃取液的制备] 精密取上述粉末0.5 g，置50 mL索氏提取器中，加醋酸乙酯75 mL，水浴加热提取6小时，过滤，滤液置100 mL量瓶中，用乙醇清洗残渣，精密加入内标溶液5 mL，加醋酸乙酯至刻度，备用。
[线性关系考察] 分取标准液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mL于10 mL量瓶中，加入内标溶液0.5 mL，稀释至刻度，进行气相色谱分析。以峰面积比(Y)对含量(X，ng)作回归计算，得回归方程：Y = 2.153X + 1.526×10-4，r = 0.9999，线性范围48.7~584.4 ng。
[测定法] 取提取液各进样1μL，测定结果为：SFE为(137.2 ± 3.2) mg/mL，超声波提取为(118.4 ± 1.9) mg/mL，索氏提取121.6 ± 3.9 mg/mL，后两种提取方法与SFE相比较，P<0.05，P<0.01。以SFE为样品前处理手段，整个分析过程在20分钟内即可完成，因此，该方法优于索氏提取方法和超声波提取方法。
4 膜分离
膜分离技术是利用天然或人工合成的、具有选择透过性的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分体系进行分离、分级、提纯或富集的技术。
膜在挥发性有机物的分离和在GC和MS分析样品制备中的应用研究越来越多，发展也越来越快。至今，应用膜分离技术或者膜与其他分离技术的联用已经成功地完成了许多种类样品的基体分离和浓缩，包括各种气体和蒸汽样品、多水和液体样品、某些固体样品等等。膜分离技术不但可以进行挥发性物质的分离和浓缩，而且可以进行半挥发性的或者不挥发性的物质的分离和浓缩。目前，已经在样品分析仪器的市场上出现了多种形式的应用膜分离技术的产品，诸如：膜直接引进装置、膜萃取-微捕集串联装置、膜-质谱联用仪器等。由于膜分离技术具有装置结构简单、操作程序方便、无需有机溶剂处理、可与各种分析仪器直接连接，易于实现自动化操作和在线在场操作等，所以膜分离技术的应用涉及了分析领域中几乎所有的方面，并且取得了引人注目的成果。诸如：环境保护监测、生物分析、材料性能测定、工业卫生调查和评价、食品品质分析、医疗诊断、化妆品和香料组成分析、商品质量检验等行业。膜分离技术与现代分析仪器的结合仍然可以完成大量的分析测试工作，成为最具竞争力的分析样品制备方法和技术之一。
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中药的化学成分非常复杂，通常含有无机盐、生物碱、氨基酸和有机酸、酚类、酮类、皂苷、甾族和萜类化台物以及蛋白质、多糖、淀粉、纤维素等，其相对分子质量从几十到几百万道尔顿。一般来讲，高相对分子质量物质主要是胶体和纤维素等非药效成分或药效较低的成分，药物有效部位的相对分子质量一般较小，仅有几百到几千道尔顿。因此，对中药的有效部位和有效成分进行分离和纯化时，利用具有一定孔径的膜可以有选择性地将待测组分分离出来，可以高效率地达到去除干扰杂质、保证色谱分析的快速和准确。由于膜分离对中草药提取液的浓缩及其有效成分分离具有不存在相转换，操作条件温和，分离效率高，不必添加化学试剂，不损坏热敏感物质，并且能提高有效成分的提取含量，所以膜分离在中草药有效成分提取中有着传统法无可比拟的优势。
近年来，由于制膜工艺和技术的提高，各种性能优异的新型膜材料不断问世，加速了膜分离技术在化工、生物、环境和医药领域的应用。不同的膜材料对不同的物质具有特征的选择分离性质。聚二甲基硅氧膜对许多极性化合物和苯系物具有选择分离作用，常用来分离样品中的挥发性有机物。聚四氟乙烯膜对某些半挥发性物质具有选择分离作用。超滤膜的膜材料为聚丙烯腈(PAN)、聚醚酮、聚砜、聚酰胺、聚偏氟乙烯等。由于中药成分中胶质等粘性物质的含量很高，膜的污染现象较为严重，因此最好采用抗污染性较好的膜材料如聚丙烯腈、磺化聚砜膜等。
有报道表明，采用改性PVA作为分离膜从麻黄和黄连水提液中提取分离生物碱，麻黄草水提液膜分离后为一无色溶液，经纸层析实验表明该溶液几乎为纯净的麻黄碱溶液。
同时，利用膜技术进行中药样品前处理时，虽然很大程度上滤掉了大分子杂质，但也应注意回收率的问题。有人考察了大孔树脂吸附与超滤(纤维素膜，截留分子量100 000和10000)联用精制技术对六味地黄丸有效成分的影响，经高效液相色谱法测定其中马钱素及丹皮酚含量，结果精制的提取物重量只有原药材的4.6％，而98％的丹皮酚与86％的马钱素被保留。可以看出，这种精制技术用做丹皮酚测定，样品的前处理还适合，但对于马钱素，回收率则偏低。因此选择适当的滤过膜，既能最大限度地去除干扰杂质，又能保持良好的样品回收率是至关重要的。
例：水醇法与膜分离法精制含山茱萸中药制剂的比较
[供试品溶液的制备] 按―抗厥注射液‖处方称取一定量的药材，进行煎煮、过滤。合并滤液，一分为二，一份按中药制剂常规进行不同浓度的乙醇沉淀实验；另一份以膜分离法进行处理。其中样品B0为未做澄清处理的复方药液，样品Bl至B5为分别以40％~80％乙醇沉淀处理的复方药液；样品Bml~Bm3分别为以0.25 μm陶瓷微滤膜、截留分子量为1万和1千的超滤膜处理的复方药液。
单味山茱萸样品液制备法同上，其中样品A0为未做澄清处理的单味药液，样品Al至A5
分别以40％~80％乙醇沉淀处理的单昧药液；样品Aml~Am3分别为以0.25μm陶瓷微滤膜、截留分子量为l万和1千的超滤膜处理的单昧药液。Bm‖~Bm3‖分别为经不同膜处理的截留液。
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上述各样品液均调整为相同浓度(原药材 g/mL)。
结果表明，用无机陶瓷微滤膜处理药液，其澄清效果相当于40％乙醇浓度处理，与50~70％醇浓度处理效果相当的超滤膜截留分子在10000~1000之间；膜分离方法对中药药液中的糖类杂质(多糖、糖蛋白等)的去除比醇沉法更有效。
实验表明，截留分子量为10000的超滤膜对马钱素(分子量为384)无明显影响，但截留分子量为1000的膜使马钱素损失50％左右。
第九节 基于各项色谱技术的中药质量控制思路
以各类色谱技术为基础手段，应用最新的系统生物学和组学研究策略及现代高效率的色谱联用分析技术进行中药药效物质组学研究，即应用能反映生物体整体特征的代谢组学的策略进行中药药效物质的三维研究 - 研究中药化学成分谱、中药的代谢物谱和机体内源性代谢物谱及它们之间的关系，以发现和阐明在中药材中有药效作用的活性分子群，实现中药药效物质基础与作用机制研究的一体化。
按照这一研究思路，利用超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC－MS) 对有抗骨质疏松作用的补肾中药淫羊藿的药效物质组学进行了初步研究。通过比较大鼠的空白血清、淫羊藿药材及灌胃淫羊藿提取物后的大鼠血清的HPLC－MS图谱，发现淫羊藿苷、朝藿定C、淫羊藿次苷和2″-O-鼠李糖基-淫羊藿次苷是进入血清内的淫羊藿活性成分。同样对大鼠空白尿样及灌胃后尿样进行分析，发现尿中有淫羊藿苷-3-O-鼠李糖基-7-葡萄糖醛酸苷，由此推测淫羊藿苷、朝藿定C 可能为淫羊藿药材的药效物质。进而对大鼠体内基础代谢物谱、肾阳虚大鼠代谢物谱及给药淫羊藿后大鼠体内代谢物谱进行比较研究，寻找与肾阳虚大鼠相关的生物标记物，发现给予淫羊藿后使肾阳虚大鼠代谢网络的不正常部分得以恢复，由此从全方位、深层次地探讨淫羊藿补肾作用的机制及药效物质。
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对照组 用中药组 中药 色谱技术 色谱技术 基础代谢物谱 内源代谢物谱变化 进入体内化学成分 及代谢物谱 化学成分谱 作用机制、潜在毒性 可能的药效物质 药效物质及作用机制 质量标准及质量控制
图 基于各项色谱技术的中药质量控制思路
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