七种水蛭组织细胞可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析

汪波;张彬;龚元;于翔;吕军仪

【摘 要】The histiocyte soluble proteins of seven leeches in China were analyzed through SDS-PAGE. The results showed that the seven leech species shared most of the soluble proteins components of histiocyte; while a few differences existed. Hirudo nipponia Whitman had the largest number of protein bands of 28. There were more protein bands of blood-sucking leeches than that of non-bloodsucking leeches. No significant difference was detected among the histiocyte soluble proteins components of H. numillensis Lesson from three different areas. It was proved that SDS-PAGE could be used for classification and identification of leeches of different varieties, geographic distribution and food habit at the molecular level, and it accumulated data base of biologicalproperty.%采用垂直平板十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对我国7种常见水蛭的组织细胞可溶性蛋白成分进行电泳图谱特性分析.结果表明,7种水蛭组织细胞中可溶性蛋白的SDS-PAGE图谱中多数条带相同,但也存在差异.其中日本医蛭(Hirudo nipponia Whitman)蛋白条带最多,达28个,并且吸血蛭类的蛋白条数要明显大于非吸血蛭类,而3种不同地理分布的菲牛蛭(Hirudinaria manillensis Lesson)间表达蛋白图谱无明显差异.该研究为在分子水平分析我国水蛭不同种类、同种不同地理分布及不同食性间的差异积累了新的生物学数据,对其分类和药材鉴别提供了参考依据.

【期刊名称】《湖北农业科学》

【年(卷),期】2011(050)016 【总页数】3页(P3423-3425)

【关键词】水蛭;可溶性蛋白;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 【作 者】汪波;张彬;龚元;于翔;吕军仪

【作者单位】北京师范大学珠海分校,广东珠海519085;广西水产研究所,南宁530021;荆州市民康生物科技公司,湖北荆州434300;辽宁省淡水水产科学研究院,辽宁辽阳111000;中山大学生命科学学院,广州510275 【正文语种】中 文 【中图分类】Q503

水蛭具有医用价值，其药效在《神农本草经》中就有记载，它有破血、逐瘀、通经的功效，主要用于治疗瘤症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤［1］。水蛭种类繁多，全世界记载命名的有680多种，其中我国有记录的蛭类就达 100余种［2，3］。我国有医用价值的蛭类主要集中在医蛭形亚目的医蛭科、黄蛭科和山蛭科［1，4］。 我国最新药典（2010 年版）规定的药用水蛭有3种：蚂蟥 （学名宽体金线蛭，Whitmania pigra Whitman）、柳叶蚂蟥 （学名尖细金线蛭，Whitmania acranulata Whitman）、 水蛭 （学名日本医蛭，Hiruao nipponia Whitman），它们分属于黄蛭科和医蛭科［5］。在国内水蛭药材市场，一般通过形态学特征加以鉴定，易造成人为的误判，因此有必要通过理化和分子手段来进行水蛭药材的辅助鉴别。目前，有通过薄层层析和蛋白电泳方法来对历版药典收录的3种水蛭炮制品进行鉴别的报道［6－8］，而针对水蛭活体的鉴别研究仅有关于日本医蛭和

天目山蛭（Haemadipsa tianmushan Song）4 种同工酶蛋白电泳比较研究的报道［9］。试验采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）技术对我国7种不同食性和地理分布的水蛭活体组织细胞可溶性蛋白表达特征及差异进行了分析，为水蛭资源分析、种类鉴定和种类间遗传多样性分析提供一定参考。 1 材料与方法 1.1 试验材料

宽体金线蛭和光润金线蛭 （Whitmania laevis Baird）产于江苏省宿迁市，尖细金线蛭产于山东省鱼台县，日本医蛭产于湖北省公安县，3种野生菲牛蛭（HirudinariamAnillensis Lesson）分别产于广东省清远市、广西壮族自治区钦州市和海南省琼中县。 1.2 试验试剂

丙烯酰胺、N，N－亚甲基双丙烯酰胺、SDS和β－巯基乙醇等购自 Sigma 公司；过硫酸铵、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）、Tris碱、溴酚蓝、冰醋酸和考马斯亮蓝R－250等购自广州威佳生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。 1.3 蛋白样品制备及纯化

①活体水蛭低温处死后将其肠道翻出，用去离子水洗净内容物，把组织剪切成细小的碎末，用研钵在液氮条件下将样品研磨成细粉末状［9］；②取适量RIPA裂解液，在使用前数分钟内加入苯甲基磺酰氟（PMSF），使其最终浓度为 1 mmol／L；按每 20 mg组织加入150～250μL裂解液的比例加入裂解液；③用玻璃匀浆器匀浆至充分裂解后，将组织悬液在4℃，8000 r／min离心10min；④小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心后的上清液，在4℃，15000 r／min离心10min；⑤吸取离心的上清液，分装于1.5mL的离心管，即为电泳样品，置于－80℃下保存；用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

1.4 水蛭组织细胞可溶性蛋白组分SDS－PAGE电泳

电源为 Bio－Rad Fireware Version 1.07 PowerpacTM HC，电泳槽为Mini PROTEAN 3 Cell 600VDC。配制3%浓缩胶和10%分离胶，每孔加样25μL。先以80 V恒压10min电泳至分离胶，再调为180 V恒压50min到电泳结束；将聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝染色液染色4 h；倾去染色液，加入脱色液，缓慢摇动脱色，直至获得蓝色条带及干净的背景［10］。 1.5 凝胶图像分析

分析软件为上海天能科技有限公司GIS凝胶图像处理系统 Version 4.0。 2 结果与分析

7种常见水蛭组织细胞可溶性蛋白SDS－PAGE电泳图谱及分析结果如图1和图2所示。图1显示7种水蛭的电泳图谱总体相似度较高，但在蛋白条带数目、迁移距离、浓度等方面存在差异，分离出的蛋白组分数目从19条至28条不等。获得的蛋白条带数目大小依次为：日本医蛭＞菲牛蛭＞光润金线蛭＞宽体金线蛭＞尖细金线蛭；其中，日本医蛭的蛋白组分数量最多，达28条，与其他种类差异明显；而不同地理分布的3种菲牛蛭（广东菲牛蛭、广西菲牛蛭、海南菲牛蛭）间无明显差异。

根据分子量标准蛋白及各蛋白条带的电泳迁移率，通过GIS凝胶图像处理软件分析，结果表明在 66.2～97.4 ku 范围内，7 种水蛭的蛋白电泳图谱基本一致；在 14.4～31.0 ku 范围内，广东菲牛蛭、广西菲牛蛭、海南菲牛蛭3者之间基本一致，而与其他种类存在明显差别。相同食性的吸血类水蛭日本医蛭和菲牛蛭蛋白组分条带最多，而非吸血类的光润金线蛭、宽体金线蛭和尖细金线蛭蛋白组分条带较少，统计分析结果表明吸血蛭类和非吸血蛭类的蛋白表达存在明显差异。

图1 7种水蛭可溶性蛋白组分SDS－PAGE垂直电泳图谱1.分子质量标记；2.光润金线蛭；3.广东菲牛蛭；4.海南菲牛蛭；5.广西菲牛蛭；6.尖细金线蛭；7.日本医

蛭；8.宽体金线蛭

图2 7种水蛭可溶性蛋白组分SDS－PAGE图谱分析1.分子质量标记；2.光润金线蛭；3.广东菲牛蛭；4.海南菲牛蛭；5.广西菲牛蛭；6.尖细金线蛭；7.日本医蛭；8.宽体金线蛭 3 讨论

根据动物组织、细胞中普遍含有受遗传基因控制的蛋白组分且具有种的特异性和稳定性的特点推断，不同物种的蛋白质电泳指纹图谱必定存在差异，以蛋白质为指标，可以从蛋白水平上进行分类［10］。聚丙烯酰胺凝胶电泳技术作为一种蛋白分析技术，具有操作简单、快速准确、成本低且直观性强的优点，适合普及推广应用［11］。

研究通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术比较不同种或同种不同地理分布的水蛭间活体组织细胞可溶性蛋白组成的差异，结果表明SDS－PAGE能初步反映不同种类、不同食性水蛭组织细胞可溶性蛋白质的表达差异。蛋白质既是由基因决定的，也是基因的产物，作为遗传特征是可靠的 ［10］。因此应用SDS－PAGE分离不同水蛭可溶性蛋白质的方法对于其分类和药材鉴别具有参考价值，尤其对在形态上不易区分的种间鉴别具有重要作用。

有学者认为应用电泳和薄层色谱等生化和分子生物学技术于动物分类学中，可为其形态分类增加客观标准［12］。研究中分析的3种不同地域分布的菲牛蛭电泳图谱无明显差异，而相同食性的日本医蛭和3种菲牛蛭则有明显差异，这一结果支持了形态分类确定的3种菲牛蛭为同一个种而菲牛蛭与日本医蛭非同种的见解［7］。同时结果表明吸血蛭类和非吸血蛭类的蛋白组分差异大，而3种非吸血蛭类间差异略有减少，这与传统的形态学分类是相一致的，也说明采用蛋白电泳来探讨种间在进化上的亲缘关系是一个很有效的手段［12］。可见，采用电泳技术分离7种水蛭活体组织细胞可溶性蛋白组分，不仅有助于了解其蛋白组分及含量，

而且在生化分类学上也有一定的参考价值［9，12］，在以后的研究中可采用更为精确和客观的二维蛋白电泳技术对所获得的差异蛋白质更细致深入地分析［13］。 参考文献:

［1］杨 潼.中国动物志［M］.北京：科学出版社，1996.

［2］刘岱岳，余传隆，刘鹊华.生物毒素开发与利用［M］.北京：化学工业出版社，2007.

［3］SKET B，TRONTELJ P.Global diversity of leeches （Hirudinea）in freshwater［J］.Hydrobiologia，2008，595：129－137. ［4］宋大祥，冯钟琪.蚂蟥［M］.北京：科学出版社，1978.

［5］中华人民共和国药典委员会.中国药典：一部［M］.北京：化学工业出版社，2010.

［6］江佩芬，卢建秋，王宝华.水蛭蛋白电泳鉴别研究［J］.中国医药学报，1994，9（6）：54.

［7］丁家欣，张秋海，欧兴长，等.三种水蛭的薄层色谱与电泳法鉴别［J］.中药材，1994，17（11）：19－20.

［8］袁晓环，王春涛，王晓东.水蛭药材的鉴别［J］.牡丹江医学院学报，2007，28（3）：81－82.

［9］罗媛媛，姜乃澄.日本医蛭和天目山蛭4种同工酶的比较研究［J］.浙江大学学报（理学版），2002，29（1）：99－102.

［10］林加涵，魏文铃，彭宣宪.现代生物学实验（下册）［M］.北京：高等教育出版社，2001.

［11］郭尧君.蛋白质电泳实验技术［M］.第二版.北京：科学出版社，1999. ［12］罗 雅，潘夕观，王凤临，等.薄层等电聚焦电泳技术应用于山蛭的分类研究［J］.动物学研究，1988，9（3）：284－300.

［13］BASKOVA1 I P，ZAVALOVA L L，BASANOVAL A V，et al.Protein profiling of the medicinal leech salivary gland secretion by proteomic analytical methods ［J］.Biochemistry（Moscow），2004，69（7）：770－775.