未来15年5大生物技术前沿技术

摘要：生物技术和生命科学将成为21世纪引发新科技GM的重要推动力量。 关键字：靶标发现技术 新一代工业生物技术 生物芯片 生物柴油

国务院日前发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》(以下简称《纲要》)中提出了五项生物技术作为未来15年我国前沿技术的重点研究领域。

这五项生物前沿技术分别是：

——靶标发现技术。靶标的发现对发展创新药物、生物诊断和生物治疗技术具有重要意义。重点研究生理和病理过程中关键基因功能及其调控网络的规模化识别，突破疾病相关基因的功能识别、表达调控及靶标筛查和确证技术，“从基因到药物”的新药创制技术。

——动植物品种与药物分子设计技术。动植物品种与药物分子设计是基于生物大分子三维结构的分子对接、分子模拟以及分子设计技术。重点研究蛋白质与细胞动态过程生物信息分析、整合、模拟技术，动植物品种与药物虚拟设计技术，动植物品种生长与药物代谢工程模拟技术，计算机辅助组合化合物库设计、合成和筛选等技术。

——基因操作和蛋白质工程技术。基因操作技术是基因资源利用的关键技术。蛋白质工程是高效利用基因产物的重要途径。重点研究基因的高效表达及其调控技术、染色体结构与定位整合技术、编码蛋白基因的人工设计与改造技术、蛋白质肽链的修饰及改构技术、蛋白质结构解析技术、蛋白质规模化分离纯化技术。 ——基于干细胞的人体组织工程技术。干细胞技术可在体外培养干细胞，定向诱导分化为各种组织细胞供临床所需，也可在体外构建出人体器官，用于替代与修复性治疗。重点研究治疗性克隆技术，干细胞体外建系和定向诱导技术，人体结构组织体外构建与规模化生产技术，人体多细胞复杂结构组织构建与缺损修复技术和生物制造技术。

——新一代工业生物技术。生物催化和生物转化是新一代工业生物技术的主体。重点研究功能菌株大规模筛选技术，生物催化剂定向改造技术，规模化工业生产的生物催化技术系统，清洁转化介质创制技术及工业化成套转化技术。

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有关专家指出，基因组学和蛋白质组学研究正在引领生物技术向系统化研究方向发展，基因组序列测定与基因结构分析已转向功能基因组研究以及功能基因的发现和应用；药物及动植物品种的分子定向设计与构建已成为种质和药物研究的重要方向；生物芯片、干细胞和组织工程等前沿技术研究与应用，孕育着诊断、治疗及再生医学的重大突破。我国必须在功能基因组、蛋白质组、干细胞与治疗性克隆、组织工程、生物催化与转化技术等方面取得关键性突破。 一、 生物芯片

[关键词] 生物芯片; 细胞芯片; 细胞免疫芯片; 细胞检测

细胞芯片技术是以活细胞作为研究对象的一种生物芯片技术。它是适应后基因组时代人类对生命科学探索的要求而产生的。作为细胞研究领域的一种新技术, 其既保持传统的细胞研究方法的优点如原位检测等, 又满足了高通量获取活细胞信息等方面的要求。本文中扼要介绍细胞芯片的概念以及几种已报道的细胞芯片, 并对细胞免疫芯片进行了简述。

1 细胞芯片概念

生物芯片技术系指先将大量探针分子固定于支持物上, 然后与标记的样品分子进行杂交, 通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息, 以实现对细胞、 蛋白质、 基因及其他生物组分的准确、 快速、 大信息量的检测。细胞作为生物有机体结构和功能的基本单位, 其生物学功能容量巨大。利用生物芯片技术研究细胞, 在细胞的代谢机制、 细胞内生物电化学信号识别传导机制、 细胞内各种复合组件控制以及细胞内环境的稳定等方面, 都具有其它传统方法无法比拟的优越性。目前, 细胞芯片在国内外已有报道, 一般指的是充分运用显微技术或纳米技术, 利用一系列几何学、 力学、 电磁学等原理, 在芯片上完成对细胞的捕获、 固定、 平衡、 运输、 刺激及培养等精确控制, 并通过微型化的化学分析方法, 实现对细胞样品的高通量、 多参数、 连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等研究目的。新型的细胞芯片应满足以下3个方面的功能: ①在芯片上实现对细胞的精确控制与运输; ②在芯片上完成对细胞的特征化修饰; ③在芯片上实现细胞与内外环境的交流和联系[1]。 2 细胞芯片的特点

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基于细胞芯片的研究分析是一种具有较高通量的技术, 以细胞作为实验平台的细胞芯片至少具有以下3个方面的特点: ①在芯片上实现对活细胞的原位监测, 可以多参数高通量的直接获得与细胞相关的大量功能信息（即关于细胞对各种刺激的应答信息）, 这是细胞芯片最重要的特点; ②通过活细胞分析, 获得细胞相关的分析信息（主要是关于各种刺激物的数量、 质量等相关方面的信息）; ③利用显微技术和纳米技术能精确的控制细胞内的生物化学环境, 以细胞作为化学反应的纳米反应器, 便于详细的研究揭示细胞内一系列过程和原理的本质[1]。

3 细胞芯片的分类和应用

3.1 整合的微流体细胞芯片(an integrated microfluidic system) 整合的微流体细胞芯片是一种高度平行化、 自动化的集成微型芯片装置, 对细胞样品具有预处理和分析的能力, 又称微全分析系统（integrated micro total analysis system, μTAS）[1]。通过在芯片上构建各种微流路通道体系, 并运用不同的方法在流体通道体系中准确控制细胞的传输、 平衡与定位, 进而实现对细胞样品进行药物刺激等实验过程的原位监测和细胞组分的分析等研究。Larry等[2]在芯片上设计了一种具有三维流动控制概念的装置, 该装置包含一条流体通道和一个中心伸展的V型屏障, 屏障以具有斜坡的一面对应于流体通道。屏障斜坡是细胞平衡、 固定的关键结构, 细胞的平衡、 固定是通过控制流体通道中试剂流体的流动速度、 斜坡对细胞的支持力和细胞向下的重力相互作用完成的。他们在该装置上实现了单个酵母细胞的培养、 去除胞壁、 扫描、 梯度药物浓度刺激和细胞荧光测量等研究。Yang等[3]在芯片上设计了一种并行于流体通道的带有“码头”的“坝”结构, 该流路和“坝”的作用类似于Larry等设计的V型屏障和流路, 通过网状流体通路和“坝”的长短分配药剂流, 产生药剂的浓度梯度。他们选择了Ca2+吸收呈ATP依赖型的HL60细胞作为模型, 检测了诱导显著的细胞内Ca2+信号行为的ATP浓度阈值, 利用细胞芯片原位监测细胞对系列药物浓度梯度刺激的胞内应答行为。瑞典兰德大学神经生理学院的Davidsson等[4]选用HeLa细胞作为模式细胞, 在芯片上监测细胞内已报道的基因活性并检测了这些基因表达的条件, 以减少基因的不确定表达。Munce等[5]在芯片上进行了单细胞毛细管电泳分离, 他们在芯片上构建多重并联的毛细管通道, 以满足高通量分析和

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避免分离样品交叉污染的需求。此外, 还有在芯片上同时构建流路和分离、 排列、 定位细胞所需空间的微孔或沟槽等结构的芯片类型, 用于细胞的多参数检测筛选。整合的微流体细胞芯片制作方法多样, 类型不一, 发展较快, 应用的范围也比较广泛, 内容涉及细胞的固定培养、 鉴定筛选、 分化刺激、 原位检测、 药物开发筛选和组分分析等各个方面。

3.2 微量电穿孔细胞芯片(microelectroporation cell chip) 当给细胞一定的阈电压时, 细胞膜具有短暂的强渗透性。利用细胞膜的这种特性将外源DNA、 RNA、 蛋白质、 多肽、 氨基酸和药物试剂等精确的转导入靶细胞的技术称为电穿孔技术。该技术能直接应用于基因治疗。微量电穿孔细胞芯片正是将这种技术与生物芯片技术相结合的产物, 是细胞操作调控微型化的一种手段。该技术采用一种微型装置, 将细胞与芯片上的电子集成电路相结合, 利用细胞膜微孔的渗透性, 通过控制电子集成电路使细胞面临一定的电压, 电压使细胞膜微孔张开, 从而在不影响周围细胞的情况下可将外源DNA, RNA、 蛋白质、 多肽、 氨基酸和药物试剂等生物大分子或制剂等顺利的导入或从靶细胞中提取出来, 并进行后续研究。这种技术为研究细胞间遗传物质的转导、 变异、 表达以及控制细胞内化学反应提供了可能。最先进行这种单细胞电穿孔尝试的是Huang和Rubinsky[6]的科研小组, 他们最终找到了一种利用电穿孔细胞芯片控制人体细胞活动的方法。Shin等[7]运用聚二甲基硅氧烷等材料构建了电穿孔细胞芯片, 他们在芯片上构建一条长2 cm高20 μm的流体通道, 通过指数衰变式脉冲发生器对通道内的细胞进行电穿孔实验, 测量了细胞电穿孔时各种参数, 原位观察了碘化丙啶被SKOV3细胞株吸收的全过程, 并成功的将绿色荧光标志的蛋白基因转染了SKOV3细胞, 监测了活细胞内DNA逆传的规律。需要指出的是, Shin等制作的芯片也是通过流体通路来实现对细胞的控制的。此外, 也可以采用纳米针和纳米管等显微操作穿刺细胞膜, 并在芯片上构建纳米通道, 完成向单细胞注射或提取所需样品。

3.3 细胞免疫芯片(cell immunochip) 细胞免疫芯片是一种新型的细胞芯片技术, 是在蛋白质芯片的基础上发展起来的。它是以细胞为研究对象, 利用免疫学原理和微型化操作方法, 实现对细胞样品的快速检测和分析。它的免疫学基础是抗原或抗体的固相化、 抗原抗体特异性反应及抗原或抗体的检测方法（如荧

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光标记、 酶标记及放射标记等）。在芯片上固定的抗体或抗原必须保持原有的免疫学活性, 在测定时, 受检标本（测定一般为细胞表面的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体进行反应, 通过免疫学特异性反应捕获目标细胞,然后根据标记与否以及标记物的不同选择不同的检测方法, 快速完成对细胞的检测, 并且可以对细胞进行免疫化学测定等后续研究[8, 9]。它是一种应用范围广、 经济实用性强的生物芯片技术。

3.3.1 细胞免疫芯片的原理 根据捕获细胞的检测要求将不同的抗原或抗体以较高密度固定在经过修饰的玻片等载体上并保持其活性不变, 形成抗原或抗体微阵列, 然后利用细胞表面抗原与抗体等免疫学特异性反应原理, 通过抗原或抗体微阵列和细胞悬液样品的反应捕获待测目的细胞, 将未结合在芯片上的细胞和非特异性结合的细胞从芯片上洗脱, 则靶向细胞将结合在微阵列的不同抗体或抗原点上。结合在不同抗体或抗原点上的细胞代表了不同的细胞免疫表型, 从而完成对细胞分离、 分类及检测目的, 或者继续对细胞样品进行标记和其他方面的后续研究[8, 9]。

3.3.2 细胞免疫芯片的特点 目前, 细胞免疫芯片主要应用于细胞的检测, 与其它的细胞检测方式相比, 它具有以下几个特点: ①利用抗体和细胞表面抗原的特异性反应原理, 检测表达特异性表面抗原的细胞, 具有较高的特异性; ②由于芯片的密度较高, 获得的信息量较大, 可以高通量、 高平行性的综合检测、 分析细胞样品, 一次可以检测同一或不同样品细胞的多种表达抗原; ③适用范围广, 凡是可以制成细胞悬液的样品均可进行检测; ④操作简便灵活, 染色、 标记等步骤可根据实验要求增加或删减, 经济方便, 无须价格昂贵的检测设备, 普通显微镜即可检测, 经济实用。

3.3.3 细胞免疫芯片的制作 细胞免疫芯片的制备主要以玻片为基底, 通过对玻片表面进行化学修饰, 以使生物分子固定后仍保持原有的生物活性。玻片表面的化学修饰有多种方式, 三维修饰如琼脂糖、 聚丙烯酰胺凝胶等修饰; 二维修饰如醛基、 氨基等修饰。琼脂糖修饰由于具有操作简便、 对生物分子的固定能力较强而应用较多。将所需要的抗体或抗原样品按一定的排布方式点样到经过修饰的玻片上, 形成微阵列芯片。被检测细胞悬液（荧光标记或非标记）在微阵列芯片上进行孵育结合后洗去未结合的细胞, 则被检测细胞被捕获于芯片表面。可

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以直接在芯片上检测, 也可以将目标细胞洗脱后培养进行间接检测。直接检测快捷简单, 对于荧光标记的细胞免疫芯片, 用激光扫描细胞仪进行扫描, 然后通过计算机分析出每个点的平均荧光强度。对于酶标记的细胞免疫芯片, 只须显色后将检测细胞放在光镜下观察, 用CCD照相机进行拍摄记录结果即可, 将信号通过计算机处理得到每个点的灰度。间接检测根据对样品的要求不同而采用不同的方法。

3.3.4 细胞免疫芯片的应用 细胞免疫工程包含生物医药学方面研究基因组序列功能和病理学相关的核心技术与内容。细胞免疫芯片为分子医药学发展靶向免疫诊断、 治疗肿瘤和其他细胞表面抗原相关疾病提供了一种新型研究方法。由于细胞免疫芯片对生物样品的要求较低, 使得样品的预处理大为简化, 因此, 应用范围广泛, 凡是可以制成细胞悬液的样品都可以进行检测, 如淋巴细胞悬液、 其它细胞或组织等生物样品等。Zhang等[8]利用红细胞为材料研究了细胞免疫芯片在细胞检测方面的初步应用, 他们将抗体固定在琼脂糖修饰的玻片上, 并通过固定的抗体与细胞表面的抗原反应捕获细胞。Belov等[9]根据不同的白血病在白细胞质膜上分化抗原(CD)组表达的差异, 进行了白血病免疫分型实验。他们运用较高密度的抗体微阵列, 在一次测定中可以快速的检测50种或更多的白细胞或白血病细胞的分化抗原(CD), 他们分别从正常的外周血白细胞、 慢性白血病细胞、 多毛白细胞、 上皮淋巴细胞、 急性淋巴白细胞、 T细胞介导的急性淋巴白血病细胞等样品中获得了清楚且重复性好的结果, 并验证了48种分化抗原（CD）在芯片上和流式细胞仪上分析结果的吻合性, 在白血病的辅助诊断和预后判断等方面都提供了充足的理论依据, 显示了细胞免疫芯片应用在白血病免疫诊断及预后判定方面的诱人前景。基于类似的原理, Revzin等[10]运用光刻胶技术在玻片上构建了聚乙二醇水凝胶壁组成的规格分别为20 μm×20 μm与15 μm×15 μm的微孔, 并将微孔内的玻片根据不同的需求进行修饰, 选择性地结合淋巴细胞特异性抗体或其他细胞黏附因子, 从而形成高密度抗体或细胞因子芯片, 该芯片的突出优点是不仅可以根据细胞表面抗原抗体分化信息对白细胞进行免疫分型, 而且可以运用激光捕获微切割技术在芯片上有选择地对细胞内的基因和蛋白质组进行分析检测。细胞免疫芯片在新药物的开发筛选等方面亦将提供强有力的技术支持。如筛选新药物时, 利用芯片上的靶细胞筛选和其作用

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的新药物, 或者根据细胞表面特定抗原的是否表达, 通过芯片上的抗体微阵列来筛选经过不同新药物处理过的细胞, 不仅可以提高药物开发的效率, 而且实现了药物筛选的敏感性、 高通量和自动化的集成。 4 展望

细胞芯片是近年来发展起来的一种检测细胞的新技术, 它是对基因芯片和蛋白质芯片技术的重要补充。随着生物芯片技术和生物信息学的不断进展, 细胞芯片的制作技术将越来越成熟。细胞芯片技术通过应用免疫细胞化学、 原位分子杂交等原理对细胞基因、 蛋白表达水平进行定位检测等研究, 已经在基因检测、 基因表达、 组分多态性分析、 药物开发筛选和疾病诊断等诸多领域显示出重要的作用, 在白血病等肿瘤的辅助诊断和预后判断方面也有着重要的应用价值。可以预见, 细胞芯片技术作为一种新兴的生命科学领域中细胞水平的研究手段和传统的研究细胞的方法相结合, 将广泛的应用于生命科学研究及其实践的各个领域。

柴油作为一种重要的石油连炼制产品，在各国燃料结构中占有较高的份额，以成为重要的动力燃料。随着世界范围内车辆柴油化趋势的加快，未来柴油的需求量会愈来愈大，而石油资源的日益枯竭和人们环保意识的提高，大大促进了世界各国加快柴油替代燃料的开发步伐，尤其是进入了20世纪90年代，生物柴油以其优越的环保性能受到了各国的重视。 二、生物柴油

1 环境保护推动柴油标准的不断提高

目前世界每年新车产量大约5 000万辆，全世界汽车保有量大约7.5亿辆（含摩托车）。随着汽车工业的快速发展，汽油和柴油的用量随汽车保有量的增加而增加，同时也带来了汽车尾气污染等问题。近20年来，虽然在改善油品燃烧过程、尾气净化等方面都取得了很大进展，但仍然不能满足要求。为了改善汽车的运行性能和降低汽车尾气中害物质的排放量，美国、欧洲和日本汽车工业协会1998年6月4日提出了汽车燃料质量国际统一标准即\"世界燃油规范\"Ⅲ类标准。柴油\"世界燃油规范\"Ⅱ类、Ⅲ类标准（见表1、表2）。由表1、表2可以看出，Ⅱ类标准在目前基础上，提出了芳烃含量的限制，对硫含量、十六烷值等提出了更高的标准，Ⅲ类标准则在各项指标上比Ⅱ类标准都有更严格的规定。

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表1 柴油\"世界燃油规范\"Ⅱ类标准 项目 质量指标 十六烷值 硫含量（质量分数），% 总芳烃含量（质量分数），% 多环芳烃含量（体积分数），% 95%馏车温度/℃ ≥53 ≤0.03 ≤25 ≤5 ≤355 表2 柴油\"世界燃油规范\"Ⅲ类标准 项目 质量指标 十六烷值 硫含量（质量分数），% 总芳烃含量（质量分数），% 多环芳烃含量（体积分数），% 95%馏车温度/℃ ≥55 ≤0.003 ≤15 ≤2 ≤340 随着我国汽车拥有量的急剧上升，大量的燃油被消耗，汽车尾气中污染物的排放量越来越大，汽车尾气已成为我国大气污染重要的原因。为保护环境，改善大气质量，我国国家质量技术监督局最近颁布了柴油机排放控制新标准（见表3）。新标准采用了联合国欧洲经济委员会汽车排放法规体系，使我国对新柴油机车的排放要求达到欧洲20世纪90年代初期的水平。 表3 我国柴油机排放新控制标准 g/kW.h 实施阶段 PA 实施日期 CO HC NOX ≤85 ＞85 8

kW kW 01 1997-10-01 11.2 2.4 14.4 1.10 0.92 02 2000-10-01 4.5 1.1 8.0 0.61 0.36 03 2005-10-01 4.0 1.1 7.0 0.15 0.15 我国目前的车用无铅汽油和柴油标准介于世界燃油规范Ⅰ类油和Ⅱ类油水平之间，要满足汽车达到欧洲Ⅰ类排放标准都困难，更无法满足入世及举办奥运会的要求。为此，中国石化集团公司要求在清洁油品生产方面作出更大努力，以满足国家标准的要求。 2 生物柴油的主要特性 炼油企业为了向市场提供清洁油品使燃烧柴油尾气排放达到标准要求，需要采取以下三种措施：一是要有性能优异的深度加氢脱硫催化剂，以脱除难以加氢脱硫的4，6-二甲基苯并噻吩等芳香基硫化合物；二是要有抗硫的贵金属芳烃饱和催化剂，能使芳烃加氢饱和在较低压力下进行，以节省投资；三是要有提高十六烷值的工艺。而生物柴油以其优异的环保性能可很容易达到\"世界燃油规范\"的柴油Ⅱ、Ⅲ类标准要求。 众所周知，柴油分子是由15个左右的碳链组成的，研究发现植物油分子则一般又14～18个碳链组成，与柴油分子中碳数相近。因此生物柴油就是一种用油彩籽等可再生植物油加工制取的新型燃料。按化学成分分析，生物柴油燃料是一种高脂酸甲烷，它是通过以不饱和油酸C18 为主要成分的甘油脂分解而获得的[1]。与常规柴油相比，生物柴油下述具有无法比拟的性能。 （1） 具有优良的环保特性。主要表现在由于生物柴油中硫含量低，使得二氧化硫和硫化物的排放低，可减少约30%（有催化剂时为70%）；生物柴油中不含对环境会造成污染的芳香族烷烃，因而废气对人体损害低于柴油。检测表明，与普通柴油相比，使用生物柴油可降低90%的空气毒性，降低94%的患碍率；由于生物柴油含氧量高，使其燃烧时排烟少，一氧化碳的排放与柴油相比减少约10%（有催化剂时为95%）；生物柴油的生物降解性高。 （2） 具有较好的低温发动机启动性能。无添加剂冷滤点达-20℃。 （3） 具有较好的润滑性能。使喷油泵、发动机缸体和连杆的磨损率低，使用寿命长。

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（4） 具有较好的安全性能。由于闪点高，生物柴油不属于危险品。因此，在运输、储存、使用方面的有是显而易见的。 （5） 具有良好的燃料性能。十六烷值高，使其燃烧性好于柴油，燃烧残留物呈微酸性使催化剂和发动机机油的使用寿命加长。 （6） 具有可再声性能。作为可再生能源，与石油储量不同其通过农业和生物科学家的努力，可供应量不会枯竭。 生物柴油的优良性能使得采用生物柴油的发动机废气排放指标不仅满足目前的欧洲Ⅱ号标准，甚至满足随后即将在欧洲颁布实施的更加严格的欧洲Ⅲ号排放标准。而且由于生物柴油燃烧时排放的二氧化碳远低于该植物生长过程中所吸收的二氧化碳，从而改善由于二氧化碳的排放而导致的全球变暖这一有害于人类的重大环境问题。因而生物柴油是一种真正的绿色柴油。 3 生物柴油的应用现状 在国际市场上，生物柴油根据等级和纯度的不同，价格在250美元/t以上。目前在美国、欧洲、亚洲的一些国家和地区已开始建立商品化生物柴油生产基地，并把生物柴油作为代用燃料广泛使用。 生物柴油使用最多的是欧洲，份额已占到成品油市场的5%。目前在欧洲用于生产生物柴油的原料主要为菜籽油，目前的生物柴油标准也主要是参照菜籽油的生物柴油标准品质作出的，表4为现阶段生物的德国标准。1999年，欧盟共生产出3.90*105m3生物柴油。2000年初德国的总生物柴油生产量已达450 kt，并有逐年上升的趋势。德国凯姆瑞亚.斯凯特公司自1991年起开发研制了用植物油如菜籽油生产生物柴油的工艺和设备。目前利用该公司的工艺和设备已在德国和奥地利等欧洲国家建起了多个生物柴油生产工厂，最大产量达300 t/d。表5是德国凯姆瑞亚.斯凯特公司开发生产的生物柴油与普通柴油主要性能比较，可以看出，生物柴油在冷滤点、闪点、燃烧功效、含硫量、含氧量、燃烧耗氧量、对水源的危害方面优于普通柴油，而其他指标与普通柴油相当。 表4 现阶段生物柴油的德国标准（DINV51606） 名称 标准值 检验方法 10

15℃时的密度/g. Ml-1 0.875～0.900 DIN EN ISO3675 40℃时的动力粘度/mm2.s-1 3.5～5.0 DIN EN ISO3104 按Pensky-Martens法 ≥110 DIN EN ISO22719 在密闭杯中的闪点/℃

冷滤点（CFPP）/℃ DIN EN 116 4月15日-9月30日 ≤0 10月1日-11月15日 ≤-10 11月16日-2月28日 ≤-20 3月1日-4月14日 ≤-10

硫含量（质量分数），% ≤0.01 DIN EN ISO14596 残炭（质量分数），% ≤0.05 DIN EN ISO10370 十六烷值

≥49 DIN51773 灰分（质量分数），% ≤0.03 DIN51575 水分/mg.kg-1 ≤300 DIN51777-1 总杂质/ mg.kg-1 ≤20 DIN51419 对铜的腐蚀效能

1 DIN EN ISO2160 （在50℃时3 h腐蚀程度） 氧化稳定性，诱导期/h 未给出 IP306 中和值（KOH）/mg.kg-1 ≤0.5 DIN51558-1 甲醇含量（质量分数），% ≤0.3

碘值/g.（100g）-1 ≤115 DIN53241-1 磷含量/mg.kg-1 ≤10 DIN51440-1 碱含量（Na+K）/mg.kg-1

≤5

依据DIN51797-3，增加钾

表5 生物柴油和常规柴油的性能比较

特性

生物柴油 常规柴油

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冷滤点（CFPP）/℃ 夏季产品 冬季产品 20℃的密度/g.mL-1 40℃动力粘度/mm2.s-1 闭口闪点/℃ 十六烷点 热值/MJ.L-1

-10 -20 0.88 4～6 ＞100 ≥56 32

0 -20 0.83 2～4 60 ≥49 35 100 ＜0.2 0 14.5 2

在美国，生物柴油的产量由1999年的1 892.5m3猛增到2000年的18 925m3。目前已有纯态形式的生物柴油燃料和混合生物柴油燃料，在汽车上实际使用超过1.6*107km的实验基础。纯态形式的生物柴油又称为净生物柴油，已经被美国能源政策法正式列为一种汽车替代燃料。依据原料和生产商的不同，目前美国净生物柴油的价格不及0.515～0.793美元/L；含80%生物柴油成分的混合生物柴油的市场价格，每升比传统柴油要贵7.93～10.57美分。

日本1995年开始研究生物柴油，在1999年建立了259L/d用煎炸油为原料生产生物柴油的工业化实验装置，该装置可降低原料成本。目前日本生物柴油年产量可达400 kt。 4 生物柴油的生产方法

目前生物柴油主要是用化学法生产，即用动物和植物油脂和甲醇或乙醇等低碳醇在酸或者碱性催化剂和高温（230～250℃）下进行转酯化反应，生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，在经洗涤干燥即得生物柴油。甲醇或乙醇在生产过程中可循

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燃烧功效（柴油=100%），% 104 硫含量（质量分数），% ＜0.001 氧含量（体积分数），% 10 燃烧1 kg燃料按化学计算法的最小空气耗量/kg 水危害等级

12.5 1

环使用，生产设备与一般制油设备相同，生产过程中可产生10%左右的副产品甘油。

目前生物柴油的主要问题是成本高，据统计，生物柴油制备成本的75%是原料成本。因此采用廉价原料及提高转化从而降低成本是生物柴油能否实用化的关键。美国已开始通过基因工程方法研究高油含量的植物。日本采用工业废油和废煎炸油。欧洲是在不适合种植粮食的土地上种植富油脂的农作物。

但化学法合成生物柴油有以下缺点：工艺复杂、醇必须过量，后续工艺必须有相应的醇回收装置，能耗高；色泽深，由于脂肪中不饱和脂肪酸在高温下容易变质；酯化产物难于回收，成本高；生产过程有废碱液排放。

为解决上述问题，人们开始研究用生物酶法合成生物柴油，即用动物油脂和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙酯。酶法合成生物柴油具有条件温和，醇用量小、无污染排放的优点。但目前主要问题有：对甲醇及乙醇的转化率低，一般仅为40%～60%，由于目前脂肪酶对长链脂肪醇的酯化或转酯化有效，而对短链脂肪醇如甲醇或乙醇等转化率低。而且短链醇对酶有一定毒性，酶的使用寿命短。副产物甘油和水难于回收，不但对产物形成抑制，而且甘油读固定化酶有毒性，使固定化酶使用寿命短。 5 生物柴油的应用前景分析

生产和推广应用生物柴油的优越性是显而易见的：（1）原料易得且价廉。用油菜籽和甲醇为生产原料，可以从根本上摆脱对石油制取燃油的依赖。（2）有利于土壤优化。种植油菜可与其他作物轮种，改善土壤状况，调整平衡土壤养分，挖掘土壤增产潜力。（3）副产品具有经济价值。生产过程中产生的甘油、油酸、卵磷脂等一些副产品市场前景较好。（4）环保效益显著。生物查燃烧时不排放二氧化硫，排出的有害气体比石油柴油减少70%左右，且可获得充分降解，有利于生态环境保护。此外生物柴油由于竞争力不断提高、政府的扶持和世界范围内汽车车型柴油化的趋势加快而前景更加广阔。 5.1 生物柴油的竞争力不断提高

从世界范围来看，目前世界上含硫原油（含硫量0.5%～2.0%）和高硫原油（含硫量在2.0%以上）的产量已占世界原油总产量的75%以上，其中含硫量在1%以上的原油占世界原油总产量的55%以上，含硫量在2%以上的原油也占30%以

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上。目前全球炼油厂加工的原油平均相对密度是0.851 4，平均含硫量是0.9%；在2000年以后，平均相对密度将上升到0.863 3，含硫量将上升到1.6%。炼油厂要在现有基础上，使柴油含硫量低、有良好的安定性及润滑性、较高的十六烷值和清净性，必须在装置调整上投入大量资金，并由此带来油品生产成本的提高，在这方面，各发达国家的炼厂均投入了重金。从美国的情况看，美国从20世纪90年代初启动油品清洁化，已累计投入了300多亿美元。由此造成的油品成本提高使目前美国炼厂吨毛利仅在每桶1美元左右，维持微利状态，有的企业甚至亏损；从欧洲的情况来说，欧洲炼油厂要达到2000年欧盟燃油规格，估计需要投资200亿～300亿美元。欧洲石油工业协会估计的投资更高，该组织认为要达到2000年和2005年的柴油规格，需要投资440亿～500亿美元。

随着生物柴油生产工艺的改进，使用生物柴油的发动机即可使用普通柴油的发动机（对有些机型仅需换密封圈和滤芯），无需作任何改动，生物柴油可与普通柴油在油箱中以任何比例相混，并对驾驶动无任何影响，驾驶者根本无法区分两者的驾驶动力差别。加之柴油替代燃料所用原料随着规模种植价格日趋低廉，使柴油替代燃料的生产成本逐步下降，与常规柴油的价格正在缩小，如美国生物柴油的价格已从每升1.06美元降到0.33～0.59美元，这个价格与普通柴油的价格差不多。

5.2 政府对生物柴油的扶持政策

目前许多国家如美国、德国、法国、丹麦、意大利、爱尔兰和西班牙等对生物柴油采取了相应的扶持政策。为了进一步鼓励使用生物柴油，美国农业部决定今后两年每年拿出1.5亿美元补贴生物柴油等生物燃料的使用，目前美国至少有5个州正在考虑制订税收鼓励政策。目前在欧洲生产生物柴油可享受到政府的税收政策优惠，其零售价低于普通柴油（如在德国加油站生物柴油的零售价格目前为约1.45马克/L，而柴油为1.60马克/L）。据Frost & Sullivan企业咨询公司最新发表的\"欧盟生物柴油市场\"报告，为实现\"京都协议\"规定的目标（在2008-2012年，欧盟将减少二氧化碳排放量8%），欧盟即将出台鼓励开发和使用生物柴油的新规定，如对生物柴油免征增值税，规定机动车使用生物动力燃料占动力燃料营业总额的最低份额。新规定的出台不仅有助于欧盟生物柴油市场的稳

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定，而且生物柴油营业额将从2000年的5.035亿美元猛增至24亿美元，平均年增25%。

5.3 现代柴油机促使汽车车型柴油化的趋势加快

在欧洲，1999年新购柴油轿车比例约为30%，法国甚至达到48%。2000年，欧洲市场上柴油轿车的销售量达到440万辆，比1995年翻了一倍。现在经济型轿车主要生产厂商如大众、雷诺、欧宝和福特的顾客中，几乎有一半需要柴油车。目前，在欧洲轿车市场上，新型柴油轿车购买率达30%，专家预言：到2006年，欧洲每2辆新车中就有1辆是柴油车。在美国市场上，商用车（即我国所称的卡车、客车）的90%为柴油车；在日本，将近10%的轿车是柴油轿车，38%的商用车为柴油车。美国、日本及欧洲的重型汽车全部使用柴油机为动力。许多国家在税收、燃料供应等方面予以政策上的倾斜，敦促柴油发动机的普及和发展。 我国柴油汽车生产比例已由1990年的15%上升到1998年的26%。1997年我国生产的重型载货汽车和大型客车全部采用柴油发动机；65.9%中型载货汽车采用柴油发动机，53.5%中型客车采用柴油发动机；55.4%和29.4%的轻型载货汽车、轻型客车也开始采用柴油发动机。我国1994年颁布的《汽车工业产业政策》明确提出，总重量超过5 t的载客汽车载货汽车在2000年后主要采用柴油为燃料。在未来的几年，是中国汽车工业腾飞的时代。因此，我国柴油车产量的增长趋势还将继续下去，汽车柴油化是中国汽车工业的一个发展方向。

汽车车型柴油化趋势的加快主要是由于现代柴油机采用了电控发动机控制系统、高压燃油直喷式燃烧系统以及废气排放控制装置，已完全克服了传统柴油机的缺点，能够满足现行的国际排放标准，而这些装置和技术要求柴油含硫量低，有良好的安定性及润滑性，较高的十六烷值和清净性等。随着现代柴油机使用生物柴油燃料技术的成熟，目前在世界范围内出现的这种汽车车型柴油化趋势会进一步加快。据专家预测，在2010年以前，是柴油需求年均增长3.3%，到2010年，世界柴油的需求量将从目前的38%增加到45%。而世界范围内柴油的供应量严重不足，给生物柴油留下广阔的发展空间。 6 我国发展生物柴油的原料分析及发展建议

柴油的供需平衡问题也将是我国未来较长时间石油市场发展的焦点问题。业内人士指出，到2005年，随着我国原由加工量的上升，汽油和煤油拥有一定数

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量的出口余地，而柴油的供应缺口仍然较大。我国柴油产量到2005年预计可达到80.5 Mt，仍缺口600～2 400 kt。预计到2010年柴哟的需求量将突破100 Mt，与2005年相比，将增长24%；至2015年市场需求量将会达到130 Mt左右。近几年来，尽管炼化企业通过持续的技术改造，生产柴汽比不断提高，但仍不能满足消费柴汽比的要求。目前，生产柴汽比约为1.8，而市场的消费柴汽比均在2.0以上，云南、广西、贵州等省区的消费柴汽比甚至在2.5以上。随着西部开发进程的加快，随着国民经济重大基础项目的相继启动，柴汽比的矛盾比以往更为突出。因此，开发生物柴油不仅与目前石化行业调整油品结构提高柴汽比的方向相契合，而且意义深远。

国内也已研制成功利用菜籽油、大豆油、米糠油脚料、工业猪油、牛油及野生植物小桐籽油等作原料，经预酯化、再酯化射干难产生物柴油的工艺。高品质的原料是生产高品质生物柴油和取得高收率的基本保证。由于双低菜籽油生产的生物柴油含硫量低，从而使该菜籽油生物柴油具有好的排放标准，因此目前在欧洲普遍栽种双低菜籽。就目前而言，每公顷土地可生产约30 t菜籽（含油量约40%）。我国有很多地区油菜籽种植面积很大，在加工传统的食用油的同时不失时机地开发生产生物柴油燃料是油菜籽利用的一个重要方向。另外，研究发现棉籽油与双低菜籽油的脂肪酸组成相似，因此在我国采用棉籽油作为生物柴油的原料还是可行的。当然，此时的棉籽油生物柴油标准需要按照中国的实际作相应的调整。

1t油菜籽可制取约160 kg生物柴油，同时可副产16 kg甘油。而纯度高达99.7%的特级甘油价格为2 000美元/t。因此，制取生物柴油与精致甘油工艺联产，将能取得较为理想的经济效益。若能建年产100 kt具有一定工业化生产规模的生物柴油装置，其经济效益更为可观。近几年来，生物柴油燃料已被越来越多的重视，在美国和欧洲已开始建立商品化生产，市场很有吸引力，原料也不会存在问题，因此，有很多大公司纷纷开拓这一业务，期望在开始时就能占领市场。南斯拉夫在五、六年前已研制成功这项技术且已生产，后因经济困难而停产，测试数据表明，南斯拉夫的技术水平同德国、意大利等国的相同，可探讨与南斯拉夫合作帮助我国发展这一技术。

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