高效阴离子交换色谱-脉冲安培法检测A、C、Y和W135群脑膜炎球菌多糖含量

·４４·　微生物学免疫学进展２０１８年１０月第４６卷第５期Ｐｒｏｇ　ｉｎ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｏｃｔ．２０１８，Ｖｏ１．４６　Ｎｏ．５　·论著·　高效阴离子交换色谱一脉冲安培法　检测　Ａ、Ｃ、Ｙ和Ｗ　１　３５群脑膜炎球菌多糖含量　李亚南　，赵丹　，徐颖华，毛琦琦，陈苏京，李茂光，叶强　中国食品药品检定研究院呼吸道细菌疫苗室卫生部生物技术产业检定方法及其标准化重点实验室，北京１０２６２９　摘要：目的用高效阴离子交换色谱一脉冲安培检测法（ＨＰＡＥＣ—ＰＡＤ）测定Ａ、Ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群脑膜炎球菌多糖含　采用ＣａｒｂｏＰａｃ＠ＰＡ一１　４ｘ２５０　ｎｌｍ分析柱与Ａｍｉｎｏｔｒａｐ　４ｘ５０　ｍｍ保护　量．并对该方法进行验证及初步应用。方法柱；使用氢氧化钠／醋酸钠梯度洗脱，以多糖抗原标准溶液质量浓度为横坐标，其相应的峰面积为纵坐标，绘制标准　曲线．并对建立的方法进行专属性、精密度和准确性验证；同时与传统方法的检测结果进行比较分析。结果Ａ、ｃ、　Ｙ和Ｗ１３５群脑膜炎球菌多糖质量浓度在０．５～２７．０　ｇ／ｍＬ范围内与峰面积均具有良好线性关系，ｒ：０．９９９。该方　法专属性高，分析结果重复性良好，ＲＳＤ均＜５％；回收率均在９５％～１０５％范围内；与传统的火箭免疫电泳法相比，检　测结果差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论液及疫苗成品中的多糖含量。　ＨＰＡＥＣ　ＰＡＤ准确、可靠，重复性好，可用于检测脑膜炎球菌多糖原　关键词：阴离子交换色谱法：脉冲安培检　器；脑膜炎球菌多糖　中图分类号：Ｒ３９２　文献标志码：Ａ　文章编号：１００５—５６７３（２０１８）０５—００４４—０５　ＤｏＩ：１０．１３３０９／ｊ．ｃｎｋｉ．ｐｍｉ．２０１８．０５．００７　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｇｒｏｕｐ　Ａ，Ｃ，Ｙ　ａｎｄ　Ｗ１３５　ｍｅｎｉｎｇ０ｃ０ｃｃａｌ　ｐ０ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｂｙ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ａｎｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　ｐｕｌｓｅ　ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ＬＩ　Ｙａ—ｎａｎ，ＺＨＡＯ　Ｄａｎ。ＸＵ　Ｙｉｎｇ—ｈｕａ，ＭＡＣ　Ｑｉ—ｑｉ，ＣＨＥＮＧ　Ｓｕ－ｊｉｎｇ，ＬＩ　Ｍａｃ—ｇｕａｎｇ，ＹＥ　Ｑｉａｎｇ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ｆｏｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　Ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｂｅｒｉｎｇ　１０２６２９，Ｃｈｉｎａ：　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＬＩ　Ｍａｃ—ｇｕａｎｇ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｍａｏｇｕａｎｇ＠ｎ　．ｏｒｇ．ｃｎ；ＹＥ　Ｑｉａｎｇ，Ｅ—ｍａｉｌ：Ｑｉａｎｇｙｅｅ＠ｎ　．ｏｒｇ．Ｃｎ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　Ａ，Ｃ，Ｙ　ａｎｄ　Ｗ１３５　ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒ—　ｆｏｒｍａｎｃｅ　ａｎｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　ｐｕｌｓｅ　ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＨＰＡＥＣ—ＰＡＤ），ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｖｅｒｉｉｆｅｄ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｉｎａｒｙ　ａｐｐｌｉｅｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＣａｒｂｏＰａｃ⑥ＰＡ一１　４　ｘ　２５０　ｍｉｌｌ　ａｎｄ　Ａｍｉｎｏｔｒａｐ　４　ｘ　５０　ｍｍ（０４６１２２）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ａｎｄ　ｇｕａｒｄ　ｃｏｌｕｍｎ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃｌｕｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ．Ｔｈｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａ—　ｒｉｄｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｐｅａｋ　ａｒｅａ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ａｂｓｃｉｓｓａ　ａｎｄ　ｏｒｄｉｎａｔｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｔ　ｕｐ．Ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｖｅｒｉｉｅｄ　ｆｆｏｒ　ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ，ａｃｃｕｒａｃｙ　ａｎｄ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｈｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｌｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒｉｔｙ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．５～２７．０￣ｇ／ｎｌＬ　ｐｏｌｙｓａｃ—　ｃｈａｒｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｐｅａｋ　ａｒｅａ．ｗｉｔｈ　ｒ＝Ｏ．９９９．Ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ＨＰＡＥＣ—ＰＡＤ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ａｄｖａｎｔａｇｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ，ａｎｄ　ｇｏｏｄ　ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ（ＲＳＤ＜５％）．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｗａｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　９５％～１０５％．Ｃｏｍ—　ｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｒｏｃｋｅｔ　ｉｍｍｕｎｏ—ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｒｏｍ　ＨＰＡＥＣ—ＰＡＤ　ｈａｄ　ｎｏ　ａ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　ｐｏｌｙｓａｃ—　ｃｈａｒｉｄｅ　ｂｕｌｋ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　ｒｅｌｅｖａｎｔ　ｖａｃｃｉｎｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｎｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；Ｐｕｌｓｅ　ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　作者简介：李亚南（１９６３一），女，副主任技师，主要从事呼吸道　细菌疫苗质量控制及研发工作；　赵丹（１９８８－），女，技师，主要从事呼吸道细菌疫苗　质量控制及研发Ｔ作。　通信作者：李茂光，副研究员，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｍａｏｇｕａｎｇ＠ｎｉｆｄｅ．ｏｒｇ．ｃｎ　叶强，研究员，Ｅ—ｍａｉｌ：Ｑｉａｎｇｙｅｅ＠ｎｉｆｄｅ．ｏｒｇ．ｅｎ　流行性脑脊髓膜炎（ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ　ｍｅｎ—　ｉｎｇｉｔｉｓ，简称流脑）是由脑膜炎奈瑟菌（简称脑膜炎　球菌）感染引起的一种呼吸道传染病【　。脑膜炎球　菌为革兰阴性菌，根据荚膜多糖的化学结构可将其　分为１３个血清群，其中Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群为主　要致病菌群［２』。接种流脑疫苗是目前预防和控制　△：共享第一作者　微生物学免疫学进展２０１８年１Ｏ月第４６卷第５期Ｐｒｏｇ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏ１．Ｏｃｔ．２０１８．Ｖｏ１．４６　Ｎｏ．５　·４５·　流脑的有效措施。ＡＣＹＷ１３５群脑膜炎球菌多糖疫　苗可有效预防Ａ、Ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群脑膜炎球菌的感　染，多糖是这类疫苗的主要抗原成分，因此在其疫苗　质量控制中多糖含量的测定就显得尤为重要ｌ３　］　目前，测定ＡＣＹＷ１３５群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖　含量的方法有火箭免疫电泳法．应用火箭免疫电泳　法测定ＡＣＹＷ１３５群脑膜炎球菌多糖疫苗中多糖含　量需用到大量血清，成本较高，且影响因素较多．可　能导致实验结果重复性较差［５］。为了解决上述方　法检测多糖含量的缺点，研究人员根据糖类化合物　分子具有电化学活性及在强碱溶液中呈离子化状　态，将高效阴离子交换色谱一脉冲安培检测法（ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ａｎｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒ０ｍａｔ０ｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　ｐｕｌｓｅ　ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙｄｅｔｅｃｔｏｒ．ＨＰＡＥＣ—ＰＡＤ）开发应用于糖类　化合物的含量分析［４，　。本研究旨在建立ＨＰＡＥＣ．　ＰＡＤ测定Ａ、Ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群脑膜炎球菌多糖含量　的方法，并对该方法进行验证。　１材料与方法　１．１样品Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５群脑膜炎球菌多糖对照　品均由中国食品药品检定研究院提供；Ａ、ｃ、Ｙ、　Ｗ１３５群脑膜炎球菌多糖原液均由华兰生物疫苗有　限公司提供：６批ＡＣＹＷ１３５群脑膜炎球菌多糖疫苗　分别来自成都康华生物制品有限公司（批号　２０１７０１０１）、华兰生物疫苗有限公司（批号　２０１６０２０６．２、２０１６０３１０—１）、玉溪沃森生物技术有限　公司（批号Ｅ２０１６０４００１）、北京绿竹生物制药有限公　司（批号２０１６１１０３０、２０１６１１０３１）。　１．２主要试剂及仪器５０％氢氧化钠、三氟乙酸均　购自Ｓｉｇｍａ公司：无水醋酸钠、盐酸均购自Ｔｈｅｒｍｏ　公司：其他试剂均为国产分析纯。ＩＣＳ．５０００色谱分　析系统（脉冲安培检测器，变色龙７．０工作站）、　Ｔｈｅｒｍ０　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ　ＣａｒｂｏＰａｃ◎ＰＡ．１　４×２５０　ｍｍ　分析柱（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ　０３５３９１）、Ａｍｉｎｏｔｒａｐ　４Ｘ５０　ｍｍ　（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ　０４６１２２）保护柱、ＳＯＲＶＡＬＬ　ＳＴ　１６Ｒ高　速离心机、ＳＰＤ１０１０离心浓缩系统均购自Ｔｈｅｒｍｏ公　司：Ｍｉｌｌｉ．Ｑ纯水系统购自ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ公司；万分计　电子天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ＢＰ２１　１Ｄ）购自ＳＡＲＴＯＲＩＵＳ公　司：ＰＡＬＬ　１０Ｋ过滤膜购自Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ公司；２　ｍＬ　塑料水解管（ＬＯＴ　８０５５１０１）购自ＳＡＲＳＴＥＤＴ公司。　１．３　建立检测Ａ、Ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群多糖含量的　ＨＰＡＥＣ．ＰＡＤ　１．３．１色谱条件使用ＣａｒｂｏＰａｃ￣ＰＡ．１　４￣２５０　ｍｍ　分析柱、Ａｍｉｎｏｔｒａｐ　４ｘ５０　ｍｍ保护柱，通过优化实验　条件，确定各群多糖的洗脱条件：Ａ群多糖用１００　ｍｍｏｌ／Ｌ氢氧化铝溶液和２００　ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸钠溶液梯　度洗脱，Ｃ群多糖用１００　ｍｍｏｌ／Ｌ的氢氧化铝溶液和　８０　ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸钠溶液梯度洗脱，Ｙ和Ｗ１３５群用　１０　ｍｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液梯度洗脱．流速均为１　ｍＬ／　ｍｉｎ，２５　ＩＸＬ进样测定。　１．３．２标准曲线绘制分别将Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５群多　糖参考品进行系列倍比稀释后，应用１．３．１色谱条　件进行标准曲线绘制和线性范围的确定。以多糖抗　原标准溶液多糖质量浓度为横坐标．其相应的峰面　积为纵坐标，绘制标准曲线。计算得出回归方程。　通过测定多糖的峰值与标准品进行对比．即可得出　待检样品中多糖的含量。　１．４方法的验证　１．４．１专属性考察分别取Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５群参考　品溶液、各群多糖原液溶液及阴性对照溶液进样测　定，验证方法的专属性。　１．４．２精密度试验分别取３　ｇ／ｍＬ　Ａ、Ｃ、Ｙ和　Ｗ１３５群多糖原液，上样检测，连续进样６次，进样　量２５　Ｌ，记录峰面积，计算峰面积的平均值及相对　标准偏差（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ，ＲＳＤ）。　１．４．３准确性试验精密量取Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５群已　知含量的多糖原液２５０　Ｌ（Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５群多糖质　量分别为２．３２０　３、３．７１０　５、１．３３３　５和１．３４９　４　ｇ），　各９份，然后将每个群的９份样品分为３组，每组３　份。在３组中分别精密加入１００、２５０、４００　ＩｘＬ相应　群多糖质量浓度为６　ｇ／ｍＬ的对照品（即在Ａ、Ｃ、　Ｙ、Ｗ１３５群的３组样品中分别添加了０．６、１．５和　２．４　Ｉｘｇ相应群多糖）。将上述样品用超纯水定容至　１　ｍＬ混匀后上样，计算样品回收率。　１．４．４　高效阴离子色谱．脉冲安培检测法与火箭免　疫电泳法测定多糖含量比较取６批Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５　群脑膜炎球菌多糖疫苗，采用ＨＰＡＥＣ—ＰＡＤ和火箭　电泳法测定其Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５群多糖含量ｌ７］，并对结　果进行分析。　１．５统计学分析应用ＳＰＳＳ　１９．０软件对ＨＰＡＥＣ—　ＰＡＤ法和火箭免疫电泳法测定的疫苗多糖含量结　果进行单因素方差分析，以Ｐ＜０．０５为差异具有统计　学意义　２　结　果　２．１　Ａ、Ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群多糖含量标准曲线Ａ、Ｃ、　Ｙ和Ｗ１３５群对照品溶液在多糖质量浓度为０．５～　２７．０　Ｉｘｇ／ｍＬ范围内与相应峰面积呈良好线性关系　微生物学免疫学进展２０１８年ｌ０月第４６卷第５期Ｐｒｏｇ　ｉｎ　Ｍｉｃｍｂｉ０１　ｈｎｍｕｎｏ１．Ｏｃｔ．２０１８Ｖｏ１．４６　Ｎｏ．５　．·４７·　２．２．２精密度应用建立的方法对Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５　２．０８％、１．７８％和３．３１％，均低于５％，这表明所建立　群多糖原液进行了６次含量测定，结果显示，Ａ、Ｃ、　的方法检测结果重复性良好，其精密度试验结果，见　表１。　Ｙ、Ｗ１３５群多糖峰面积的ＲＳＤ分别为２．４０％、　表１精密度试验结果　Ｔａｂ·１　Ｔｈｅ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ＡＣ、Ｙ　ａｎｄ　Ｗ１３５　ｇｒｏｕｐ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　、注：ｎＣ￥ｍｉｎ．面积单位。　２．２．３　准确性　回收率试验结果显示，Ａ、Ｃ、Ｙ、　Ｗ１３５群多糖回收率均在９５％～１０５％之间，ＲＳＤ均＜　５％，表明该方法的准确性良好，见表２。　表２准确性试验结果　Ｔａｂ．２　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　Ａ、Ｃ、Ｙ　ａｎｄ　Ｗ１３５　ｇｒｏｕｐ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　别为３５～６５　ｇ）　Ｊ。经统计学分析，２种方法测定　的Ａ、Ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群多糖含量结果差异均无统计　学意义（Ｐ＞０．０５）。　３讨论　ＨＰＡＥＣ．ＰＡＤ在强碱性介质（ｐＨ＞１２）中根据不　同糖类化合物的酸度系数（ｐＫａ）差异引起的离子交　换作用的差异，以及某些糖类与阴离子交换树脂之　间疏水性作用的不同，实现糖类化合物的高效阴离　子交换分离：再根据羧基在金电极表面发生氧化还　原反应的电流大小检测简单糖类、胺基糖类和糖酸　的含量ｌ４　］。本研究通过优化实验步骤和各项参　数，选择适合Ａ、Ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群多糖的水解条件，　结果显示，４种多糖质量浓度在０．５～２７．０　Ｉ．ｚｇ／ｍＬ范　注：１～３．分别添加０．６、１．５和２．４　ｇ相应群多糖。　围内与相应峰面积呈良好的线性关系，建立了　ＨＰＡＥＣ．ＰＡＤ测定Ａ、Ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群脑膜炎球菌多　糖含量的方法；经验证，建立的方法具有良好的专属　性和准确性。　２．３　高效阴离子色谱．脉冲安培检测法与火箭电泳　法测定多糖质量比较分析用建立的ＨＰＡＥＣ．ＰＡＤ　与火箭电泳法分别检测６批来自４个企业的　ＡＣＹＷ１３５群脑膜炎球菌多糖疫苗中的多糖质量，结　果显示，６批疫苗Ａ、Ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群多糖质量２种　方法检测结果每剂均在３８～６４　ｇ之问，见图３。符　与传统火箭免疫电泳法比较，ＨＰＡＥＣ．ＰＡＤ不需　要使用大量特异性针对单价多糖免疫血清，分析结果　具有良好的重复性，灵敏度高。尽管火箭免疫电泳法　合《中华人民共和国药典》２０１５版（三部）中　ＡＣＹＷ１３５群脑膜炎球菌多糖疫苗质量标准（每一　次人用剂量含Ａ群、Ｃ群、Ｙ群、Ｗ１３５群多糖应分　测定多糖含量是基于单向免疫扩散和电泳相结合的　一种定量检测技术　］。与ＨＰＡＥＣ．ＰＡＤ原理完全不　同，但这２种方法测定６批ＡＣＹＷ１３５群脑膜炎球菌　·４８·　微生物学免疫学进展２０１８年１Ｏ月第４６卷第５期Ｐｒｏｇ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｎｍｍｎｏｌ，Ｏｃｔ．２０１８，Ｖｏ１．４６　Ｎｏ．５　疫苗多糖含量具有良好的相关性，差异均无统计学意　义。进一步证实新建立的ＨＰＡＥＣ—ＰＡＤ检测Ａ、Ｃ、Ｙ　一　Ｔ¨咖筐鞋　Ｓ　４　２　７　ｎ　卜’　６　和Ｗ１３５群多糖含量的准确性良好，同时也为替代火　一　箭免疫电泳法提供了最有力的实验证据。　咖　攀　２　４　５　Ａ群　Ｃ群　（】　１　２　３　４　５　６　０　２　－｛４　Ｓ　６　样品　Ｙ群　样品　Ｗ１３．５群　一　７　６　５　４　咖筐冀　３　２　ｌ　７　６　一　／蠹　咖　攀　Ｓ　４　３　２　１　［ｒｌ）　１　２　３　４　Ｓ　６　２　３　４　５　样　样．　ｆ　图３　ＨＰＡＥＣ．ＰＡＤ法与火箭电泳法测定Ａ、Ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群脑膜炎球菌疫苗多糖含量结果　Ｆｉｇ．３　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ａ、Ｃ、Ｙ　ａｎｄ　Ｗ１３５　ｖａｃｃｉｎｅ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ＨＰＡＥＣ—ＰＡＤ　ａｎｄ　ｒｏｃｋｅｔ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　综上所述．研究建立的ＨＰＡＥＣ—ＰＡＤ测定　［３］ＦＲＡＳＣＨ　Ｃ　Ｅ，ＫＡＰＲＥ　Ｓ　Ｖ，ＬＥＥ　Ｃ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐ－　ｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｍｅｎｉｎｇｏｅｏｃｃａｌ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｖａｃｃｉｎｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，２０１５，６１（Ｓｕｐｐｌ　５）：￥４０４—４０９．　ＢＥＲＥＳＦＯＲＤ　Ｎ　Ｊ，ＭＡＲＴＩＮＯ　Ａ，ＦＥＡＶＥＲＳ　１　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｑｕａｌｉｔｙ，　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ　ＡＣＷＹ—　ＡＣＹＷ１３５群脑膜炎球菌多糖疫苗中多糖含量的方　法灵敏度好、准确度高、重复性良好，且色谱峰分离　度较高，测定过程中样品处理方法简单，用时短，所　用试剂对实验人员的健康未有危害，可作为测定Ａ、　ｃ、Ｙ和Ｗ１３５群脑膜炎球菌多糖含量的替代方法，　用于检测Ａ群、Ａ群Ｃ群、ＡＣＹＷＩ３５群脑膜炎球菌　多糖疫苗原液及成品中多糖含量。　参考文献　ＷｏＡｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ　ｆａｃｔ　ｓｈｅｅｔ　ＣＲＭ１９７，ＤＴ　ａｎｄ　ＴＴ　ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｖａ（：ｃｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，　２０１７，３５（２８）：３５９８－３６０６．　李世慧，赵俊，张霖阳，等．火箭免疫电泳法榆测ＡＣＹＷ１３５　群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量和分子大小的初步验证『Ｊ］．　微生物学免疫学进展，２０１４，４２（１）：２０—２４．　ＣＯＯＫ　Ｍ　Ｃ，ＧＩＢＥＡＵＬＴ　Ｓ，ＦＩＬＩＰＰＥＮＫＯ　Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉ（）ｎ　ｏｆ　ｍｕｈｉｖａｌｅｎｔ　ｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－－ｃｏｎ－－　ｊｕｇａｔｅ　ｍｅｎｉｎｇｏｅｏｅｅａｌ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｆｏｍ　Ｃｈｉｒｎａ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２０１３，　４１（４）：２６１—２６８．　２０１　８［ＥＢ／ＯＬ］．［２０１８—０２—１９］（２０１８－０６－１５）．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．　ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ１４１／ｅｎ／．　国家药典委员会．中华人民共和国药典（＿二部）［Ｓ］．北京：中　国医药科技　版社，２０１５：７７．７９．　收稿日期：２０１８－０６—１５修回日期：２０１８－０８．２７　编辑：陈凌云　－２０１４年流行性脑脊髓　［２］　李军宏，李艺星，吴丹，等．中国２００６－膜炎病例菌群分布特征及变迁趋势［Ｊ］．中国疫苗和免疫，　２０１５，２１（５）：４８１—４８５．