中蜂囊状幼虫病毒多克隆抗体的制备

３４　樊琼：中蜂囊状幼虫病毒多克隆抗体的制备　２０１４年第１期　中蜂囊状幼虫病毒多克隆抗体的制备　樊　琼　，费东亮　，马鸣　潇　（１．辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州１２１００１；　２．辽宁省锦州市动物疫病预防控制中心，辽宁锦州　１２１０００）　摘要：利用中蜂囊状幼虫病毒（ＣＳＢＶ）灭活疫苗作为抗原制备兔多克隆抗体。利用ＲＴ－ＰＣＲ方法对疑似感染　ＣＳＢＶ的中蜂样品进行检测，检测阳性后，经差速离心法纯化ＣＳＢＶ，并用ＢＣＡ方法检测病毒浓度，将病毒浓度稀释至　０．２５　ｍｇ／ｍＬ。按稀释后的ＣＳＢＶ体积的０．３％加入甲醛灭活进行灭活，制备ＣＳＢＶ油乳剂灭活苗，经无菌、安全性和稳　定性检验合格后，对新西兰大白兔进行３次免疫，每次间隔２周，对其产生的多克隆抗体进行了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析和效　价检测，结果表明制备的兔多克隆抗体效价ＯＤ值最高可达到１．１０９。实现了中蜂囊状幼虫病毒高效价多克隆抗体的　制备，为深入研究ＣＳＢＶ和综合防治奠定了基础。　关键词：中蜂囊状幼虫病毒；灭活苗；多克隆抗体　中图分类号：￥８９５．１　３３　文献标识码：Ｂ　文章编号：１６７２—９６９２（２０１４）０１—００３４—０４　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓａｃｂｒｏｏｄ　Ｂｅｅ　Ｖｉｒｕｓ　Ｆａｎ　ｑｉｏｎｇ　一，Ｆｅｉ　Ｄｏｎｇｌ　ｉａｎｇ　，Ｍａ　ｍｉｎｇｘｉａｏ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｊｉｎｚｈｏｕ　１２１００１：　２．Ｊｉｎ　ｚｈｏｕ　Ａｎｉｍａｌ　Ｅｐｉｄｅｍｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ａｎｔｉｃｉｐａｔｏｒｙ　Ｃｏｎｔｒｏ］Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｊｉｎｚｈｏｕ　１２１０００）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａ　ｓａｆｅ，ｅｆｆｅｃｔｉｒｅ　ａｎｄ　ｑｕａｌｉｔｙ—ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｓａｃ—　ｂｒｏｏｄ　ｖｉｒｕｓ　ｆｏｒ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｓａｃｂｒｏｏｄ　ｖｉｒｕｓ．Ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ　ｂｅｅｎ　ｌａｒｖａｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉ—　ｆｉｅｄ　ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＣＳＢＶ，ａｎｄ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＢＣＡ，ｔｈｅｎ　ｄｉｌｕｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　０．２５　ｍｇ／ｍ１．Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｓａｃｂｒｏｏｄ　ｖｉｒｕｓ　ａｒｅ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｂｙ　０．３％ｆｏｒｍａ１ｄｅｈｙｄｅ，　ａｎｄ　ｏｉｌ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｗｅｒｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｅｒｉＩｉ—　ｔｙ，　ｓａｆｅｔｙ，　ａｎｄ　ｓｔａｂｉ１ｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ０ｎ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ　Ｒａｂｂｉｔ　ｗｅｒｅ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｆｏｒ　３　ｔｉｍｅｓ，ｏｎｃｅ　ｔｗｏ　ｗｅｅｋｓ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ａｎａｌｙｓｉＳ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｓａｃｂｒｏｏｄ　ｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　０Ｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｉｔｅｒ　ｉＳ　ａｓ　ｈｉｇｈ　ａｓ　１．１０９．Ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｔｉｔｅｒ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｉＳ　ｐｒｅｐａｒｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＳＢＶ．　Ｋｅｙ　ＷＯｒｄｓ：ＣＳＢＶ；Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｖａｃｃｉｎｅ；Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　中蜂囊状幼虫病是由中蜂囊状幼虫病毒（ＣＳＢＶ）　蜂囊状幼虫病防控措施主要采取化学药物治疗和抗　引起的以蜂王产卵下降、老龄蜂死亡、幼虫大量死　病力强的蜂群育王繁殖等措施，但收效并不显著。　亡为特征疾病Ⅲ。一旦发生会对中蜂幼虫造成毁灭　随着病毒学和免疫学研究不断深入，利用生物制剂　性打击，甚至引起整个蜂群毁灭。该病于１９７２年首　为该病预防与治疗提供了新思路。目前对ＣＳＢＶ研究　次在广东发生，随后迅速蔓延至全国。２０１２年Ａｉ　Ｈ　仅局限于一些毒株的测序，而对其分子生物学特　等人通过对我国蜂病毒流行情况调查，发现ＣＳＢＶ仍　性、遗传进化关系、对其病毒的免疫原性研究　，　然是阻碍中蜂业发展的首要原因　。目前，针对中　相关报道较少，仅有利用ＣＳＢＶ结构基因进行蛋白表　收稿日期：２０１４—０１—０２　作者简介：樊琼（１９８７一），男，硕士，主要研究方向分子病毒学。　通讯作者：马鸣潇（１９７３－），男，博士，教授，主要研究方向分子病毒学。　基金项目：国家自然基金（３１３７２４３５），辽宁省人力资源和社会保障厅（Ｎｏ．２０１１９２１０２１）　２０１４年第１期　达制备抗血清的报道　，但抗原为部分结构蛋白，　计了１对引物，送至大连宝生物工程有限公司合　产生的抗体水平较低。本研究以灭活的ＣＳＢＶ作为抗　成。引物序列如下：　原，制备兔多克隆抗体，为研制中蜂囊状幼虫病的　Ｆ：５’一ＣＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＧ一３’　深入研究和综合防治奠定基础。　Ｒ：５’一ＧＣＧＴＧＡＧＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＴＣ－３’　１材料与方法　１．１．３主要仪器高速冷冻离心机，中试管７支枪式　１．１试验材料　移液管，ＰＣＲ仪，恒温水浴箱，７２２０型分光光度计　１．１．１病料与试验动物锦州周边蜂厂疑似患中蜂　１．２试验方法　囊状幼虫病毒病病蜂；８只雄性健康新西兰大白兔体　１．２．１病料采集与检测将疑似感染ＣＳＢＶ的中蜂样　重１．５　左右。　品，用ＴＲＩｚｏｌ提取病毒总ＲＮＡ，并以病毒总ＲＮＡ为模　１．１．２试剂配制及引物设计试剂Ａ：１％ＢＣＡ二钠　板，利用本实验室建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法对进行检测”　。　盐，２％无水碳酸钠，０．１６％酒石酸钠，０．４％氢氧化　ＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。　钠，０．９５％碳酸氢钠，混合调ｐＨ值至１１．２５；试剂　１．２．２病毒的纯化参照冯建勋等　方法，对感染　Ｂ：４％硫酸铜；ＢＣＡ工作液：试剂Ａ　１００　ｍＬ＋试剂Ｂ　ＣＳＢＶ的幼虫进行超速离心　得到足够浓度和高纯度　２　ｍＬ混合：蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根　的病毒。　据其纯度用生理盐水配制成１．５　ｍｇ／ｍＬ的蛋白质标　１．２．３病毒蛋白浓度测定利用ＢＣＡ法　检测浓度，　准液，ｐＨ＝７．６磷酸盐缓冲溶液、氯仿、甲醛、吐　首先取７支试管标号如表１所示加入试剂，混匀后　温一８０、司本一８０、１０号白油、ｌＯＯｘＲｒｏｂｅ—Ｒ探针、　３７℃下保温３０　ｍｉｎ，在５７０　ｎｍ测ＯＤ值并计算浓　ＩＯＯｘＴＭＢ（Ａ）和１００ｘＴ—ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ）显色液。　度。　根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＣＳＢＶ基因组序列及有关文献设　表１病毒蛋白浓度测定　Ｔａｂｌｅｌ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ＣＳＢＶ　１．２．４病毒的灭活用ｐＨ　７．６磷酸盐缓冲液将ＣＳＢＶ　Ｉ．２．７试验动物的免疫用制备好的疫苗用来免疫４　浓度稀释至０．２５　ｍｇ／ｍＬ，按稀释后的囊状幼虫病毒　只雄性体重在１．５　ｋｇ的新西兰大白兔编号为Ｒ１、　体积的０．２％加入甲醛灭活２４　ｈ　。　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４，基础免疫采用皮下注射免疫，共注射６　１．２．５疫苗的制备灭活后的病毒按体积比的４％ＤＮ　点，每点注射０．２　ｍＬ，分别间隔２周后进行二免和　。入吐温一８０，做水相；司本－８０与１０号白油按体积比　三免，并在初免后的７　ｄ后利用间接ＥＬＩＳＡ法检测抗　１：１４混合，在１２１．３℃温度下灭菌，做油相；水相　体效价，当效价达到一定值，不再上升时，于兔耳　与油相体积比为２：３，先将油相在８　０００　ｒ／ｍｉｎ搅　中央动脉大量取血，取得血清一２Ｏ℃保存备用。　拌，再缓慢加入水相，１２　０００　ｒ／ｍｉｎ搅拌４　ｍｉｎ。　１．２．８　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法检验血清中的ＩｇＧ按照Ｌａｅｍ　１．２．６疫苗检验对制备疫苗进行无菌检验、完全　ｍＬｉ体系，分离胶ｌ２．５％，电压１３５　ｖ，时间２　ｈ，考　灭活检验、安全性检验和离心稳定性试验。　马斯亮蓝－Ｒ２５０染色。　２０１４年第１期　ｍｏｄｅｒｎ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ａｎｉｍａｌ　ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　ａｎｄ　ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３７　３讨论　制备高效价抗体是示踪基因表达和研究基因功　能的前提。多克隆抗体虽然在特异性、稳定性方面　不如单克隆抗体，但其制备简便、成本低廉、具有　［２］Ｅｌｖｉｒａ　Ｇ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ　Ｒ，ｍｉｃｈａｅｌ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｓａｃ—　ｂｒｏｏｄ　Ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｏｎｅｙｂｅｅ（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）：　Ｒａｐｉｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ０ｎ　ａｎｄ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅ　ｔｉｃＡｎａｌｙ—　ｓｉｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ＰＣＲ［Ｊ］．ＬＩＮＩＣＡ—　ＬＡＮＤ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１，　多个与抗原决定簇结合的位点，使其大量应用于免　疫学研究　。对于ＣＳＢＶ的免疫学研究尚处于起步阶　８（１）：９３—９４．　段，对其免疫原性的结构蛋白尚不清楚，给相关研　究带来困难。同时，昆虫类动物缺乏哺乳动物所具　［３］张琳，钱爱东，毛靖宇．　中蜂囊状幼虫病毒ＬＮ—ＱＹ株ｖＰ２结构蛋白的基因分析及Ｂ细胞抗原表位预测［Ｊ］．辽　有的获得性免疫系统，只能通过天然的免疫系统抵　制各种病原微生物的侵染　“　。因此，利用兔子制　备ＣＳＢＶ多克隆抗体的成功，给ＣＳＢＶ免疫学研究提供　了新的思路。　另外，随着化学抗病毒药物带来的诸多弊端被　人们所认识，科学家正致力于寻找新型抗病毒制　剂，多克隆抗体具有廉价、安全、有效、易获得等　优点，且不存在药物残留和耐药性等问题，非常符　合我国畜牧业生产的实际，可广泛应用于动物疾病　的预防、诊断和治疗，具有较广阔的市场开发和综　合利用的前景　。本试验利用ＣＳＢＶ纯化毒制备的灭　活疫苗免疫大白兔制备了ＣＳＢＶ多克隆抗体，具有较　高效价，为ＣＳＢＶ的深入研究、血清学调查、试剂盒　的研制和ＣＳＢＶ治疗性生物制剂开发等奠定了基础。　４结论　通过本试验，成功制备了兔抗ＣＳＢＶ的多克隆抗　体，经ＥＬＩＳＡ检测有较高效价，为深入研究ＣＳＢＶ提　供了条件。　参考文献　［Ｉ］Ｅｌｖｉｒａ　Ｇ，Ｔａｍｓ　Ｂ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐ—　ｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｓｉｍｕｌｔａｎｅ—　ＯＵＳ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｏｎｅｙｂｅｅ　（ＡｐｉＳ　ｍｅｌ１ｉｆｅｒａ　Ｌ．）：Ａｃｕｔｅ　ｂｅｅ　ｐａｒａｌｙｓｉｓ　ｖｉ—　ｒｕｓ，Ｂｌａｃｋ　ｑｕｅｅｎ　ｃｅｌ　１　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　Ｓａｃｂｒｏｏｄ　ｖｉｒｕｓ　［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００７，　９４：２２２—２２５．　’宁医学院学报，２０１２，５：３７—３９．　［４］沈克飞，张邑帆，曹兰，等．中蜂囊状幼虫病病毒结构蛋　白的表达及其抗血清的制备［Ｊ］．中国生物制品杂志，　２０１１，２６（一１）：４２—４４．　［５］马鸣潇，李明，袁春颖，等．中蜂囊状幼虫病毒ＲＴ－ＰＣＲ　检测方法的建立［Ｊ］．中国生物制品学杂志，２０１０，２３　（４）：４２５－４２７．　［６］冯建勋，卢忻英，张勤奋，等．中蜂囊状幼虫病毒的纯　化、结晶与结构研究［Ｊ］．电子显微学报，１９９８，１７（４）：　３８７—３８８．　［７］周祖钊，朱文雅，彭小玲，等．ＢＣＡ法测定微量蛋白质的　初步评价［Ｊ］．临床检验杂志，１９９２，１０（３）：１３４—１３６．　［８］贾满民．甲醛杀菌灭活病毒机理及沉淀后的解聚法浅　议［Ｊ］．中国兽医杂志，１９９２，１２：２５—２７．　［９］Ｔａｍａｓ　Ｂ，Ｅｌｖｉｒａ　Ｇ，Ｊｏｌａｎｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅ—　ｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ａｃｕｔｅ　Ｂｅｅ　Ｐａｒａｌｙｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ　Ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉ—　ｏｌｏｇｙ，２００２，６８（１２）：６４４６—６４５０．　［１０］Ｍｏｎｇｉ　Ｂｅｎｊｅｄｄｏｕ，Ｎｅｉ１　Ｌｅａｔ，Ｍｉｋｅ　Ａｌｌｓｏｐｐ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｌａｃｋ　ｑｕｅｅｎ——ｃｅｌｌ　ｖｉ—　ｒｕｓ　ｏｆ　ｈｏｎｅｙ　ｂｅｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｙｉ—　ｒｏｌｏｇｙ，２００２，８３：３１３９—３１４６．　［１１］张为露．治疗中蜂囊状幼虫病的措施［Ｊ］．蜜蜂杂志，　２００ｌ，６：４２．　［１２］龚凫羌，宁守容．中蜂囊状幼虫病发生机理与预防方　法［Ｊ］．蜜蜂杂志，２００９，８：２７—２９．　（编辑：张婷婷）