小米糠水溶性非淀粉多糖抗氧化活性研究

小米糠水溶性非淀粉多糖抗氧化活性研究

姜龙波1，王 雷2，董吉林2，申瑞玲2

（1.山西农科院谷子研究所，山西长治046011；

2.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州 450001）

摘 要：为了合理开发利用小米糠资源，提取小米糠中水溶性非淀粉多糖（SNSP），分析了SNSP的相对分子质量和单糖组成，测定了其中总酚与黄酮含量，并以对DPPH·、O2-·、ABTS+·、·OH清除能力以及Fe2+螯合能力和Fe3+还原能力为指标，研究了小米糠及SNSP的抗氧化活性。结果表明，SNSP的重均相对分子质量为1.930×106g/mol，主要单糖为葡萄糖；SNSP中总酚与黄酮含量分别为426.12 µgGAE/g与64.19 µgRE/g；与小米糠相比，SNSP具有较强的抗氧化活性，尤其是对·OH、O2-·的清除能力以及Fe3+还原能力和Fe2+螯合能力（P<0.05）。

关键词：小米糠；水溶性非淀粉多糖；抗氧化性

Study on antioxidant activity of water-soluble non-starch polysaccharides of

millet bran

JIANG Long-bo1, WANG Lei2, DONG Ji-lin2, SHEN Rui-ling2

(1.Millet Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Changzhi 046011, Shanxi,China;

2. College of Food and Biological Engineering, Zhengzhou University of Light Industry,

Zhengzhou 450001, Henan, China)

Abstract: In order to rationally develop and utilize the millet bran, the water-soluble non-starch polysaccharide (SNSP) was extracted from the millet bran. The molecular weight and monosaccharide composition of SNSP were analyzed, and the content of total phenols and flavonoids were also determined. The antioxidant activities of millet bran and SNSP were evaluated with DPPH·,O2-·, ABTS +·, ·OH scavenging ability, Fe2+ chelating ability and Fe3+ reducing ability as indicators. The results showed that the weight average molecular weight of SNSP was 1.930×106 g/mol and the main monosaccharide was glucose. The contents of total phenols and flavonoids in SNSP were 426.12 μgGAE/g and 64.19 μgRE/g, respectively. Compared with millet bran, SNSP had strong antioxidant activity in vitro, especially for ·OH, O2-· scavenging ability , Fe3+ reducing ability and Fe2+ chelating ability (P <0.05).Key words: millet bran; water-soluble non-starch polysaccharides; antioxidation

中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：1008-9578（2019）12-0098-04

谷子（Setaria italica）是重要的粮食作物和食品加工原料，品种繁多，在我国种植面积广泛，有华北、东北和西北三大产区，产量丰富[1]。小米糠作为加工副产物约占谷子总量的5 %~7 %，主要由小米的果皮、种皮、糊粉层、少量胚和胚乳组成，富含蛋白质、脂肪、矿物质、维生素和膳食纤维等营养成分。目前小米糠主要是用于畜禽饲料，对其营养价值和综合利用的研究较少[2]。为了促进小米糠资源的高效利用，提高附加值，有必要对其营养成分和功能性质进行深入研究。

目前已有关于小米糠油、小米糠蛋白以及小米糠膳食纤维提取及功能性质的研究报道。赵陈勇等[3-4]利用有机溶剂提取小米糠油，并对其抗氧化

和降血脂作用进行了研究；康丽君等[5]、曹龙奎[6]利用超声-微波协同法对气爆预处理后的小米糠膳食纤维进行改性试验，并对改性后小米糠膳食纤维的结构组成和α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性进行了进一步研究；于书佳[7]研究了小米糠多肽的制备方法及其功能特性。然而对小米糠膳食纤维抗氧化活性的研究较少，CHANDRASEKARA等[8]研究了不同品种小米中酚类物质的含量及其抗氧化活性；BIJALWAN等[9]测定了不同品种小米糠中与羟基肉桂酸结合的阿拉伯木聚糖（HCA-AX）的抗氧化性，结果表明抗氧化能力与取代结合度有关。非淀粉多糖（NSP）是谷物中重要的膳食纤维组分，可分为水溶性非淀粉多糖（SNSP）和不溶性非淀粉多糖

收稿日期：2018-01-26

基金项目：国家自然科学基金项目（31671856）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目（nycytx-13）作者简介：姜龙波（1980—），男，助理研究员，硕士，研究方向为谷子深加工及育种。通信作者：申瑞玲（1967—），女，博士，教授，研究方向为谷物加工与营养

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（INSP）。水溶性非淀粉多糖中包含一定的多酚及黄酮类物质，具有预防心脑血管疾病、改善肠道菌群、抗氧化、清除自由基和预防结肠癌等功效[10-11]。为此，本研究以小米糠为原料，提取其中水溶性非淀粉多糖（SNSP），测定体外抗氧化活性，目的是深入了解小米糠膳食纤维组分的营养功能，为小米糠资源的高效利用提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂

小米糠：由山西省农科院谷子研究所提供；小米糠SNSP：实验室自制。福林酚（1mol/L）、邻苯二甲醛、芦丁标准品、乙二胺四乙酸（EDTA）、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：纯度均大于98%；乙腈和乙酸：色谱纯。1.2 主要仪器

HWS-26电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司； DAWNHELEOSⅡ多角度激光散射凝胶色谱系统：美国Wyatt技术公司；Agilent 7820A气相色谱仪：安捷伦科技(中国)有限公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司； RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FD-1A-50真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司。1.3 试验方法

1.3.1 小米糠水溶性非淀粉多糖的制备

小米糠→粉碎过筛（孔径355 μm）→热水浸提→离心取上清液→去淀粉（耐高温α-淀粉酶和糖化酶）→灭酶→去除蛋白质（蛋白酶）→灭酶→离心取上清液→真空浓缩→4倍体积乙醇醇析→离心得沉淀→95%乙醇洗涤→冷冻干燥→小米糠SNSP（多糖含量>90%）

1.3.2 小米糠水溶性非淀粉多糖的相对分子质量与单糖组成

1.3.2.1 小米糠SNSP的相对分子质量分析以超滤过的流动相为溶剂将一定量的小米糠SNSP配制成5 mg/mL的溶液，使用凝胶渗透色谱和多角度激光散射联用系统（GPC-MALLS）测定样品相对分子质量[12]。

1.3.2.2 小米糠SNSP的单糖组成

对小米糠SNSP进行水解及单糖衍生化处理：将0.5 g样品置于圆底烧瓶中，用3.0 mol/L硫酸溶胀2 h后加水稀释至1 mol/L，在100 ℃水解8 h，冷却。用Ba(OH)2将水解液调至中性，过滤、定容，准确移取250 μL溶液在70 ℃真空干燥，样品衍生

化处理后进行气相色谱分析。色谱条件：毛细管柱19091N-133（30 m×250 μm×0.25 μm），FID检测器，平衡时间30 s，最高温度260 ℃；程序升温190 ℃保持3 min，然后以5℃/min的速度升温至240 ℃保持20 min，总运行时间33 min，分流比30∶1，进样量1 μL。

1.3.3 小米糠及其SNSP的抗氧化性质1.3.3.1 总酚含量的测定

样品甲醇浸提液制备：分别称取1g小米糠和SNSP样品，各加入10 mL 50 %甲醇溶液并于80 ℃水浴振荡2.5 h，在4 500 r/min条件下离心5 min，重复操作3次，合并上清液定容至10 mL，得到0.1 g/mL样品浸提液。以没食子酸溶液为标准，分别取1 mL小米糠及SNSP样品浸提液于10 mL容量瓶中，加入显色剂和碳酸钠并定容至10 mL，避光反应后于725 nm处测定吸光度，总酚含量以没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）表示（ μg GAE/g）。1.3.3.2 黄酮含量的测定

以芦丁溶液为标准，分别取1 mL小米糠及SNSP样品浸提液于10 mL容量瓶内，加入乙醇至5 mL，再依次加入亚硝酸、硝酸铝和氢氧化钠溶液并定容至10 mL，避光反应后于510 nm处测定吸光度，总黄酮含量以芦丁当量（rutin equivalent，RE）表示（ μg RE/g）。

1.3.3.3 DPPH·清除能力

分别取0.2 mL小米糠和SNSP样品稀释液（25 mg/mL）于试管中，加入100 umol/L的 DPPH甲醇溶液0.8 mL，摇匀避光静置后于517 nm处测得吸光度值A样品，甲醇溶液作对照。

DPPH·清除率=（1-A样品/A对照）×100% （1）1.3.3.4 ABTS+·清除能力

分别取0.1 mL小米糠和SNSP样品稀释液（10 mg/mL）于试管中，加入ABTS+·储备液至3 mL反应6 min，于734 nm处测得吸光度值，无水乙醇作空白对照。

ABTS+·清除率=(A空白-A样品)/A空白×100% （2）1.3.3.5 O2-·清除能力

采用邻苯三酚自氧化法生成O2-·，先将Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）在水浴锅中预热20 min（25 ℃），分别取1 mL小米糠和SNSP样品稀释液，加入1 mL 25 mmol/L邻苯三酚，混匀后于25 ℃水浴反应5 min，加入1 mL浓盐酸终止反应，于波长320 nm处测吸光度值，乙醇代替样品做空白。

O2-· 清除率=(A空白-A样品)/A空白×100 % （3）

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1.3.3.6 ·OH清除能力

采用水杨酸捕获法来进行测定，分别吸取2 mL小米糠和SNSP样品稀释液，加入到反应体系（3 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、3 mmol/L FeSO4、3 mmol/L H2O2）中，在37 ℃水浴中反应30 min，乙醇代替样品做空白，于波长510 nm处测得吸光度值。

·OH清除率= (A空白-A样品)A空白×100 % （4）1.3.3.7 Fe3+还原能力

分别取1 mL小米糠及SNSP样品浸提液，加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和1%的K3Fe(CN)6溶液，在50 ℃水浴反应20 min，冷却后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，以1 800 r/min离心10 min，取适量上清液加2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，混合均匀，静置20 min后在波长700 nm处测定吸光度，乙醇代替样品液做空白。以维生素C溶液为标样作标准曲线，还原能力表示为μmol维生素C当量/g样品。

还原能力=(A样品-A空白)/A样品×100 % （5）1.3.3.8 Fe2+螯合能力

分别取1mL小米糠及SNSP样品浸提液，加0.05 mL 2 mmol/L的FeSO4溶液和0.2 mL 5 mmol/L的菲洛嗪溶液(空白加等体积的双蒸水)，定容至4 mL，混合液振荡30 s后于室温静置10 min，在波长562 nm测定反应混合物的吸光度。对照组以80 %的甲醇代替样品。以EDTA溶液为标样作标准曲线，螯合能力表示为μmolEDTA当量/g样品。

Fe2+螯合能力=(A空白-A样品)/A空白×100 % （6）1.4 数据统计及分析

采用GC-MS5977和SPSS 20.0软件对数据进行整理与分析，结果以平均值±标准偏差表示。2 结果与分析

2.1 小米糠水溶性非淀粉多糖的分子量与单糖组成

Strip Chart: SNSP-2mL

3.0×10

-5

0.07

)-5

V(e0.06

2.0×10

gatlov ro0.05

1.0×10-5

tceted0.04

0.0

differential refractive index(RI U)0.03

-1.0×10

-5

0.0 10.0 20.0 30.0

time/min

图1 小米糠SNSP的GPC-MALLS色谱图由图1可知：小米糠SNSP样品在9.596~11.433 min

内出现一个最强峰，得到相对分子质量的质量分

布和宽度，由表1可知：SNSP重均相对分子质量为1.930×106 g/moL，d值（PDI）为1.931,反应出SNSP样品相对分子质量分布较为集中且均匀。非淀粉多糖主要包括β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖和果胶聚糖等。本研究测得小米糠SNSP的单糖组分如表2所示，其中单糖以葡萄糖为主（57.7%），其次为木糖和阿拉伯糖。同时，有研究表明酶的添加量以及不同的多糖提取方式对单糖组分含量有显著影响[13-14]。

表1 小米糠SNSP的相对分子质量

表2 小米糠SNSP中单糖组分含量

/%2.2 小米糠SNSP的抗氧化性研究2.2.1 总酚和总黄酮含量

表3 小米糠及SNSP中总酚和黄酮含量

有研究发现，膳食纤维中细胞壁多糖大多与其他物质紧密结合在一起，大约95%的酚酸和多糖以酯键结合形成膳食纤维-抗氧化复合物[15]。因此，在小米糠水溶性多糖提取过程中部分多酚类物质也随着被一起提出。小米糠及其SNSP中总酚和黄酮含量如表3所示，SNSP中总酚和黄酮含量均低于小米糠，分别为426.12 μgGAE/g和64.19 μgRE/g，这可能与其品种产地有关，同时，在SNSP提取的过程中可能有部分结合态的多酚及黄酮类物质未被一起提出，存在成分流失等问题。另外，DUEAS等[16]研究也发现黑豆和扁豆不溶性膳食纤维中酚类物质含量显著高于可溶性膳食纤维。

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2.2.2 小米糠及SNSP的DPPH·、ABTS+·、·OH及O2-·清除能力

表4 小米糠及SNSP的自由基清除能力

/%由表4可知：SNSP对DPPH·和ABTS+·清除率低于小米糠，而O2-·和·OH清除率高于小米糠，且均有显著性差异（P<0.05）；小米糠对ABTS+·清除率最高（73.55 %），对·OH清除率较低，而SNSP对4种自由基均有较强的清除能力。表明SNSP具有一定抗氧化能力。然而，也有研究发现米糠醇提天然抗氧化物对O2-·和·OH有较强的清除能力（高于70 %）[17]，这可能是不同提取条件对抗氧化成分造成不同程度损失的原因，另一方面这也显示抗氧化因子对不同自由基清除能力存在一定差异。

2.2.3 Fe3+还原能力及Fe2+螯合能力

表5 小米糠及SNSP的维生素C和EDTA当量值

生物或食品体系中的抗氧化有益作用机制包括以下几个方面：直接猝灭自由基致使自由基链反应终止，螯合过渡态金属离子从而抑制自由基的形成，作为还原剂以及刺激抗氧化保护酶的活性[18]。还原能力和螯合能力均可体现抗氧化能力强弱，如表5所示：小米糠SNSP的Fe3+还原能力和Fe2+螯合能力均高于小米糠，且具有显著性差异（P<0.05）。同时也有研究发现膳食纤维的改性处理（纤维素酶和木聚糖酶的添加）对抗氧化活性有较大影响[19]，这也为小米糠膳食纤维的进一步改性研究提供了理论依据。3 结论

小米糠水溶性非淀粉多糖（SNSP）中多酚和黄酮类物质含量丰富，单糖组分以葡萄糖为主（57.7%）；与小米糠相比，SNSP对DPPH·、ABTS+·清除能力稍低，但对·OH、O2-·清除能力以及Fe3+还原能力和Fe2+螯合能力均较高，说明SNSP具有良好的抗氧化活性，在食品和保健产品中的具有潜在的应用价值。

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