HLA---SSP技术规范
一、 标本采集
取EDTA抗凝剂150ul，采静脉血1.5ml，混匀。
二、1、2、3、4、量）。
5、6、7、8、9、
DNA提取
在1.5ml反应管中加入300ul全血（不要用肝素抗凝血）。
加入900ul红细胞裂解液。
完全摇匀，在RT（室温）下孵育10分钟。
在13000-16000rpm的转速下旋转20秒。（产生的白色小球提示DNA大概数吸取上层清液后剩余液体的体积大约为20-30ul。
用VETEX旋转剩余体积中的小球（如果不用移液管的话）。
加入300ul细胞裂解液并反复上下晃动移液管，使之混匀。
加入100ul蛋白质沉淀液，旋转20秒。
在13000-16000rpm的转速下旋转3分钟。
1
10、 小心地把含有DNA上清液移入干净的1.5ml反应管中，并加入300ul异丙醇。
11、 轻轻摇动试管，DNA就会析出形成可见的絮状物或小块。
12、 在13000-16000rpm的转速下旋转1分钟。DNA沉淀凝结。
13、 抛掉上层清液，并把试管倒置于吸水纸上，以防DNA流失。
14、 加入70% 的（乙醇）Ethanol 300ul，轻轻摇匀。
15、 在13000-16000rpm转速下旋转1分钟。
16、 小心倒掉上层清液（小球可能会流失，所以慢慢的倒），把试管倒置于吸水纸上，并在空气中晾干15分钟。
17、 加入100ul DNA溶解液（万一细胞数量少），用紫外线分光光度计检测DNA的浓度或纯度。
18、 DNA浓度为25-200ug/ul(100ug/ul较理想)，A260/A280在1.65-1.80之间。
三、 扩增
1、 加1微升DNA稀释液，如无菌水或Tris-HCL,到阴性对照孔内（1H,4H,7H,10H）
2、 加2微升Taq酶（Promega酶）到D-Mix管内。震动器震动5秒钟，微型离心机离心1秒
2
3、 加9微升上述D-Mix液到阴性对照孔内（1H，4H，7H,10H）
4、 加29微升DNA到上述D-Mix液内
5、 加样时使液体顺管壁流下，避免交叉污染，混匀，除阴性孔外，每孔加10ul。进入扩增流程。
6、 扩增流程按试剂盒规定设置。
四、 凝胶电泳
1、制凝:配制2%的琼脂糖凝胶，熔化加Etbr（溴化已碇）0.5ug/ml，室温30分钟。
2、将扩增产物转至微量胶孔内，此时应注意顺序。
3、电泳时间为3-5分钟（微胶系统），140-150伏，红色标记物移动0.5公分左右。
五、 结果分析
根据读板纸分析结果
六、 注意事项
1、 样品不应溶在含有螯合物的试剂中，如0.5MM以上浓度的EDTA，不用肝素作抗凝剂。
3
2、 分离出的DNA可储存于-20℃冰箱中。
3、 试剂盒包装包括：微量SSP板，D-Mix，密封条。用前需达室温（包括DNA样品）。
4、 Taq酶应保持在装有冰的器皿上。用后立即放回冰盒。
七、 常见问题
1、 无反应带或反应带弱
DNA量不足或存在PCR抑制剂。
Tab酶量不足。
EtBr量不足。
2、 假阳性带
DNA量过多。
DNA不纯或污染。
Tab酶量过多。
3、 阴性空中出现反应带
4
DNA污染或PCR程序输入错误。
5
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容