溶菌酶的提取及系列性质的测定

溶菌酶的提取及系列性质的测定

摘要

本文 研究了从新鲜蛋清中提取溶菌酶的方法及其溶菌酶一系列性质的测定。通过采用离子交换树脂和硫酸铵沉淀法对鸡蛋清中的酶提取，采用凝胶层析法对提取的溶菌酶进一步纯化，并用考马斯亮蓝G-250试剂，脲的试剂及SDS-PAGE不连续电泳的原理和实验方法分别对溶菌酶的酶活力、蛋白质浓度、酶促动力学、分子量及纯度进行了测定。

关键字：新鲜鸡蛋，溶菌酶，提取，性质，测定 溶菌酶的简介

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。

实验目的：

1、了解酶的基本研究过程。

2、掌握溶菌酶提取和性质测定中的实验方法。 3、熟悉有关生化技术的基本原理和基本操作。

I．实验准备

一 实验目的

1.熟悉并了解整个实验流程。 2.熟练掌握各种溶液的配制。

二 实验仪器及材料

仪器：柱层析系统（层析柱，恒流泵，紫外监测仪，部分收集器），Sigma高速冷冻

离心机，722s分光光度计，透析袋，水浴锅，电泳仪，电泳槽，紫外凝胶成像系统。 材料：新鲜鸡蛋。

试剂：（1）弱酸性阳离子交换树脂；（2）磷酸氢二钠；（3）磷酸二氢钠；（4）氯化钠；（5）硫酸铵；（6）氢氧化钠；（7）甘油；（8）盐酸；（9）葡聚糖凝胶G-50；（10）溶壁微球菌干粉；（11）考马斯亮蓝G-250；（12）95%乙醇；（13）85%磷酸；（14）牛血清清蛋白(BSA)；（15）脲；（16）丙烯酰胺（Acr）；（17）甲叉双丙烯酰胺（Bis）；（18）四甲基乙二胺（TEMED）；（19）甘氨酸(Gly)；（20）过硫酸铵（AP）；（21）考马斯亮蓝R-250；(22)三羟甲基氨基甲烷（Tris）；（23）2-β-巯基乙醇；（24）十二烷基磺酸钠（SDS）；（25）溴酚蓝；（26）冰醋酸；（27）标准蛋白：SDS-低相对分子质量标准蛋白.

三 试剂配制

(1) 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；【配置成5*500ml，临用前稀释】 (2) 2mol/L NaOH；200ml (3) 2mol/L HCl；200ml

(4) 含50%甘油的0.1mol/L 磷酸盐缓冲液，pH 7.0；200ml

(5) 含0.05mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml (6) 含0.5 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml (7) 含0.1 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】 (8) 测活缓冲液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；

(9) 底物溶液Ⅰ：40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中；【公用，临用前配置】

(10) 考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤；【公用】

(11) 标准蛋白质溶液：用0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液；（100ml）

(12) 底物溶液Ⅱ：300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中；【公用，临用前配置】

(13) 10mol/L 脲，测活缓冲液配制；【50ml】

(14) 30%胶贮液：每100mL中含丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g；【100ml公用】

(15) 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8；【100ml公用】

(16) 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8；【100ml公用】 (17) 10%（W/V）过硫酸铵；【现用现配】

(18) SDS电泳缓冲液：25mmol/L Tris，0.192mol/L Gly，0.1%（W/V）SDS；【500ml】 (19) 10%（W/V）SDS；【10ml】

(20) 染色液：0.2g考马斯亮蓝R-250，42mL工业酒精，10mL冰醋酸，加蒸馏水至100mL；【50ml】

(21) 脱色液：5mL冰醋酸，45mL工业酒精，50mL蒸馏水；【100ml】 (22) 保存液：7%冰醋酸；(现用现配) (23) 2×上样缓冲液：【公用，10ml】 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 2mL 甘油 2mL SDS 0.4g 0.1%溴酚蓝 0.5mL 2-β-巯基乙醇 0.5mL 蒸馏水 2.5mL

注意事项：1.准确称量各种药品试剂从而防止实验误差的产生

2,量取各种液体试剂时必须准确是实验结果更加精准。

II．溶菌酶的提取及纯化

一、实验原理

离子交换树脂是一类具有网状结构的高分子聚合物。树脂的网状结构的骨架部分一般很稳定，对于酸，碱和一般溶剂都不起作用，且不溶于这些溶剂中。这种网状结构的骨架上有许多可以被交换的活性基团。按可以被交换的活性基团的不同，离子交换树脂可分成阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

二、实验步骤及流程图 留取0.4ml上 清液，1：1加50%甘油，装 1号管中，-20℃备用 蛋清样品制备：鸡蛋两个，破壳取蛋清，加入1.5×0.1mol磷酸盐缓冲液（PH=7.0），搅拌均匀。 阳离子交换树脂再生：50gAmberlite-CG-50 阳离子交换树脂先用2mol/lNaOH浸泡30分钟，水洗至中性，再用HCl浸泡30分钟，水洗至中性。 八层纱布过滤两次，取上清液，量取记录体积V1 平衡：用0.1mol/l缓冲液将树脂平衡为PH=7.0 留取0.05ml上清液，1：1加50% 甘油，装入3#管中，-20℃保存 透析浓缩：将收集到的样品装入透析带中，在含50%甘油的PBS缓冲液中透析浓缩4小时。所得样品标号为4#，-20℃保存。 沉淀：每100mL上清液中缓慢加入35克固体硫酸铵，静置30min，然后用10000rpm/min转速离心10min，取沉淀用0.5mol含0.1mol/LnaC的PBS缓冲液溶解30-60min，在用同样转速离心5min， 洗脱：用300mL含0.5mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液以3mL/min的流速进行洗脱，收集对应最大最高峰的样品，量取体积V2并记录。 留取0.4ml上清液，1：1加50%甘油，装入2#管中，-20℃保存 洗涤：倒去其余上清，树脂用100ml0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤三遍 吸附：在平衡好的树脂中加入蛋清样品，轻微搅拌，搅拌吸附1h。 留取0.4ml上清液，1：1加50%甘油，装入2号管中，-20℃保存 装柱：将树脂搅拌均匀装入层析柱中，用300mL含0.05mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液洗涤杂蛋白。 分子筛层析：溶解后硫酸铵沉淀用10000rpm/min转速离心3min，用分子筛洗脱，控制流速为15mL每小时，分部收集洗脱峰。合并光吸收高峰管。 三、实验结果记录

图一 阳离子交换树脂洗脱图

图二 分子筛层析图

四．结果分析与思考

由阳离子交换树脂洗脱峰观察知只有一个较大的洗脱峰，说明之前一步的除杂蛋白过程进行的是非常好的。事实上，我们做的也非常认真。在其他组都赶时间往前做的时候，我

们还是保证流速恒定，时间控制在4个小时左右。

但之前由于我的失误，第一次在最大峰出来后没能及时记录，害的全组同学都重头再来了一遍。好在我们犯错比较早，还有时间补救；同组的同学也都十分宽容，没有抱怨，大家齐心协力，分工明确，第二次也就非常的顺利。这也教会我团队合作的重要性。

分子筛的洗脱峰也是比较好的。之前在杂蛋白出峰以后很长时间吸光度值都没有变化，大家都很紧张，担心这就是唯一的峰。当数据降到很低的时候，大家都有些绝望。但经过冷静的分析思考，我们觉得既然降到很低，说明它肯定会再次升高，况且王老师说了只要不出现负值都是对的，耐心等待就好，而且我们也仔细回忆了之前的步骤，并没有特别的失误。所以大家在王老师的安慰下耐心的等等看。也许是好心有好报，最后终于出峰了！大家都特别的激动。所以说做实验千万不能急功近利，也不要看别的组都跑完了而自己乱了阵脚。只要操作规范，一般是不会失误的。

五：注意事项

⑴搅拌时一定不能使用磁力搅拌器搅拌，以免将树脂磨碎。

⑵装柱前，先检测层析柱是否洁净，检查是否漏水；将树脂装柱前首先应在柱中加入少量平衡缓冲液。

⑶装柱过程中绝对不可以出现流干现象，流速不得超过3ml/min。

⑷分子筛装柱时，一定要用胶头滴管环壁加入，静置至界面明显后方可洗脱。 ⑸加入固体硫酸铵时要缓慢。

⑹过筛前一定要将检测器调0，并且赶走气泡。

⑺制备样品冷冻时不要忘记加等体积的甘油，以防冻裂。另外解冻后的样品是不能再次冷冻的。

III．活力、蛋白浓度测定

一、实验原理

棕红色的染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，形成蓝色复合物，最大吸光度值由465变为595nm，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白和染料的结合符合比尔定律，通过测定595nm处的吸光度值的增加量可对蛋白质浓度进行定量测定。 溶菌酶是一种N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶，可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，使细菌溶解。本实验以溶壁微球菌为底物，通过测量细菌悬液浊度的变化来测定溶菌酶的活性。

二 ,实验仪器及试剂

仪器：722s分光光度计

试剂：测活缓冲液；底物溶液Ⅰ；考马斯亮蓝G-250试剂；准蛋白质溶液.

试剂配制过程见I.实验准备(原始记录纸)

三、实验步骤及流程图

蛋白浓度的测定： 绘制标准曲线→测定未知蛋白的吸光度→确定未知蛋白的浓度。 酶活力的测定： 配制样品→测定特征吸收，记录数值。 四：实验内容及步骤

1.蛋白浓度的测定

(1)标准曲线的制定

取14支试管，按下表分两组进行平行操作。 管号 标准蛋白质溶液/ml 测活缓冲液 考马斯亮蓝G-250 A595nm 0 0.182 0.0.242 0.10 0.09 0.08 0.07 5ml 摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色 0.0.553 0.0.678 0.823 0.995 0.06 0.05 0.04 0 0 1 0.01 2 0.02 3 0.03 4 0.04 5 0.05 6 0.06 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 标准蛋白浓度mg 0.06 (2)测定未知样品蛋白质浓度

测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白浓度（mg/ml）。 2．酶活力测定 管 号 测活缓冲液/ml 底物溶液/ml 酶液/ml 时间 A650nm 0s 30s 1 2.5 2.5 0.5 时间 0s 30s 2 3.0 2.5 0 时间 0s 在室温，以1号管为对照，每隔30s测定2号650nm处的光吸收值 四 实验结果 表1 标准曲线数据记录表

管号 标准蛋白质溶液/ml 测活缓冲液 考马斯亮蓝G-250 0.10 0.09 0.08 0.07 5ml 0.06 0.05 0.04 0 0 1 0.01 2 0.02 3 0.03 4 0.04 5 0.05 6 0.06

摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色 A595nm 0 0.182 0.0.242 0.0.553 0.0.678 0.823 0.995 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。 标准蛋白浓度mg 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 吸光度值A595nm1.510.50蛋白质标准曲线y = 16.796x - 0.00772R = 0.9857-0.500.020.040.060.08

蛋白质含量/mg图三标准蛋白曲线图

表2 四个样品的吸光值记录 时间 0 30 60 90 120 150 180 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 0.143 0.041 0.158 0.005 0.239 0.102 0.402 0.018 0.334 0.164 0．466 0.037 0.430 0.232 0.493 0.046 0.489 0.293 0.505 0.058 0.525 0.340 0,516 0.063 0.634 0,375 0.523 0.080 1、四个样品总蛋白质含量的计算：将I号样各个时间段的吸光度值代入公式

Y=16.796x-0.0077中分别算得X0=0.0091;X1=0.01482;X2=0.0205;X3=0.0252;X4=0.02974 X5=0.0308;X6=0.0320

平均值X=(X0+X1+X2+X3+X4+X5+X6)/7=0.0193(mg)。即I号样品中蛋白质含量m1=0.0193mg 同理可算出m2=0.015196mg;m3=0.02615mg;m4=0.021mg 2、四个样品中蛋白质浓度的计算：根据C1=m1/0.5=0.0193mg/0.5ml=0.0386mg/ml

同理可以算出C2=0.0304mg/ml;C3=0.0523mg/ml;C4=0.042mg/ml 3、四个样品酶的总活力计算：（采用逐差法）

酶总活={[(OD60-OD0)+(OD90-OD30)+(OD120-OD60)+(OD150-OD90)+(OD180-OD120)]/5}/0.001

C=总蛋白/体积，有

算得U1=155.4U;U2=114.4U;U3=95.8U;U4=24U

4、四个样品的活力计算：活力=总活力/体积，有活力H1=155.4U/0.5ml=310.8: 同理可算出H2=288.8;H3=191.6;H4=48

5、样品比活力的计算：根据比活力=总活力/总蛋白,有B1=155.4U/0.0193mg=8068.5 同理可算出B2=7167.9U/mg;B3=3663.5U/mg;B4=952.4U/mg

6、提纯倍数的计算：根据提纯倍数=比活力i+1/比活力i，有TB1=1;TB2=7167.9U/8068.5U=0.89;同理TB3=0.52;TB4=0.259

7、回收率的计算：根据回收率=（总活力i+1/总活力i）*100%，有HS1=100%;HS2=114.4U/155.4=73.6%;同理有HS3=83.2%;H4=26%

活力单位（U）：酶在室温，pH6.2条件下，A595nm每分钟降低0.001为一个活力单位U。 比活力=活力单位/mg蛋白

根据测得结果，计算出各步数据填入下表即（提纯倍数和回收率表） 表3

组分 体/ml Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 0.5 0.5 0.5 0.5 积蛋白总蛋白/mg 0.0193 0.02615 0.021 活力总活力/U 155.4 114.4 95.8 24 比活力/U·mg-1 8068.5 7167.9 3663.5 952.4 提纯倍数 1 0.89 0.52 0.259 1% 73.6% 83.2% 26% 回收率 /mg·ml-1 0.0386 0.0304 0.0523 0.042 /U·ml-1 310.8 191.6 48 0.015196 288.8

0.70.60.50.40.30.20.10050100

y = 0.0026x + 0.1634R2 = 0.9848OD值/nm样品I酶活力150时间/s200

图四 样品一酶活力曲线图

样II酶活力0.50.40.30.20.10050100时间/sy = 0.0019x + 0.0488R2 = 0.9918OD值/nm150200

图五 样品二酶活力曲线图

0.8OD值/nm样III酶活力y = 0.0016x + 0.2916R2 = 0.6540.60.40.20050100150200时间/s

图六 样品三酶活力曲线图

样IV酶活力y = 0.0004x + 0.0079R2 = 0.98270.10.08OD值/nm0.060.040.020050100时间/s150200

图七 样品四酶活力曲线图

附：

[1]活力单位（U）： 规定OD650每分钟降低0.001为1个活力单位U。 [2]比活力=活力U/mg蛋白=总活力单位数/总蛋白mg [3]提纯倍数=每次比活力/第一次比活力

[4]回收率=（每次总活力/第一次总活力）×100%

五、分析及思考

1.由蛋白质浓度测定数据可以看出误差还是比较大的。经过思考我总结有以下几个原因：

⑴仪器不稳。当时实验室里的几台机子已经连续工作了大半天，数据非常不准，同一个样品连续两次测定误差都会非常大；

⑵操作不规范。因为当时时间比较紧，而且比色皿数量有限，可能存在没有完全洗净比色皿中染色剂的现象，导致出现较大误差。

2.由表3可知，随着提纯倍数的递减，酶的活力也是逐渐递减的。这说明我们的提纯工作做的比较好。但同时我们的回收率却不是特别的高，经过思考我分析有以下几个原因：

⑴ 整个实验过程中操作不规范，导致样品损失。

⑵再跑分子筛的过程中，由出峰图可以看出杂蛋白比较多，所以在收集试管的时候为了避免收集杂蛋白导致部分样品损失。

另外，由于我们在实验室数据记录不够仔细，导致最后2号和4号样品没有数据进行计算，这是预习过程中的严重失误。通过这次实验也教会我们做任何事都要认真严谨，特别是对待科研活动

六：注意事项

酶活测定和蛋白定量实验中所用试管、刻度吸管要干燥，量取试剂要准确 。

七：思考题

测定蛋白质浓度常用的几种方法及其原理？各有什么优缺点？ 答：方法一 考马斯亮蓝G-250染色法，

原理：染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1μg）。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。

优点：染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定 方法二 微量凯氏定氮法

原理：当被测定的天然含氮有机物与浓硫酸共热消化时，分解出氮、二氧化碳和水、其中氮，与硫酸化合成硫酸铵。由于分解反应进行得很慢，故可加入硫酸铜和硫酸钾或硫酸钠，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点，氧化剂（过氧化氢）也能加速反应。

消化终止后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱话消化液，使硫酸氨分解放出氨；用水蒸气蒸馏发，将氨蒸入过量的标准无机酸溶液中，全部蒸完之后，用标准的盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，准确测定氨量，从而折算出蛋白质含量。 方法三 紫外分光光度法，

原理：蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波

具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。 优点：该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。

缺点：1．当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大是会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。

2．若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。 方法四 双缩脲法

原理：具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中能与Cu

２＋

络合呈紫红色，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法进行测定，根据标准曲线进行计算可以确定蛋白质浓度。 方法四 Folin-酚法

原理：Folin-酚法所用的试剂由两部分组成，试剂A相当于双缩脲试剂。蛋白质中的肽键与试剂A中的碱性硫酸铜反应形成铜-蛋白质复合物。这个复合物可与试剂B中磷钼酸-磷钨

酸发生氧化还原反应。由于磷钼酸与磷钨酸易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。而蛋白质中的酪氨酸和色氨酸均可发生此呈色反应。颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。 优点：此法操作简单、迅速、灵敏度高，叫双缩脲法灵敏100倍。

缺点：此法易受蛋白质样品中酚类化合物及柠檬酸的干扰。另外，试剂B中的磷钼酸-磷钨酸仅在酸性pH值时稳定，故在将试剂B加入到碱性的铜-蛋白质溶液时，必须立即混合均匀。以确保还原反应能正常发生。

错误！未找到引用源。V．酶促动力学(Km测定、脲的

抑制)

一、实验原理

酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特性常数。不同酶的Km值不同，同一种酶在与不同的底物反应时，其Km值也不同。Km反映了酶和底物亲和能力的强弱程度。大多数纯酶的Km值在0.01-100mmol/L之间。

酶的活力可以被某些物质激活或抑制，凡能降低酶的活性甚至使酶失活的物质，称为酶的抑制剂，酶的活力抑制有可逆抑制和不可逆抑制两种。而可逆的抑制又包括有竞争性抑制和非竞争性抑制等类型，在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质发生改变，如Km、Vm等。通过实验的方法，可以确定出抑制类型。

二． 实验仪器及试剂

仪器：722s分光光度计

试剂：测活缓冲液；底物溶液Ⅱ；抑制剂。

试剂配制过程见I实验准备（原始记录纸） 四 实验内容及步骤

1.底物浓度的影响（Km值的测定） 取6个试管编号，按下表加样： 管号 测活缓冲液/mL 底物溶液/mL 酶/mL A650nm 1 3 2 0.5 2 4 1 0.5 3 4.5 0.5 0.5 4 4.75 0.25 0.5 5 4.87 0.13 0.5 6 4.94 0.06 0.5 在室温，对照管以测活缓冲液代替酶液，测定3min时样品管650nm处的吸光度值的下降值 以1/[S]对1/[V]作图。 2.脲的抑制

取6个试管，按下表加样; 管号 测活缓冲液/mL 底物溶液/mL 脲/mL 酶/mL A650nm 1 0 2 3 0.5 2 1.0 1 3 0.5 3 1.5 0.5 3 0.5 4 1.75 0.25 3 0.5 5 1.87 0.13 3 0.5 6 1.94 0.06 3 0.5 在室温，对照管以测活缓冲液代替酶液，测定3min时样品管650nm处的光吸收值的下降值

以1/[S]对1/[V]作图，与底物影响之双倒数图对照比较，推出抑制类型。

四、实验结果记录

表四 Km值的测定

管号 吸光值（0min） 吸光值（3min） 1/[S]（mg/ml） 1/[V]（min） 1 0.449 1.456 0.915 2.977 2 0.184 0.743 1.831 5.365 3 0.155 0.547 3.665 7.651 4 0.092 0.355 7.331 11.40 5 0.071 0.210 14.101 21.581 6 0.051 0.127 30.554 38.959

表五 脲的抑制

管号 吸光值（0min） 吸光值（3min） 1/[S]（mg/ml） 1/[V]（min） 1 0.207 0.215 0.915 373 2 0.022 0.029 1.831 428.569 3 0.043 0.048 3.665 598 4 0.196 0.199 7.331 9998 5 0.006 0.098 14.101 1498 6 0.005 0.006 30.554 2998

-1-1

底物1/[S]-1/[V]双倒数图454035302520151050010201/[s](mg/ml)30y = 1.1946x + 3.1287R2 = 0.99421/[v](min-1)40

图八 底物1/[S]-1/V双倒数图

脲1/[S]-1[v]双倒数图4000y = 88.115x + 298.66R2 = 0.99881/[v](min-1)3000200010000010203040

图九 脲1/[S]-1/V双倒数图

1/[s](mg/ml)

五、数据分析与思考

由图八知，Y轴截距=1/Vm=3.1287=>Vm=1/3.1287=0.3196ml/s 叙率=1.1946=Km/Vm=> Km=1.1946*0.3196=0.3818(mol/L) 同理可以算出加脲后的Vm=0.00335 ml/s;Km=0.295mol/L 分析得知，加脲以后Km值明显减少，且Vmax也明显减少，故应该是反竞争性抑制。

这个实验的数据可靠性不是很高。首先Km值测定时线性回归系数不是很高即没有达到0.999，说明在实验中存在很多操作不规范、仪器不准等现象，影响了测定结果。其次，由于实验中配取的溶液或者试剂时不是很准确。所以此实验可信度不是很高。

六 注意事项

反应条件要保持一致，计时要准确。

V.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测酶分子量及纯度鉴定

一．实验原理

SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主

要取决于它的分子量大小，其它因素可以忽略不计。 SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS复合物基本上是相同的，但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。

二 实验仪器及试剂

仪器：电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统

试剂：30%胶贮液；1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8；0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8；10%过硫酸铵；SDS电泳缓冲液；10%SDS；染色液；脱色液；保存液；2×上样缓冲液。

试剂配制过程见I实验准备（原始记录纸）

三、实验步骤及流程图

安装电泳槽：玻璃板用蒸馏水洗净后，直立干燥。垂直加入两个半槽之间，均匀用力压紧。 处理样品：蛋白样品加等体积样品提取液，离心20分钟。再在沸水浴中加热2至3分钟，变性完全。 制胶：制备分离胶，并注入玻璃板之间，加水层→制备浓缩胶，待分离胶凝固，倒掉水层，加浓缩胶，插梳子→浓缩胶凝固后拔梳子→加入点击缓冲液备用。 点样：加入溴甲酚蓝染色，用微量注射器吸出样品20微升，注入浓缩胶梳子形成的凹槽内。再隔几个凹槽注入标准蛋白，准备电泳。 电泳：向两槽内加入电极缓冲液→将电压调到最大，通电，调节电流，平均一个样品为1-1.5mA→当样品进入分离胶时，调节电流平均一个样品为1.5-2mA→约2-3小时后，指示染料到达胶低端时，停止电泳。

脱色：回收染色液→把用自来水冲洗下来的凝胶放入脱色液中脱色（恒温箱中过夜），直到能看处清晰的蛋白带→拍照 染色：胶体在水中浸泡10分钟→浸泡在考马斯亮蓝R250中30℃染色1-2小时。

四 实验内容及步骤

1.配制15%的分离胶

(1)用胶框封好玻璃板后架好胶板。

(2)按如下比例配好分离胶，混合后立即加入到电泳槽两玻璃板之间到上口约2cm止，再加约1ml蒸馏水水封，聚合后将水吸干。

蒸馏水 4.7mL 蒸馏水 6.1mL 1.5mol/L Tris-HCl pH8.8 5mL 0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 2.5mL 胶贮液 10mL 胶贮液 1.3mL 100uL 10uL 50uL 200uL 10%SDS 10uL TEMED 100uL 10%AP 10%SDS TEMED 10%AP 2.配制4%的浓缩胶

混合后立即加到分离胶上，加入梳子。聚合后装好电泳缓冲液后小心拔出梳子。 3.样品制备

样品与2×上样缓冲液1:1混匀，并在100℃水浴中保温3-5min，取出待用。 4.上样、电泳

将样品和标准蛋白加到样品孔中，加样量每孔10uL，加好后开始电泳，先恒压80V，样品进入分离胶后恒压120V，直到溴酚蓝走至距前沿1cm为止。 5.染色

电泳完毕，剥胶前先将凝胶在前沿处作一标记区别正反面后再将凝胶浸泡于染色液中染色2h. 6.脱色

用脱色液脱至区带清晰为止。

四、实验结果记录

图十 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图

对数分子量lgM54.84.64.44.2400.2标准蛋白相对分子量图y = -0.8574x + 4.82582R = 0.9541系列1线性 (系列1)0.40.60.8相对迁移距离Rm

图十一 标准蛋白质分子量对数对电泳迁移率图

从电泳图中可以得到，指示剂移动距离为4.3，样品1迁移距离为3.5，样品2迁移距离为2.5，样品3迁移距离为3.8，样品5迁移距离为2.3。

由相对迁移率（Rm）=蛋白质移动距离/指示剂移动距离 得Rm1=0.814， Rm2=0.581， Rm3=0.884， Rm4=0.535

代入公式得y1=4.13，y2=4.33，y3=4.07， y4=4.37 所以Mr1=10002，Mr2=10003，Mr3=10000，Mr4=10005 五、数据分析与思考

通过查阅资料知溶菌酶实际分子量为14300-17700，而我们测出的数值明显偏小，分析原因我认为有以下几方面的问题：

⑴标准蛋白曲线的问题。我们的标准蛋白只跑出来了4个带，而理论上是有5个带，所以我们只能参考标准数据并分析和推测各条带所对应出蛋白质，利用四组数据做出了标准曲线蛋白。而事实上，分子量最大的兔磷酸化酶B在对应的时候误差比较大，虽然最后出来的线性关系拟合的很好，但是可信度还是不够高的。

⑵跑胶过程出现的问题。

（3）可以看到我们的4号样是看不出来结果的。主要是因为4号样本来就很少，之前在测定性质的时候有一点浪费，最后上样时20uL都没有吸满，所以样品跑出的带几乎无法观测到。 六 注意事项

(1) Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱内进行。

(2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。 (3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。

(4) 用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。 (5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。

(6)为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐。

(7)电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。

七 思考题

影响电泳结果的因素有哪些？ 答：影响电泳结果的因数有：

1、首先决定于带颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状

一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则慢。泳动度还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，泳动度与颗表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径反比。 2、电场强度

一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。 3、电渗作用

在支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在电场中液体对固体支持物的相对移动，例如在pH8.6时，血清蛋白质进行纸电泳时，γ球蛋白与其他蛋白质一样带负电荷，应该向正极移动，然而它却向负极方向移动，这就是电渗作用的结果。滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷，如一束毛细管，进行电泳时蛋白质通过这些

孔隙向前移动。纸的孔隙带有负电荷，与带电颗粒一样可以吸引正离子，因此介质沿管壁相对地带的较多的正电荷。在电场中，带负电荷的蛋白质向正极移动，而介质却向反向阴极移动，从而对蛋白质颗粒的泳动起阻碍作用。由于γ球蛋白分子颗粒大，净电荷较少，移动速度慢，电渗作用大于颗粒向前泳动的力，结果γ球蛋白向后退。而其他血清蛋白质，因分子较小，净电荷较多，电渗作用 小于分子向前移动的力，因此分子向前移。所以，血清蛋白质电泳后球蛋白反而在点样位置之后。 4、溶液的pH值

溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少，对于蛋白质，氨基酸等两性电解质而言，溶液pH值离电点越远，颗粒所带净电荷越多；电泳速度越快；反之则越慢。 5、溶液的离子强度

溶液的离子强度是另一个重要选择的条件，在保持足够缓冲能力前提下，离子强 度要最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。

八 电泳结果不正常现象和对策

1. 指示剂前沿呈现两边向上或向下的现象。向上的“微笑”现象说明凝胶的不均匀冷却,中间部分冷却不好，所以导致凝胶中分子有不同的迁移率所致。这种情况在用较厚的凝胶以及垂直电泳中时常发生.向下的“皱眉”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象。

2.“拖尾”现象是电泳中最常见的现象。这常常是由于样品溶解不佳引起的，克服的办法是在加样前离心，选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液，加增溶辅助试剂。另一方法是降低凝胶浓度。

3.“纹理”现象常常是由于样品中不溶颗粒引起的，克服办法是增加溶解度和离心除去不溶性颗粒。

4. 蛋白带偏斜常常是由于滤纸条或电极放置不平行所引起的，或由于加样位置偏斜而引起。

5. 蛋白带过宽，与邻近蛋白泳道的蛋白带相连，这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的。

6. 蛋白带模糊不清和分辨不佳是由于多种原因引起的。虽然梯度凝胶可以提高分辨率，但与其他方法相比，常规聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨率较低的方法。为了提高分辨率，不要加过多的样品，小体积样品可给出窄带。加样后应立即电泳，以防止扩散。选择合适的凝胶浓度，使组分得以充分的分离。通常靠近前沿的蛋白带分辨率不佳，所以应根据分子量与凝胶孔径的关系，灌制足够长度的凝胶，以使样品不会走出前沿.样品的蛋白水解作用也引起扩散而使分辨率降低。水解作用通常发生在样品准备的时候,系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白，如果在缓冲液中加蛋白酶抑制剂可以减少这种情况的发生。

总结与体会：

通过这么长时间的生化实验，使我懂得了很多东西，不只是学习了有关专业的实验技能，也让我的很多关于实验的观念改变。现归纳起来为以下几点： 1. 做任何科学实验绝不可抱侥幸心理。

科学实验中虽可能存在运气成分，但归结到底，成功的科学实验还是依靠缜密的思维和熟练的技术。如果对于实验中的每个环节不做到一丝不苟，想凭运气得到想要的结果，最后往往得到的是更大的失望。扎扎实实地做好每一个实验中的环节才能得到成功。如果你糊弄了实验，实验结果也会糊弄你。

2. 做实验要有全局观、大局观，不可因小失大。

做实验需要有敏锐的观察力和判断力，对于每一个实验步骤要进行统筹安排，预想一些可能的实验结果，只有具备前瞻性的目光才能做到应对自如。实验中需有大局观，不能因片面的考虑而破坏实验的整体进程。比如，在实验中如果发现试剂不太正常或仪器运转不良因当机立断更换试剂或仪器，不能因怕浪费或习惯用某台仪器而继续使用，最后得不偿失，往往会造成更大的浪费和损失。实验中千万不要捡了芝麻丢了西瓜，因小失大。

3. 做实验一定要静心、静气、静神。

做了这么长时间实验应该以不变应万变。做科学实验的最高境界也在于此，能抛开凡尘杂事，沉心静气，聚精会神，方能成大业。但如今能真正能达到此境界的科学实验人应该为数不多吧，上至博士、博后，下到本科生，谁做实验不是为了赶紧发文章、毕业?有多少人是抱着探求科学真谛的单纯动机去做实验的呢?当然这种浮夸的心态与体制和科学研究的大环境密不可分，在此也不做更深入的讨论。科学实验人还是需要具备一种特殊品质的，并不是人人都适合做实验。若没有一颗宁静、不为外物所扰之心，是很难真正做出大的成就的。做实验也如修身养性一般，对人的耐性是很大的考验。碰到实验失败也是常有的事情，如果不能静心以对而是暴跳如雷，只会适得其反。

另外，感谢王老师的指导与批评，虽然有时对我们有点严，但我知道老师这么做也是为我们好，恨铁不成钢呗！因为有了王老师的谆谆教诲，不只让我改正了之前做实验的时候的一些换习惯，也令我养成了很多新的好习惯。我相信，在我具备了这些好的实验习惯之后，在以后的任何实验中都能达到事半工倍的效果。 fa

溶菌酶的提取及系列性质的测定

学 院： 生物科学与工程 专 业： 食品科学与工程 姓 名： 熊 一 学 号： 20103861 指导老师： 王 薇 日 期： 2012/5/7