QPCR详细实验过程和仪器操作说明

一、细胞培养

1.1 不同配比的SA-GG/TMP复合水凝胶支架的制备

四种水凝胶的配比按照之前的实验方案操作，将制备的复合墨水用0.5M的氯化钙交联24h，然后利用模具将其切成直径15mm*5mm的圆柱凝胶盘。 1.2 凝胶样品的灭菌处理

将制备好的凝胶样品放到无菌的50m离心管中，然后加入无菌的生理盐水至盖过样品。然后密封，放入80℃烘箱中加热30分钟，然后在冷却30分钟，如此往复3-5次即可。 1.2水凝胶样品的接板

将灭菌的样品放入6孔板中，每个样品三个平行样，然后加入3-5ml培养基，培养基为DMEM高糖培养基，10%FBS，1%双抗，培养12h，去除水凝胶中的水分和多余的钙离子。然后去除旧的培养基，用生理盐水清洗3次，按每个孔5*104/cell细胞密度接板，接板时间分别为1、3、5、7d进行培养，每两天进行换液。

二、PCR操作过程 2.1 M-RNA的提取 2.1细胞裂解

将培养到时间的细胞去除材料，然后用PBS清洗3-5遍，加入Trizol 1ml（实际可以加入500微升即可），轻轻吹打1min左右，然后将孔板直接放到-80 ℃的冰箱中至少冷冻12小时。 2.2 M-RNA提取

2.2.1将冷冻的细胞裂解液解冻并且移到1.5mL的离心管中，然后按照Trizol与氯仿（三氯甲烷）比例为5:1的比例,即取0.2ml的氯仿，上下颠倒剧烈震荡15s,再冰上室温放置3分钟。然后2-8 ℃，12000*g离心15min。离心后样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRizol试剂的60%。

2.2.2 把水相转移到1.5 mL的离心管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相。此处尽量洗干净水相，以1mlTRizol为例，约为500 µl的水相，如果吸到红色无机相，此样品重新进行上部离心。然后向离心管中加入每1ml TRzol加入0.5 ml

的异丙醇，在冰上放置10min。

2.2.3剧烈混匀后2-8 ℃，12000*g离心10min，离心前看不到RNA沉淀，离心后可能也看不到，属于正常现象。剧烈磕去上清液。

2.2.4加入75%的乙醇洗涤RNA。没1ml TRzol加入1 ml75%乙醇。2-8 ℃，不超过7500*g离心5分钟，用力磕去上清液，然后在冰面上进行干燥30min. 2.2.5加入40 µl的DEP水进行稀释，然后混匀，离心后备用。若不立即使用可以存放在-80 ℃。 三、逆转录操作过程

本逆转录过程使用的是Thermo Scientific的K1622试剂盒。 3.1 按照操作说明书预先配好逆转录试剂前驱液（每个样品用量） （1）加入引物为Random Hexamer : 1 µl （2）加入5X Reaction Buffer : 4 µl

（3）加入RiboLock RNase Inhibitor (20 U/µl) : 1 µl （4）加入10 mM dNTP MiX : 2 µl

（5）加入RevertAid M-MulV RT (200U/µl): 1 µl （6）加入 Water，nulease-free : 3 µl （7）加入Template RNA : 8 µl

1-6步骤可以多个样品同时配好，在分装。以上所有物质加在一起共20 µl反应体系。（也可以参考试剂盒说明书） 3.2 逆转录过程及程序设计

将3.1步的所有样品加入PCR小管子中，然后涡旋震荡30 s，再用小离心机离心30 s.然后将其放到PCR仪器中。 3.3逆转录程序设置

第一步：在25 ℃保温5 min，然后在42 ℃保温60 min，最后在70 ℃反应5min。（参照试剂盒说明书）

3.4 逆转录完成后取出样品，如不立即使用放置在-80 ℃。 四、RT-PCR操作过程 4.1 反应体系配置

具体配比按照下表（单个样品）：

试剂名称 Bestar SybrGreen qPCR mastermix PCR Forward Primer (10 µM) PCR Reverse Primer (10 µM) DNA 模板 ddH2O Total 10 µl 0.5 µl 0.5 µl 1 µl 8.0 µl 20 µl 使用量 12.5 µl 0.5 µl 0.5 µl 1 µl 10.5 µl 25 µl 25 µl 1 µl 1 µl 2 µl 21 µl 50 µl 总反应体系选择为20 µl，由于样品较多，为了省时间和方便添加试剂，可以分为三步走的方法。首先配置所有样品所需要的荧光染液，其次配置不同引物的各自总含量，最后加入所需要的CDNA含量。（我实验选择的为20 µl） 4.2 实验的布板

将上述三种试剂加到PCR专用孔板中，然后封膜，不能有气泡。最后进行涡旋混匀30 s，然后利用孔板离心机离心 30 s。具体样品布板说明案例，以4个样品，每个样品三个平行样，每个平行样分出两个样。共检测5个基因，一个内参基因。 具体布板如下图

Sample Gene 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 4-1 4-2 4-3 Collagen Collagen ALP ALP OCN OCN GAPD GAPD

Sample Gene 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 4-1 4-2 4-3 OPN OPN RUN RUN GAPD GAPD 注意，加样品时要非常小心，避免出错，且孔板要在冰上，内参基因每个板子单独存在。

4.3 三步法PCR扩增标准程序 预变性 95 ℃，2 min； PCR 反应 95 ℃，10 s;

50-60 ℃，30-34 s; 40 cycles 72 ℃，30 s；

溶解曲线（判断特异性） 95 ℃，1 min； 55 ℃，1 min；

55-98 ℃(10 sec/cycle 0.5 ℃/cycle) 86 cycles。 五、仪器操作

开机：先开电脑，然后开启PCR仪器电源，带出现DNA分子链，按PCR仪器中间按钮立刻打开舱门。然后开启相应程序，逆转录按照程序进行即可。 PCR过程操作：打开程序后，确认参数，然后点击下一步；点击create，选择板子，在sample位置选择Unknow，然后选择带有样品的板子（可以直接全选），

最后对孔板进行命名，分为横向样品名称和纵向基因名称，然后保存程序文件，点击运行，保存数据文件位置，然后开始PCR扩增程序，预计等待2-3个小时，结束实验，取出样品。 六、结果分析

反应结束后确认 PCR的扩增曲线和溶解曲线，进行PCR定量分析。 七、实验注意事项 7.1安全性主要

实验使用的Trizol，氯仿、异丙醇、荧光染料等具有一定的挥发性和毒性，要戴手套和口罩，以及在通风橱下操作。 7.2实验耗材注意

本实验的所用的枪头，离心管必须经过灭菌处理，防止存在细菌和酶的存在。所使用的水均为专用的无酶水。 7.3 RNA的降解防护

RNA室温极易降解，所有关于RNA的操作必须在冰上进行，且所有用到的实际必须在冰箱或者冰上降温后使用。实验操作尽量快速进行。