1．菌体的收集和破碎
用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。
【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）
重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。破碎后的匀浆， 4℃、 12000 rpm离心15 min。分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。
2．包涵体的处理
洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。重复一次。再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）
2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。
溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。 【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）
3．目的蛋白的纯化
亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。
谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上
的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶 性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
另一种可应用的亲和纯化标签是6组氨酸标签,组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性或弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合， 在低pH下用咪唑竞争洗脱。组氨酸标签与GST相比有许多优点：首先，由于只有6个组氨酸，分子量很小，一般不需要用酶切去除；其次，可以在变性条件下纯 化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能够保持结合力；另外6组氨酸标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。虽然有这么多的优点，但 此标签仍有不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏出混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白 的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。若目的蛋白可与某种碳水化合物特异结合，或者需要某种特殊的辅因子，可将该碳水化合物或辅因 子固相化制成亲和柱，结合后目的蛋白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱。
融合蛋白的表达和纯化过程：
1.挑单菌落于3-5 ml 2YT或LB 培养中，37℃过夜培养。
2.按1：100的比例取过夜培养液转接。37℃扩大培养至OD 0.5左右。 3.加入IPTG终浓度0.2～0.4 mM/L。 37℃摇床培养4～6h。
4.12000g离心15min，去上清。按40ml/100ml菌液加入1×Binding Buffer {破碎缓冲液组成： 50mM Tris pH7.0～8.5左右,1mM EDTA ，溶菌酶(10 礸/g cell)，；或 20 mmol/l Tris-HCl, pH 7.5,1mmol/lEDTA, 0.1mM PMSF, DNAse (10 礸/g cell) }细胞破碎缓冲液中不含脲等变性剂，故不溶解包涵体。或4×PBS重悬细胞。 5.超声波破碎：占空比50％，超声15s，停15s，10～20min。破碎后的匀浆在4℃，12,000 rpm下离心30 min，弃去上清液。 6.洗涤包涵体：2M尿素在50mM Tris pH7.0～8.5左右,1mM EDTA ，10% Triton X-100中洗涤。洗涤2～4h 去除膜碎片和膜蛋白。8M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA ，10% TritonX-100，二硫键还原剂中洗涤。洗涤4～8h，使包涵体变性可溶。 7. 过Ni柱：
Ni2亲和层析柱纯化
＋
包涵体溶解后的上清液，用镍亲和层析柱纯化。操作过程参照Amersham
Pharmacia Biotech公司提供的操作指南进行。具体过程如下：转移树脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗涤镍亲和层析柱，以除尽基质中的乙醇和空气，并防止下一步Ni2＋沉淀；5×柱体积的Charge Buffer充电；20×柱体积的三蒸水洗涤，去尽
2＋
游离的Ni；10×柱体积的Binding Buffer平衡柱子；手工上样，根据蛋白的浓度来确定上样体积；20×柱体积的Binding Buffer洗涤，至检出无蛋白，并收集流出液，用于12％SDS-PAGE电泳检测；6×柱体积的Wash Buffer洗涤，至检出无蛋白；Elution Buffer洗脱，每次1 mL，收集洗脱流出液，洗脱至检出无蛋白；10×柱体积的Binding Buffer平衡。此时，即可用于纯化同种蛋白，不需重新充电。 纯化操作完成后，加5×柱体积的Strip Buffer洗涤，去尽Ni2＋；10×柱体积的三蒸水洗涤去尽EDTA；加5×柱体积的0.5 mol/L NaOH，静置0.5-2 h，去沉淀的蛋白质；三蒸水洗涤，至流出液的pH值为7.0；20％乙醇洗涤，再加适量20％乙醇，于4℃保存。
A、过柱前的注意事项：
a、样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命；
b、包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME； c、确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争；
B、过Ni柱的操作步骤：
①用DDW洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀；
②⑩5×柱体积的Charge Buffer（50mM NiSO4）充电； ③5×柱体积的DDW洗涤，去游离的Ni离子；
④10×柱体积的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡；
⑤上样（手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定）；
⑥10×柱体积的Binding Buffer洗涤，至无蛋白检出，用三氯醋酸检测，收集流出液；
⑦Elution Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脱，每次1ml，应呈现正态分布（两边稀，中间浓）；
⑧10×柱体积的Binding Buffer洗涤。此时，即可用于纯化同种蛋白，很少需要重新充电。
⑨用20％的乙醇充满柱子，保存在4℃。
注：同种蛋白纯化5～10次后，应进行strip和re-charge。
C、柱的清洗与保存（最好每天清洗一次）： （1）去Ni离子：
①5×柱体积的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗涤；
②10×柱体积的DDW洗涤。 （2）去沉淀的蛋白质：
①5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr； ②DDW洗涤，至流出液的pH值为7。
（3）保存：20％乙醇洗涤，再加20％乙醇保存于4℃。
D、柱的再生：
当流速很慢、充电后基质不变成蓝绿色时，应进行柱的再生。 ① 2×柱体积的6M盐酸胍洗涤，然后3×柱体积的DDW洗涤； ② 1×柱体积的2％SDS洗涤；
③ 5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；
④ 5×柱体积的DDW洗涤，然后5×柱体积的100mM EDTA，pH8.0洗涤； ⑤ 3×柱体积的DDW洗涤，然后3×柱体积的20％乙醇洗涤； ⑥ 20％乙醇保存于4℃。
【备注】Ni2+亲和层析柱纯化缓冲液（1×Buffer）： ?/P>
Binding Wash Elute Strip Charge M Buffer Buffer Buffer Buffer Buffer Tris-HCl 20 20 20 20 mM 121.14 pH7.9 mM mM mM 60 Imidazole 5 mM 1M 60.08 mM NaCl 0.5 M 0.5 M 0.5 M 0.5 M 58.44 100 EDTA 372.24 mM NiSO4 50 mM 262.85 reagents
4. 目的蛋白的SDS-PAGE
分别取加有IPTG的空载体pET22(b+)表达的上清液、未加IPTG和加IPTG诱导的重组子全提取物、超声波破碎后的上清液和沉淀(即包涵体)、 纯化后的蛋白溶液，进行12％SDS-PAGE分析。通过蛋白质分子量标准，判断目的蛋白的相对分子质量，并对纯化后的蛋白进行纯度分析。
5、蛋白质的复性
目的蛋白在大肠杆菌中以包含体形式存在，要获得有活性的产物，必须对纯化的目的蛋白进行复性。将收集的洗脱流出液装入透析袋，对含适量甘油的0.01 mol/L PBS pH8.0透析48 h，每4～8 h更换一次PBS溶液。然后，将上述透析袋包埋在聚乙二醇粉末中，对蛋白溶液进行浓缩。 【备注】PBS配方：
配制 0.01 M PH 7.4 PBS 2L：
0.2 mol/L Na2HPO4(mL) 81.0 0.2 mol/L NaH2PO4(mL) 19.0 NaCL 17 g 用水稀释到2 L即可。
另外，可加入下列重折叠（复性）介质：
①氧化还原系统：还原/氧化型谷胱甘肽（10:1～3:1） ②L-Arg或Gly（0.5mol/L） ③甘油：10% ④聚乙二醇（浓缩）
⑤高摩尔浓度的Tris(0.4～1mol/L)
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