法脚抹术∋()∗+,−∀ !#∃一#%&&..∋(∋/0用中性红标记酵母原生质体初探吴根福沈煌与技术系应伟军杭州大学生物科学杭州!6,用#3蜗牛阵处理肆母细胞 4分钟啤酒哮母5的原生质休形成率为/43再生率为&37籍化肆毋89的原生质休形成率为: 3再生率为%#3用;<<==>中性红染液对5,菌株的整细胞和原生质休染色%分钟细胞的着色率为:3存活率为%#3而原生质体的着色率为≅另再生率为缩小在交变电场中排队所雷的场强也降低, ?3经染色后的原生质体休积关键词∀哮母原生质体7中性红7标记,ΧΔ..Ε,〕自七Α年代末6Β>>>发明Φ电进行了一些尝试中性红的化学名称为#一融合技术以来这门技术已越来越广泛地得到应用电融合是一种空间定向时间同步的可以控制的融合技术它有融合频率高细胞损伤小可在显微镜下直接挑取融合子等优ΗΓ点Ε甲基一∃氨基一 一二甲基氨基杂葱盐酸盐’据报道Ε中性红的细胞毒性较小它能渗透到活的酵母细胞中并可作为培养基中的指示剂它是一种阳离子染料溶于水中后产生ϑ一ΚΛ但是融合的目的是为了获得稳定的重扩基团容易与蛋白质上的梭基或细组子传统的重组子选择方法是用诱变处理胞质内的负电荷墓团如多聚卜经丁酸结合而显色因此它有可能对酵母菌的原生质体进将亲株进行遗传标记如营养缺陷型抗药性,然后进行筛选突变等!这种方法对工业微行特异性标记生物菌株的融合会带来许多不利的影响因为突变是随机的在亲株进行遗传标记的同时一些优良性状也可能丧失一些不利的突材料和方法一材料%变性状有可能随之出现因此人们在实践中又摸索出了许多好的筛选方法如有人利用菌株啤酒酵母∀5−2(∀,Μ−,89!均5∀,!搪化醉母8Ν夕扣、,Δ,71由杭州ΔΒ‘灭活的原生质体作为供体与另一活的原生质ΗΙ体融合+7也有人采用荧光染料如叮咤橙!大学生物科学与技术系保存∀#培养丛5Ο培养!酵母抽琴沙哪∀对原生质体进行标记然后在显微镜下挑取特异性的融合株Ε%然而这些方法虽然先进’Β蛋白ΠΘ∗提物,##葡萄糖#固体培养基加肠燕搪人3琼脂高渗培养丛再加2∃%≅前者仍需结合快速的早期鉴定技术进行筛7选手续繁琐后者的荧光染料一般而言也是试剂中性红溶液称取(∋>(乙24%&中性红溶于(∋∋>Ρ醉%「,并∗Ρ8蒸馏水定容至一种诱变剂也有可能使优良性状丧失并且配成。%3贮备液用时用蒸馏水稀%≅增加了操作人员的危险性所以找出一种方释高渗中性红济液用3蔗搏溶液稀释便安全的标记手段将对融合子的筛选起到非常积极的作用其他原生质体制备∗月试剂按参考文献我们用普通的中性红染料Ε 〕生物技术,卷 期二方法%原生质体的制备∋取体能有较高的再生率我幻选择了醉作用()∗+液体培养4℃ ∃4分钟此时5,的原生质体形成率为基中摇瓶培养%∃小时的菌体∃叫用,−∀之柠檬酸磷酸缓冲液./∗ 0离洗二次然后43再生率为&击38&9的原生质体形成率为: 3再生率为%#3染色率3!用含123)+45一67∋一一径基乙%3户醉的/∗ 液处理半小时山梨醉/∗ 离洗存活本3!后用∃8蜗牛醉处理一定时间再用。93∀! ∃#八协山梨醇水溶液离心去除酶后就得到原生质体汀Σ娇悬浮液∃原生质体的形成率及再生率按文献:〕【测定Σ丁书4 4:4%原生质体的染色取一定量的原生质,∋体与高渗的中性红染液混合使终细胞浓度为1,;<%&个=2;终中性红浓度为%∃1Σ图%一,或。一,ΥΤΣ才Τ#4?,%%1:1;,,2等染色一定时间后离集色时间.分0心并用山梨醇水溶液离洗三次观察染色率.染成红色与菌休占总菌体的比例0不同浓度中性红对醉母整细胞的作用结果与讨论一中性红对酵母整细胞的作用特异性电融合所需的染料应是既能对原生质体进行标记又对细胞的毒害作用较小∋—一染色率一一一一存活率>!!∗,2!!,∗2一一△一△一△9!∗∗2一旅生质体形成本.8%0原生质体8再生万七0礴为此我们首先就中性红对(,酵母整细胞的毒性作用进行了试验选用摇瓶培养%∃小时的对数期细胞用无菌蒸馏水离洗二次后用不同浓度的中性红溶液染色一定时间观察中性红对醉母整细胞的染色作用及致死作用, :Δ叫八气协Β≅Α&夕二卜;Χ%∃、、之泣ΑΕ∋∋悦二二∋%%∃结果见图%∃,#∀处理时闷《分0由图可见菌体染色率随时间的延长而上升而存活率却随时间的延长而降低但即图∃不同蜗牛醉处理时间对原生质体形成和再生的形响使染色率在%8时仍有%8左右的菌体能存活说明在一定范围内中性红并不致于一一(,菌株△一△一△2&株使所有被染色的菌体死亡—∃形成奉一一一一再生率二中性红对酵母原生质体的作用%,中性红对(∃菌株原生质休染色率的醉母原生质体形成率的选择用∋∃肠影响用∋%,,2蜗牛酶作用醉母细胞不同时间制备醉母原生及;。。!∗,2,2:1,,2的高渗中性红溶液对所制备的∃1,,21质体发现原生质体的形成率随着酶作用时(。原生质体进行染色,染色时间为1%1,∃间的延长而增高再生率却随酶作用时间的,分钟然后进行原生质体染色率的测定结果见表%延长而阵低.见图∃0,为了确保醉母原生质吴根福等表Β∀用中性红标记醉母原生质体初探处理细胞浓度约为(中性红浓度和处理时间ς(护个Σ>Ρ!则会使对5原生质体染色率的影响%#<<染色声降低再生率回升这可能是与中性红是一种阳离子染料有关当它在染色时与细胞膜或细胞质中的负电荷基因结杏这种结霖煮备%444:∃4≅&%444注的中性红对原生质体的染色不是很好染色率比较低≅<==>对较大性担上所迷栩中性红对酸母原生质体进笋行标记是完全可行的但会造成原生质体再的中性红染液虽然染色率较高但经显微镜检查后发现细胞明显缩小表#!生率的下降既然灭活的原生质体仍能融吞想必用中性红标记的原生质体与另丫未雄标记的原生质体之问应该也能融合这里有一口,估计对细染胞的损伤较大为此我幻选择了果见表表#。。==>液染色后的原生质体进行再生率的测定结∃个问题必须解决、郎排队所需电场强度的确立根据电融合的机理融合的二个原生质体中性红染色对原生质体大小的影响而!Ω藻丽反‘奋缅宜在‘而Ρ丽<对砚!?丽护%体‘。∀,首先必须在‘交变电场下排队排队所需的电场强度与细胞的大小有关根据我们的观‘%∃4察用Ι∋4Ξ=>中性红染色%∀,分钟的5原%的#444≅4?∃#4#∃: &#?≅≅%∃& ∃生质体其直径为∃: 抖>所需排队的最低场强为##∋ΨΣ−>而未被染色的89原生质体其∃4%∃≅%%4?直径为#林>起始排队场强为∃:∋ΖΣ−>7%444#?≅:&所以如果排队原生质体之问的啤酒酵母菌株大多合适很可能形成同种染色时间%分钟∃按球形计算表中性红染色对细胞再生率的影响4对照!/为好在用于土业生产的多悟体、城细胞直径较染色时间分!再生率3!% ?#<<大如果将它的原生质体进行染色再与未被染色的单悟像糖化醉母融合排队状况就会好得多有关中性红染色的酵母原生质体进行特异性融合的研究尚在进一步探索中::44Ξ=>二染料浓度由表∃。==>中性红处理后可见经。原生质体的再生率下降不多这可能是由于高渗对原生质体的保护作用所致∃∀参6Β>Ε(」ς.考Ν文Χ。。Χ献一(,一Λ!∀>Χ。。。∴奋,Χ份9Β∋,!%0丁,∋/]0∋(∋∗=%&≅门?4;Βς∀卜染色后的处理对原生质体再生率的影响原生质体染色后需离心去除多余的染Ε#〕郑强王竟等生物工侄学报∃!%:1%&4%,:&∋7‘7、、2。丫2吧,∗价Ε∃〕]二4叩(%Φ⊥>Β」Β丫Β(0而川.∋Φ代(Ρ二 % ! ∃%一_∃%&:∃!#一%%%&:‘液我们实验时一般离洗三次每次约%4分钟温度大约#4℃在实验过程中我们发现∀∃【〕扳并拓夫发醉七工业刊日〕柳岛直彦等编王污五译醉母解剖〕〔Ε(∃叱一%%南开天学出版社夭沐%&&4染色后若用山梨醉水溶液或山梨醉[咫液2%弱进行离洗则颜色并不会褪去但若用4‘【!汪和睦件玉瓦等生物工侄学报≅张博润婆书勤卒生物工程学报Ε〕#∃!#!??1%%&: 1∃?#&%&:份的醉母抽提物或2%43蛋白陈高渗溶液进行下转第%#页!%#生王物技技术不∋,卷 期〔〕∗ΞΦ+(ΚΧ∃#%##%&: 参Ε%〕;考Ξ∋−ΚΧ文】∴献Ν;∴:?)]+(α段%#%?一#%:%&:≅#〕李以莞生物工程进展〔∃〕βα二Β、〔%&:?〕赶加%#峨%&&%Χ#∃4%&&#(/Β(ϑΕ〕∴αΒ∗ϑ8>>Χ≅∃##∃#∃%&::(;〔〕9Βαϑχ−Β(ΞΚ∴;#&:&[: %44#&Ε:」δ∋&%&&ΡΟ∗β∋(9Β(####:〔〕∗∀∀〔%4〕;ε,长φΒ、玉入8Β%βΒ二(.∋[Ρ一Β/;),Ρ工−Κ∋Χ(∴−Δα含%Ν;∴:% :%∴(ε∋+∋0(入(Σ反αα,Β+Β&% &%:%&:&.(Β_)Χ(Κ∃%# ?∃%&:?[8∋∋.Β./Δ.α;,γ⎯,.,Β./∋ηΨ)_,.,.,,Χη∃_&β∋⎯Ι,(,∴ε∴入,.+Β一Ι+∋>Δ,ι[Δ,+Δ(6ιΔ./;ι⎯>8。址⎯+Β#%∀八“Δ∋0ϕΒΔ∋η∋月ςΒΔ./山少8必α汀∴=Ξβ交必川勿/0山,∗。//尸。、Λ二ε认!Λ8⎯Δ./Λ⎯Δ(ΒΔ./夕;动众“η_。+七李α−.,方Δ+Β一Ι+∋“9动/!心κ另_λ/。,Δ>=(ΒηΒ,αΨ∋Γ.Δ,,Ι(()/Δ.,.,∋η>∋⎯Ι,入(,∴εΔ(∀>Δ,ι,Δ.,,Χε0Ξ[ϑηΧ∋>∋/,.∋>Β−ΟΚ∴,∋/0(∋ηι0εΧΒαΔ.Δα,∋ΓΓ∋(0一αΒ+ΒΓ+∋⎯,Ι,ΧΒ=9(=+Ζ,,+∋ΧΙΦι,∃∃∃ε=,η∃⎯,,∋+(、(Βα∋Ι,γ⎯,Γ飞,,Ι,Χ,(0ΙΒΙ,αε0αΒα∋,∋ς∀.,∀ι∋αΔ∀飞Χ,Δ,α飞,+(Χ,Χ,Ι⎯(+ΙΙΩ∀∋Χ,λα,+ιΔΧΒ+%∋3ι∋>。+∋+ι,,.,ΧΔ(Ι,γ⎯,(飞,,ΙηΒ>>⎯ς飞∋.(Β∋ε⎯(/(Β=∋ΧΒ∋Φι,Χ,η∋λιΔΖ,ε+ΔΓ7飞,αΨ(/,.,],0κ∋ΧαΙ∀β,∴ε∴+Β一Ι+∋>ι[ΔΓ,,Χ7Ψ)/,.,7Ξ∋(0>,ΧΔΙ,[ιΔΒ(ϑ,Δ,+Β∋.上接第#页!ΞΧ,(Β>Β.ΔΧ0ϑ,Ι,ΔΧ,ι4.βΔΧ⊥Β./5,ΔΙ+ΞΧ∋+∋Ξ(ΔΙ+λΒ+ιΚ,+⎯ΧΔ(ϑ,ακΦι,0,ΔΙ+ΞΧ∋Χ,⎯_,.η⎯);ι,.5⎯∋⎯5Β./Ν加。立夕κ,ΒΠΛΔ.⎯.[汉(/ηΔ2应’价;Λ∋/ιμ/ι!+∋ΙΔΙ+ΙλΞ(,Χ,>Δα,λΒ+ι,∋>>∋一,>,+,,ι∋αα+(、,0λ,∀,.,α,+ΔΒαλΒ+ι,.Γ.,+⎯ΧΔαΧ∋Φι,+∋ΔΙ+=(Χ,Ι⎯(+ΙΔι∋λ,αΔ.Δ.+ιΔ+η+,Χ.+Χ,Δ+Β/0,ΔΙ+,∀飞,Ι、#+(λΒ((3αΙ∀∀ΔΒ(0>,η∋0Χ 4>Β.+∋=−η∋Χ>7∋.+ΒαΧ,/,∀、,ΧΔ+Β∋∀,ηΧ,γ⎯ΒΧ0λ,Χ,&4纬Δ.&33?3Χ,Ι=,,+ΒΖ,(0∀,ΙΔ.6,Ι(’Χ,,Δ,5’Ζ(: Χ,3α%#3.,+⎯ΧΔΧ,Ι=,,+Ζ,(0+∋ΔΙ+Δ’α(+Β−Ι89∴η+,Χα,+ΔΒ.Β./ΔΙΔΙ,,((Ι((>αΞΧ∋+∋=(ΔΙ+ΙλΒ+ι44Ξ=>(Χ,αη∋λ.%>ΒλΙΔΙ%#37Δ+∋[∋(ΔΙ+α=Χ∋+∋=(,Δ.ΧΔ+,ΔΙΙ≅3Χ,/,.,ΧΔ+∋.∋[∋(Χ,αΒ,,((ΧΔ+,λΧΔ:? Ι⎯ΧΖ⎯Ζ,α,,ΧΔ+,+,λΦι,8.∋ΧΧ,Ι⎯(+ΙΔΔ(∋Ιι∋λ,α+ια,+ΔΒ.Β./>ΧΙΔ⊥,⎯,,((Ι.ιΧΒ⊥,α+ι,Β.,一(⎯=Ζ∋Δ+Δ/(,(∋λ,αα,Χ+∋⊥,η⎯ΙΒ∋.⎯.Ι⎯,,ΙΙη⎯(,Δ⎯+ι∋Ι//,Ι+,αα,+ΔΒ.,α∋Β=(αΒα∋Χ=∋(0=(∋ΒαΔΙ+Ι=Χ∋+∋=(η⎯Ι,λΒ+ι∋ΔΙ+Ια,+ΔΒ.,αιΔΞ(ΒαΞΧ∋+∋Ξ(],0κ∋ΧαΙ∀5,ΔΙ+ΞΧ∋+∋ΔΙ,Ξ(7β,+⎯ΧΔ(Χ,α7βΔΧ⊥