(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108717084 A(43)申请公布日 2018.10.30
(21)申请号 201810198385.5(22)申请日 2018.03.12
(71)申请人 天津量信检验认证技术有限公司
地址 300462 天津市滨海新区经济开发区
西区新圣路121号(72)发明人 刘然 张克禄 谢亚楠 李悦
许勤虎 (74)专利代理机构 天津盛理知识产权代理有限
公司 12209
代理人 刘玲(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
权利要求书2页 说明书4页 附图1页
(54)发明名称
熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法(57)摘要
本发明涉及一种熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1)标准工作液的配制；2)样品工作液的配制：3)液相色谱-串联质谱法检测分析。本发明设计科学合理，能够对熊胆粉中的熊去氧胆酸进行准确的定性定量分析，使得成分检测分析更快速，节省时间，且检测灵敏度高，检测数据精确，节约样品使用量，节约成本，提高检测效率。
CN 108717084 ACN 108717084 A
权 利 要 求 书
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1.一种熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
1)标准工作液的配制：
准确称取熊去氧胆酸标准品0.5g，用甲醇溶解稀释并转移至100mL容量瓶中定容，配制成浓度为0.5g/L的熊去氧胆酸标准工作液，备用；
2)样品工作液的配制：
准确称量0.1g熊去氧胆酸样品于烧杯中，加入熊去氧胆酸提取液溶解，分为3～5次将样品稀释液转移至100mL容量瓶中，旋涡混匀后超声振荡提取30min并冷却至室温，用熊去胆氧酸提取液定容并转移至离心机进行离心处理后吸取上清液并用微孔滤膜过滤，备用；
3)液相色谱-串联质谱法检测分析：
将标准工作液与样品工作液分别注入到液相色谱-串联质谱仪中，进行液相色谱-质谱分析，以标准工作液的峰面积与样品工作液峰面积进行定量比较，保留时间定性，外标法进行计算，计算样品中熊去氧胆酸的质量分数w。
2.根据权利要求1所述的熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于：所述步骤3)中熊去氧胆酸的质量分数w采用如下公式进行计算：
w＝(c*V*10-7/m)*100％其中：c为样品工作液中熊去氧胆酸的含量，单位为ng/mL；V为样品工作液的体积，单位为mL；m为样品的质量，单位为g。
3.根据权利要求1所述的熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于：所述的液相色谱条件为：
色谱柱：RP-C18 1.7μm 50×2.1mm；流动相：A相为甲酸水溶液，B相为甲酸甲醇溶液；流速：0.15-0.5mL/min；柱温：25-40℃；进样量：1-10μL；
检测器采用UV紫外线检测器；所述的质谱条件为：质谱离子源：电喷雾正离子；质谱离子源温度：325℃；检测方式：MRM多反应检测；脱溶剂气体：N2；脱溶剂气体流速：10～40Arb；辅助气流速：0-20Arb；离子传输管温度：280～400℃；蒸发器温度：280-400℃。
4.根据权利要求3所述的熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于：所述液相色谱条件中流动相的洗脱条件为梯度洗脱，0min甲酸水溶液：甲酸甲醇为90：10；3min甲酸水溶液：甲酸甲醇为90：10；5min甲酸水溶液：甲酸甲醇为10：90；7min甲酸
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权 利 要 求 书
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水溶液：甲酸甲醇为10：90；7.1mim甲酸水溶液：甲酸甲醇为90：10；10min甲酸水溶液：甲酸甲醇为90：10。
5.根据权利要求3所述的熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于：所述质谱条件中，熊去氧胆酸的质谱参数为：母离子391.14m/z，子离子359.03m/z。
6.根据权利要求1所述的熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于：所述熊去氧胆酸提取液为质量分数为15％的甲醇溶液。
7.根据权利要求1所述的熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于：所述离心机的转速为8000r/min，离心3min。
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说 明 书
熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法
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技术领域
[0001]本发明属于药品活性成分检测领域，涉及熊胆粉活性成分检测，特别涉及一种熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法。
背景技术
[0002]熊胆为熊科动物黑熊或棕熊的胆囊，以科学的方法采取人工养殖活熊的鲜胆汁，经科学加工精制而制成熊胆粉。经功能试验证实，熊胆粉具有调节血脂、降低总胆固醇的作用，不含任何辅料和化学添加剂。熊胆粉也是名贵中药，用于清热、解毒、清肝明目，治疗惊风抽搐、目赤、咽喉肿痛等症。现代药理研究证明，熊胆粉具有清热镇痛、镇咳、镇静、抗惊厥、解痉、保肝、利胆、抑菌及对心血管病、抗病毒、抗炎、抗菌、预防胆结石及溶解胆结石等功效(《中华药典》2015版一部，P1701)。[0003]熊胆粉中能够被人体快速吸收，对身体起到良好作用的主要成分为熊去氧胆酸，对胆汁缺乏症及胆结石的预防都有很好的作用。因此，熊胆粉中熊去氧胆酸的检测及高效提取成为了医学及生物领域的核心技术，操作人员必须对熊胆粉中熊去氧胆酸的含量具有清晰的了解。[0004]目前，实验操作中常用的熊去氧胆酸检测提取方法操作复杂，由于熊胆粉成分较为复杂，且都集中在性质较为相似的胆酸类化合物，因此对熊去氧胆酸的分析不能够定性定量，检测结构不准确；且熊胆粉价格昂贵，实验检测中提取所用样品量较大，造成样品浪费，提高成本。
[0005]通过对公开专利文献的检索，并未发现对熊胆粉中熊去氧胆酸含量检测方法的公开专利文献，也未发现与本专利申请相同的公开专利文献。发明内容
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测操作简单、检测精度高、检测准确高效，且能够节约样品使用量节约成本的熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法。
[0007]本发明解决其技术问题是通过以下技术方案实现的：
[0008]一种熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
[0009]1)标准工作液的配制：
[0010]准确称取熊去氧胆酸标准品0.5g，用甲醇溶解稀释并转移至100mL容量瓶中定容，配制成浓度为0.5g/L的熊去氧胆酸标准工作液，备用；[0011]样品工作液的配制：
[0012]准确称量0.1g熊去氧胆酸样品于烧杯中，加入熊去氧胆酸提取液溶解，分为3～5次将样品稀释液转移至100mL容量瓶中，旋涡混匀后超声振荡提取30min并冷却至室温，用熊去胆氧酸提取液定容并转移至离心机进行离心处理后吸取上清液并用微孔滤膜过滤，备
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说 明 书
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用；
3)液相色谱-串联质谱法检测分析：
[0014]将标准工作液与样品工作液分别注入到液相色谱-串联质谱仪中，进行质谱分析，以标准工作液的峰面积与样品工作液峰面积进行定量比较，保留时间定性，外标法进行计算，计算样品中熊去氧胆酸的质量分数w。[0015]而且，所述步骤3)中熊去氧胆酸的质量分数w采用如下公式进行计算：[0016]w＝(c*V*10-7/m)*100％[0017]其中：c为样品工作液中熊去氧胆酸的含量，单位为ng/mL；[0018]V为样品工作液的体积，单位为mL；[0019]m为样品的质量，单位为g。[0020]而且，所述的液相色谱条件为：[0021]色谱柱：RP-C18 1.7μm 50×2.1mm；[0022]流动相：A相为甲酸水溶液，B相为甲酸甲醇溶液；[0023]流速：0.15-0.5mL/min；[0024]柱温：25-40℃；[0025]进样量：1-10μL；
[0026]检测器采用UV紫外线检测器；[0027]所述的质谱条件为：[0028]质谱离子源：电喷雾正离子；[0029]质谱离子源温度：325℃；[0030]检测方式：MRM多反应检测；[0031]脱溶剂气体：N2；[0032]脱溶剂气体流速：10～40Arb；[0033]辅助气流速：0-20Arb；[0034]离子传输管温度：280～400℃；[0035]蒸发器温度：280-400℃；[0036]而且，所述液相色谱条件中流动相的洗脱条件为梯度洗脱，0min甲酸水溶液：甲酸甲醇为90：10；3min甲酸水溶液：甲酸甲醇为90：10；5min甲酸水溶液：甲酸甲醇为10：90；7min甲酸水溶液：甲酸甲醇为10：90；7.1mim甲酸水溶液：甲酸甲醇为90：10；10min甲酸水溶液：甲酸甲醇为90：10。[0037]而且，所述质谱条件中，熊去氧胆酸的质谱参数为：母离子391.14m/z，子离子359.03m/z。[0038]而且，所述熊去氧胆酸提取液为质量分数为15％的甲醇溶液。[0039]而且，所述离心机的转速为8000r/min，离心3min。[0040]本发明的优点和有益效果为：[0041]1、本发明的熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，区别于目前市场上大部分运用的液相色谱法分析熊去氧胆酸的方法，采用液相色谱-质谱联用的分析方法能够更有针对性，更快速有效地对熊胆粉中的熊去氧胆酸进行准确的定性定量分析，使得成分检测分析更快速，节省时间，提高检测效率。
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2、本发明的熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，获得的熊去氧
胆酸的峰形和分离度都很好，且线性良好，避免其他物质的干扰，缩短了检测时间，检测提取更为精确。[0043]3、本发明的熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，检测精度高，检测灵敏，减少样品使用量，节约成本，缩短检测时间，提高检测效率。附图说明
[0044]图1为本发明标准工作液及样品工作液的质谱图。
具体实施方式
[0045]下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0046]一种熊胆粉中熊去氧胆酸含量的液相色谱-质谱检测方法，其创新之处在于：该方法包括如下步骤：
[0047]1)标准工作液的配制：
[0048]准确称取熊去氧胆酸标准品0.5g，用甲醇溶解稀释并转移至100mL容量瓶中定容，配制成浓度为0.5g/L的熊去氧胆酸标准工作液，备用；[0049]样品工作液的配制：
[0050]准确称量0.1g熊去氧胆酸样品于烧杯中，加入质量分数为15％的甲醇溶液溶解，分为3～5次将样品稀释液转移至100mL容量瓶中，旋涡混匀后超声振荡提取30min并冷却至室温，用质量分数为15％的甲醇溶液定容并转移至离心机进行离心处理，转速为8000r/min，离心3min，吸取上清液并用微孔滤膜过滤，备用；[0051]3)液相色谱-串联质谱法检测分析：
[0052]将标准工作液与样品工作液分别注入到液相色谱-串联质谱仪中，进行质谱分析，以标准工作液的峰面积与样品工作液峰面积进行定量比较，保留时间定性，外标法进行计算，计算样品中熊去氧胆酸的质量分数w。
[0053]步骤3)中熊去氧胆酸的质量分数w采用如下公式进行计算：[0054]w＝(c*V*10-7/m)*100％[0055]其中：c为样品工作液中熊去氧胆酸的含量，单位为ng/mL；[0056]V为样品工作液的体积，单位为mL；[0057]m为样品的质量，单位为g。[0058]液相色谱条件为：[0059]色谱柱：RP-C18 1.7μm 50×2.1mm；[0060]流动相：A相为甲酸水溶液，B相为甲酸甲醇溶液；[0061]流速：0.15-0.5mL/min；[0062]柱温：25-40℃；[0063]进样量：1-10μL；
[0064]检测器采用UV紫外线检测器；[0065]洗脱条件为梯度洗脱，参数见表1。
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说 明 书
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表1梯度洗脱参数
[0068]
[0069][0070][0071][0072][0073][0074][0075][0076][0077][0078][0079][0080]
质谱条件为：质谱离子源：电喷雾正离子；质谱离子源温度：325℃；检测方式：MRM多反应检测；脱溶剂气体：N2；脱溶剂气体流速：10～40Arb；辅助气流速：0-20Arb；离子传输管温度：280～400℃；蒸发器温度：280-400℃；
熊去氧胆酸的质谱参数见表2。表2熊去氧胆酸的质谱参数
中文名称母离子(m/z)子离子1(m/z)熊去氧胆酸391.139359.034[0081]尽管为说明目的公开了本发明的实施例和附图，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
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说 明 书 附 图
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