“食品级”乳酸菌表达载体系统的研究进展

第３０卷第１０期　２００８年ｌ０月　中国预防兽医学报　Ｖｏ１．３０．ＮＯ．１０　０ｃｔ．　２００８　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　“食品级＂乳酸茵表达载体系统的研究进展　郝凤奇，杨桂连，叶丽萍，王春凤　（吉林农业大学动物科技学院动物微生态学研究室，吉林长春１３０１　１８）　中图分类号：Ｑ９３９．１１８　文献标识码：Ｂ　文章编号：１００８—０５８９（２００８）１０—０８２４—０７　世纪末就已经公布了乳酸乳球菌（Ｌ＿ｌａｃｔｉｓ）的基因组序列，　目前，多数外源基因的克隆与表达，主要采用大肠杆　菌。然而，由于大肠杆菌能够引起人类和动物发生不同程　度的腹泻，导致机体损伤，所以其表达产物需要经过复杂　的分离纯化才能达到食品医药标准。与之相比，乳酸菌作　随即也展开了对其他乳酸菌基因组序列的研究【７］，旨在通　过揭示乳酸菌遗传背景的基础上，为相关方面的研究提供　更新的理论依据和操作平台。国内外的学者业已从疫苗研　究及应用和体外发酵工程的可持续发展角度出发，构建了　一为人和动物肠道内正常菌群之一，已被证明具有诸多益生　功能，而且被公认为安全无毒的（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ　ｒｅｇａｒｄｅｄ　ａｓ　ｓａｆｅ，ＧＲＡＳ）。因此，采用乳酸菌表达的外源蛋白质可免　系列乳酸菌表达载体系统，构建过程中为保证该系统符　合“食品级”之规定主要着眼于以下几方面。　去上述复杂、繁琐的后提纯工艺；同时，乳酸菌可以在肠　道中存活定植，其外源基因表达用于治疗或免疫作用的活　１　“食品级”选择标记　选择标记是指用于区别转化与非转化、细胞重组与非　重组质粒的筛选标记。由于转化率低，载体上必须要有一　个或多个选择性遗传标记，用于鉴定含有重组子的受体菌　性物质可以持续地在肠道中产生，成为人和动物体内功能　性生物制剂的“加工车间”，从而起到相应的保护和治疗　性作用。　乳酸菌通常被认为是一类能够代谢糖类，产生５０％　以上乳酸细菌的总称，属革兰氏阳性兼性厌氧菌…。因其　“安全无毒”，而被广泛地应用于食品发酵、医药生产、　保健药物及饲料添加剂等工业［２］。所以，最近十几年来对　乳酸菌基因工程和分子生物学方面的研究已经取得了阶段　株『８］。传统的乳酸菌载体上都携带有一个或多个抗生素抗　性基因作为选择标记。虽然这些抗性基因能够有效地筛选　重组体，但由于抗性基因的漂移、扩散及整合，将会对环　境或人和动物带来生物安全性的严重危害。鉴于此，最有　效的解决办法是使用“食品级”的选择标记代替抗生素抗　性标记。所谓“食品级”选择标记，是指一类非抗生素抗　性的能应用于食品工业的选择标记『９＿。　性的进展，从而使乳酸菌作为遗传工具、转化载体、整合　和扩增系统而备受青睐＿３＿。基于传统乳酸菌表达外源蛋白　效率低，以及目前报道的人和动物消化道共生乳酸菌表达　载体系统均是以抗生素抗性作为外源基因稳定表达的选择　压力，而抗药性基因不断向环境中漂移扩散，可能造成对　１．１糖类选择标记乳酸菌能够利用各种糖类作为碳原，　是因其基因组中含有编码相应糖类水解酶的基因，一旦有　关某种基因失活或钝化后，菌株则无法在仅含有该种糖类　的选择培养基中生长。因此，可利用糖类作为一种非抗生　素抗性的选择标记。目前研究相对透彻的主要有乳糖、　环境微生态的破坏，不能直接用于人和动物的弊端，国内　外学者一直致力于研究高效的对人和动物无毒副作用的乳　酸菌表达载体。如：王春风等构建的以胸苷酸合成酶基因　为选择压力的乳酸菌表达载体ｐＷ４２５ｔｔ　，Ｔａｋａｌａ等构建的　以乳糖合成酶为选择压力乳酸菌表达载体ｐＬＥＢ６００ｔｓ］等。　Ｄ，木糖和蔗糖选择标记。　１．１．１　乳糖选择标记：ＭａｃＣｏｒｍｉｃｋ等将完整乳糖操纵子　现有的研究结果表明，已经构建了一些用于乳酸菌的表达　载体；并将这些能够耐受压力和安全选择的表达载体系统　应用于食品工业，故此得名为“食品级”表达载体［６］，并　且对有关乳酸菌表达载体系统的基因和操纵子序列方面的　研究也在日趋完善。随着对乳酸菌基因组学的研究，在上　整合到一株敲除质粒的Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＭＧ５２７６的染色体上，并　通过双交换使ｌａｃＦ基因失活，结果该菌株不能利用乳糖　（Ｌａｃ‘）。然后再将克隆有ｌａｃＦ基因的质粒转到上述菌株中，　该菌则恢复了利用乳糖的能力（Ｌａｃ　）¨。］。Ｐｌａ￣ｅｕｗ等也同样　用ｌａｃＦ基因作为选择标记，将来源于大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）的　收稿日期：２００７．１１－２７　基金项目：国家８６３计￣（２００３ＡＡ２４１　１２１００２１　作者简介：郝凤奇（１９８１～），男，吉林辽源人，硕士研究生，主要从事动物微生态学与分子生物技术研究　通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｃｈｕｎｆｅｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ　第１０期　郝风奇，等．“食品级”乳酸菌表达载体系统的研究进展　８２５　Ｂ．葡糖醛酸酶基因（ｇｕｓＡ）克隆到Ｌ．１ａｃｔｉｓ乳糖操纵子ｌａｃＡ　启动子的下游，转到缺失受体菌中，转化后该菌能够利用　乳糖［９］。Ｔａｋａｌａ等将干酪乳杆菌（Ｌｂ．ｃａｓｅｉ）的磷酸化ｐ一半　乳糖苷酶基因人工缺失１４１　ｂｐ，构建了该菌株乳糖利用缺　陷型，并用Ｌｂ．ｃａｓｅｉ的ｌａｃＧ基因和鼠李糖乳杆菌的ｌａｃＧ　启动子基因构建了能够启动乳糖发酵的质粒ｐＬＥＢ６００，将　该质粒转化入上述人工缺陷型菌株后，该菌株即可利用　乳糖【５＿。　１．１．２　Ｄ一木糖选择标记：乳杆菌中只有少数菌株可以利　用Ｄ．木糖为碳源，Ｐｏｓｏｎ等把发酵木糖的戊糖乳杆菌染　色体上的ｘｙｌ基因簇克隆到大肠杆菌一乳酸杆菌穿梭载体　ｐＬＰ３５３７，得到重组质粒ｐＬＰ３５３７一ｘｙｌ，再将其转入到不能　利用木糖的Ｌｂ．ｃａｓｅｉ　ＡＴＣＣ３９３和植物乳杆菌中，结果转　化子能够在仅含有木糖的培养基上生长。　１．１．３蔗糖选择标记：Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ等以几种乳酸菌中的基　因片段为基础，构建了以蔗糖为选择压力的表达系统。该　系统的组分包括：戊糖片球菌中的ｓｃｒＡ／ｓｃｒＢ基因（能够编　码转运蔗糖和水解６．磷酸蔗糖的酶类），乳球菌质粒　ｐＷＶ０１的复制起点（ｏｒｉ＋），多克隆酶切位点和一段乳球菌　染色体上研究非常清楚的ＤＮＡ片段。此外，还需要　Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＬＬ１０８或ＬＬ１０２，二者可以产生为ｏｒｉ＋型质粒复制　时所必需的ｐＷＶ０１的ＲｅｐＡ蛋白…］。由于ｓｃｒＡ／ｓｃｒＢ基因　编码产物可以水解蔗糖，所以该系统可在仅含有蔗糖的培　养基中进行筛选。　１．２细菌素抗性选择标记Ｋｏｎｉｓｌｙ阐述了细菌素的概念，　即某些细菌通过核糖体机制产生的一类具有抑菌活性的蛋　白质，产生菌本身对所产细菌素具有免疫性。Ｌ．１ａｃｔｉｓ中　的部分菌株不产生乳链菌肽（Ｎｉｓｉｎ），但对其具有抗性，与　此相关的基因称之为Ｎｉｓｉｎ抗性基因或免疫相关基因（ｎｉｓＩ　和ｎｉｓＦＥＧ）ｒ　；约氏乳杆菌（Ｌｂ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）可产生Ｌａｃｔａｃｉｎ　Ｆ，　但该菌含有对此产生抗性的Ｌａｆ　Ｉ基因。此后，Ｖｏｎ　Ｗｒｉｇｈｔ等、Ｆｒｏｓｅｔｈ等、Ｌｉｕ等相继将Ｎｉｓｉｎ抗性基因克隆　到ｐＶＳ４０、ｐＦＭ０１１等质粒中，在含有Ｎｉｓｉｎ的培养基中　可对重组子进行筛选。Ａｌｌｉｓｏｎ等将携带Ｌａｆ　Ｉ的质粒　ｐＴＲＫ４３４转化到发酵乳杆菌菌株中，在含有Ｌａｃｔａｃｉｎ　Ｆ的　培养基中可对其进行筛选。然而，细菌素抗性基因也存在　种内或种间漂移的弊端，结果导致抗性阳性和阴性相互转　化现象的发生。所以应用过程中可同时采取两种或以上细　菌素抗性基因来避免此现象。　１．３　营养缺陷型选择标记是指采用表型互补作用的一　类选择标记。该种方法首先需要对编码这些表型的基因进　行突变或缺失，然后将其整合到质粒中，构建的重组体具　有相应的表型缺陷，当整合入同源或异源完整的重组体缺　陷基因后，起到相应表型功能的互补，以此用于重组体的　筛选。Ｄｉｃｋｌｅｙ等在ｔＲＮＡ抑制基因的基础上构建了乳酸　菌表达载体ｐＦＧ１，该载体由Ｌ．１ａｃｔｉｓ一个质粒的最小复制　子、乳酸菌的赭石突变（Ｏｃｈｒｅ）抑制基因ｓｕｐＢ及一段人工　合成的含有１　１个限制性酶切位点的多克隆位点组成，载　体大小约２　ｋｂ。当与嘌呤生物合成途径中的基因发生赭　石突变的宿主联合使用时，ｓｕｐＢ便可用作选择性标记。　Ｓｏｒｅｎｓｅｎ等用琥珀突变抑制基因ｓｕｐＤ构建了可抑制嘧啶　营养缺陷的载体ｐＦＧ２００ｔ”】。以上两种选择标记均属无义　突变抑制基因，这种突变基因比其他“食品级”标记有许　多优点，它使用灵活，可在多种培养基上进行选择；其基　因产物是ＲＮＡ，而不是蛋白质，因此不会有酶活性或抑　菌作用。但ｔＲＮＡ抑制基因可能会导致多重效应，这是其　不利因素。　Ｒｏｓｓ等利用管家基因缺陷株为受体菌，克隆入相应　的缺陷基因作为选择标记，从Ｌ．１ａｃｔｉｓ中克隆了胸苷酸合　成酶（ｔｈｙＡ）基因并以此为选择压力构建了质粒ｐＰＲ１０１和　ｐＰＲ１０２，以及导入ｔｈｙＡ基因缺陷型的Ｅ．ｃｏｌｉ中进行表达。　Ｐｉｎｔｅｒ等从Ｌｂ．ｃａｓｅｉ中克隆了ｔｈｙＡ基因。以ｔｈｙＡ基因为　选择压力重新构建了质粒ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８和ｐＫＧＳ，以这　些衍生质粒为载体使许多可溶性蛋白在含有ｔｈｙＡ基因缺　陷型的Ｅ．ｃｏｉｌ中得以表达ｌｌ４］。王春风等利用ｔｈｙＡ基因替　代穿梭载体ｐＷ４２５ｅ中的红霉素抗性基因，得到了以ｔｈｙＡ　为选择压力的非抗性重组质粒表达载体ｐＷ４２５ｔ，该质粒　转化ｔｈｙＡ基因缺陷型的嗜酸性乳酸杆菌后，转化体可以　在不含胸苷酸的培养基上生长【４Ｊ。采用ｔｈｙＡ为选择标记　构建的非抗性表达载体转入ｔｈｙＡ缺陷型乳酸菌中，能够　有效地表达出具有其保护活性的目的蛋白。　Ｂｒｏｎ等构建了以氨基酸缺陷为选择压力的表达载体，　应用ａ／ｒ基因（编码合成丙氨酸消旋酶的基因）作为选择标　记。Ｌ．１ａｃｔｉｓ和Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ中染色体上含有单一拷贝的ａＪｒ　基因，缺失该基因（△ａＪｒ）的菌株表现出Ｄ一丙氨酸营养缺　陷型；因此，携带异源ａ／ｒ基因的质粒能够被筛选出来　】。　１．４抗金属离子和噬茵体选择标记乳酸菌的有些质粒　含有抗金属离子镉（ｃｄ）的基因，利用该质粒构建成乳酸菌　表达载体可表达ＮｉｓｉｎＲ和ＣｄＲ，这样抗金属离子Ｃｄ基因　就作为选择标记在含Ｃｄ的培养基中可以筛选转化子；Ｌｉｕ　等首次从Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．１ａｃｔｉｓ　ＬＬ５８—１株中分离出由质粒编　码的铜离子抗性的操纵子，与载体重组后，可使菌体表现　出铜离子抗性，从而进行阳性菌株的筛选ｌｌ６］。另外，利用　噬菌体抗性有关的片段构建的载体可以使工业应用的乳酸　菌菌株抵抗噬菌体的侵染，载体上的噬菌体抗性片段也可　以作为“食品级”选择标记。　２乳酸菌表达载体系统　乳酸菌的表达系统按照基因组内启动子的类型可以分　８２６　中国预防兽医学报　２００８正　为组成型表达系统（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）诱导型　表达系统（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ／ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）。　２．１　组成型表达系统真细菌多数基因的共有序列是一３５　区ＴＴＧＡＣＡ和一１０区ＴＡＴＡＡＴ，其间相距１７±１　ｂｐ，Ｅ．ｃｏｌｉ　由盯７０识别，枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由盯４３识　别，由于乳酸菌组成型表达系统的启动子是组成型的，能　够不停地持续表达出目的蛋白，所以一些学者对乳酸菌的　转译过程作了大量的研究，特别是乳球菌属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）　和乳杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）。然而，只有Ｌ．１ａｃｔｉｓ携带了编　码主要盯因子的ｒｐｏＤ基因。该ｒｐｏＤ基因可以编码一个　大小为３９　ｌ（ｕ的蛋白质，这种蛋白质与营养型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　盯４３和Ｅ．ｃｏｌｉ盯７０的Ｃ末端具有高度的同源性。Ｋｕｉｐｅｒｓ　等利用Ｌ．１ａｃｔｉｓ的组成型启动子，在乳酸菌中实现了蛋白　质的高效表达　】。　目前对乳酸菌组成型表达系统比较成熟的研究方法有　３种。（Ｉ）基于筛选载体的研究，使质粒和转座子携带一　些非启动子的报告基因，例如：氯霉素抗性基因（ｃａｔ．８６）、　ｐ．半乳糖苷酶基因（ＬａｃＺ）或Ｂ一葡萄糖苷酶基因（ｇｕｓＡ）；　（ＩＩ）在不同细菌的管家基因中应用ＰＣＲ扩增、ＤＮＡ探针　等手段筛选并纯化具有强表达性的组成型基因，用于重组　载体的构建；（ＩＩＩ）在Ｌ．１ａｃｔｉｓ中筛选出组成型的强启动子，　该方法是目前研究的热点之一。Ｊｅｎｓｅｎ等研究报道，　Ｌ．１ａｃｔｉｓ组成型强启动子在基因表达时能够通过调节而执　行表达，并根据这种启动子序列重组表达载体，其表达活　性可高达１　０００倍以上［１８】。张莉等获得了柔嫩艾美尔球虫的　Ｔ４抗原ｃＤＮＡ，并将其亚克隆到Ｌ．１ａｃｔｉｓ表达载体ｐＭＧ３６ｎ　中，获得重组质粒ｐＭＧ３６ｎ—ＴＡ４，电穿孔法转化Ｌｌａｃｔｉｓ　ＬＭ０２３０，表达产物与预期大小的ＴＡ４蛋白分子量一致［１９］。　然而，组成型表达系统虽然实现了目的蛋白质的高效　表达，但这种持续高效表达可以导致细胞内蛋白质的蓄　积、聚集或细胞质中蛋白质的降解，从而增加了宿主菌的　代谢负荷，并导致宿主细胞的损伤。为此，人们探索了诱　导型表达系统，使目的基因的表达受诱导物的控制。　２．２诱导型表达系统诱导型表达系统的启动子需要诱　导物的激活。然而，　“食品级”乳酸菌诱导型表达载体的　基本要求是载体中不得含有非“食品级”的功能性ＤＮＡ　片段。现已获得了“食品级”诱导型启动子。　２．２．１　ｐＨ诱导型表达系统：鉴于能够发酵产酸是乳酸菌　的生理特性之一，在对表达系统进行筛选时发现了ｐＨ值　依赖型启动子，这种启动子同样也与其他选择压力（如：　温度、离子浓度等）因子有关。应用氯化物，谷氨酸或其　他酸性物质诱导后，ｇａｄ启动子能够启动表达，其具体的　机制尚不清楚，但推测可能是由于ｇａｄ启动子编码的　ＧａｄＲ蛋白可作为转录激活物启动基因的表达。据此，　Ｓａｎｄｅｒｓ等在乳酸菌培养基中加入０．５　ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１可诱　导菌体的表达，表达量多达１　０００倍　。　Ｍａｄｓｅｎ等研究了受ｐＨ值和菌体生长期调节的启动子　Ｐ１７０［２￣１。研究表明，启动子活性和ｐＨ值调节所需的最小　ＤＮＡ的大小为５１　ｂｐ，其中含有转录起始位点上游的７　ｂｐ　的片段。５１　ｂｐ的片段上不含公认的．３５启动子区，但其　一１０区很长。当一个大小为２８　ｂｐ的片段（含有一３５区和组　成型启动子上游的２２　ｂｐ）取代Ｐ１７０相应的序列时，得到　的重组启动子可以受ｐＨ值和菌体生长期的调节。这表明　了Ｐ１７０上含有控制启动子调节的顺式作用元件。转录分　析表明，Ｐ１７０启动了单顺反子ｏｒＤ（的转录，ｏｒｆＸ基因编　码了一段可能与Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中蛋白质同源的多肽。对生长　于一定ｐＨ值下的Ｌ．１ａｃｔｉｓ总ＲＮＡ分析表明，能够诱导启　动子Ｐ１７０发生转录的ｐＨ值为６．５～６．０，但前提是菌体　处于静止生长期。Ｐｌ７Ｏ的染色体缺失和化学突变作用证　实了未发生翻译的ｍＲＮＡ前端存在一个特殊区域，可在　Ｐｌ７Ｏ的指导下调节表达水平。当缺失这一前端上７２　ｂｐ　的Ｈａｒｅ　ＩＩＩ片段时（不影响启动子的调节），使基因表达水　平提高了１５０　２００倍。应用Ｂ．半乳糖苷酶基因作为报告　基因构建的表达载体ｐＡＭＪ５２９，ｐＡＭＪ５３６和ｐＡＭＪ５４７，转　化到受体菌株Ｌ．１ａｃｔｉｓ中，报告基因仅在ｐＨ５．５的ＧＭ１７培　养基中表达，在ｐＨ７．０的Ａｒｇｌ７培养基中表达受到抑制【２】】。　Ｍａｄｓｅｎ等在后续的研究中发现了一种反式作用蛋白　．ＲｃｆＢ，Ｒｃｆｌ３是启动子Ｐ１７０和Ｐ１的ｐＨ值诱导作用中必　不可少的。这种调节蛋白属于转录调节子Ｃｒｐ—Ｆｎｒ家族中　的成员，并应用Ｂ一半乳糖苷酶基因作为报告基因证实了　这一观点　１。　２．２．２　３１诱导型表达系统：　３１诱导型表达系统是基　于乳酸菌噬菌体　３１的中期启动子而构建的，可被　３１　侵染所诱导表达，并可导致宿主菌的崩解。该系统由　３１启动子和　３１复制子组成。系统表达的一个辅助因　素是载体上含有一个同样也受噬菌体侵染所诱导的　３　１　复制原点（ｏｆｆ　３１），诱导后呈现高效复制。噬菌体　３ｌ　的侵染可诱导ｔａｃ基因的表达，并合成反式作用Ｔａｃ转录　激活物，噬菌体　３１的中期启动子Ｐ８６２５也同样受噬菌　体侵染和Ｔａｃ转录激活物的诱导。Ｐ８６２５能够启动蛋白质　的高效表达，但最终会引起宿主菌的崩解。对３２２　ｂｐ的　最小启动子片段的分析表明，反式重复序列中的突变在噬　菌体侵染２　ｈ后可对启动子进行正向调节，诱导量可保持　在１　０００倍以上　】。　２．２．３糖类诱导型表达系统：糖类诱导型表达系统的操　纵子由有关糖类运输和代谢的大部分基因所组成，这些操　纵子在转录起始阶段可被严格控制和高效表达。多数表达　系统受控于ＣｃｐＡ（Ｃａｒｂｏｎ　ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ）介导的代谢　阻遏物，但研究证实，有些也受特殊调节子的控制。　乳酸菌中乳糖的运输存在两种不同的方式，即磷酸烯　第１０期　郝凤奇，等．“食品级”乳酸菌表达载体系统的研究进展　８２７　醇式丙酮酸（ＰＥＰ）依赖性磷酸转移酶系统（ＰＴｓ）和乳糖透性　酶系统。编码乳糖透性酶系统的一些类基因构成了乳酸菌　利用乳糖的操纵子，并在乳明串珠菌编码该酶的基因中发　现了有２个发生重叠的基因（１ａｃＬ、ｌａｃＭ），二者在该菌利　用乳糖时缺一不可【２４】。　目前，已有一些同源或异源的报告基因应用于构建乳　糖诱导表达系统。这些表达系统在基因定位和糖诱导等方　面的效率是不同的。尽管多数启动子受控于阻遏物，但研　究表明，嗜热链球菌（ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）的ｊａｃ启动子受控于　转录激活物。嗜热链球菌的这种糖诱导表达系统与其他系　统不同的是，该系统不含有高拷贝数的质粒，但可被插入　的单一拷贝基因（取代染色体的ｌａｃ区）所诱导。Ｌ．１ａｃｔｉｓ强　启动子ｌａｃＡ实际上不受代谢物阻遏，而是受ｌａｃＲ阻遏物　的自身调节。乳糖的诱导作用是受乳糖分解代谢中间产物　６．磷酸塔格糖钝化ｌａｃＲ阻遏物而实现的。已经证实了在　诱导过程中存在着ｌａｃＲ阻遏物的残基。通过克隆ｌａｃＡ启　动子控制下的Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔ７　ＲＮＡ聚合酶基因，构建了一种复　杂的Ｌ．１ａｃｔｉｓ诱导表达系统，该系统利用了Ｔ７启动子能　够被乳糖所诱导表达的有效性。Ｐｌａａｅｅｕｗ等用／ａｃＦ基因　作为选择标记，Ｂ一葡萄糖苷酶基因（ｇｕｓＡ）作为报告基因　（克隆到启动子ｌａｃＡ的下游），Ｌ．１ａｃｆｉｓ　ＮＺ３０００为受体菌　株，构建了乳糖诱导的“食品级”表达载体系统【９Ｊ，当重　组菌在含有乳糖培养基上生长时，ｌａｃＡ可以启动ｇｕｓＡ基　因的高度表达。　２．２．４温度诱导型表达系统：对Ｌ．１ａｃｔｉｓ温和型噬菌体　ｒｌｔ的ＤＮＡ全基因序列进行分析，发现了一个与溶源性　有关的调控区。该调控区由逆转录的２个启动子组成（Ｐ１　和Ｐ２），分别控制／ＴＯ基因（编码阻遏物）和ｔｅｃ基因（编码　Ｃｒｏ的拓扑异构体）的表达，两个基因间存在３个２１　ｂｐ的　正向重复序列，且内部具有二重对称的区域，这可能构成　了调控的操纵位点。Ｎａｕｔａ等研究发现，Ｐ２启动子的表达　受Ｒｒｏ的阻遏。通过获得一个热不稳定的Ｒｒｏ的阻遏物变　异体，从而实现该系统的热诱导表达，Ｒｒｏ阻遏物有Ｎ一　端和Ｃ．端两个结构域，前者与操纵位点的结合有关，后　者介导二聚体的形成、二聚体间的作用和自身的裂解。当　存在诱导信号时，阻遏物在连接Ｎ．端和Ｃ一端的铰链区发　生自身裂解，解除阻遏作用。　Ｎａｕｔａ等利用　ｃＺ作为报告基因对此进行了研究。结　果表明，Ｒｒｏ阻遏蛋白的５０、５４和６１位氨基酸突变为　Ｓｅｒ、Ｖａｌ和Ａｌａ，在２４℃～３０℃时Ｂ一葡萄糖苷酶活性很　低，当温度提高到４２℃时，诱导表达量提高了５００倍　。　２．２．５　Ｎｉｓｉｎ诱导型表达系统（ＮＩＣＥ）：Ｎｉｓｉｎ是由某些　Ｌ．１ａｃｔｉｓ产生的一种小分子抗生物肽，由３４个氨基酸组　成，分子量约为３　５１０　ｋｕ。Ｎｉｓｉｎ的生物合成有赖于其自　身的调节，并且Ｎｉｓｉｎ还可作为信号分子启动Ｎｉｓｉｎ生物　合成基因簇的表达，包括ｎｉｓＡＢＴＣＩＰＲＫＦＥＧ，共１１个基　因，其中包括三个启动子，ｎｉｓＡ，ｎｉｓＦ和ｎｉｓＲ。ｎｉｓＲ可持　续的启动ｎｉｓＲＫ基因的表达，而ｎｉｓＡ和ｎｉｓＦ的启动受控　于Ｎｉｓｉｎ的自身调节。ＮｉｓＫ（起传感蛋白作用的组氨酸激　酶）和ＮｉｓＲ（应答调节物）构成了Ｎｉｓｉｎ自身调节的双组分调　节元件。Ｋｕｉｐｅｒｓ等提出了一个Ｎｉｓｉｎ生物合成的自身调节　模型。首先，ＮｉｓＫ识别Ｎｉｓｉｎ分子（最低浓度为０．０５　ｎｇ／ｍＬ），　ＮｉｓＫ的Ｎ末端（大部分位于胞外）与Ｎｉｓｉｎ相连时，发生自　身磷酸化，并将磷酸基团传递给细胞内应答调节蛋白　ＮｉｓＲ，ＮｉｓＲ可作为启动子ｎｉｓＡ／ｎｉｓＦ的转录激活物，从而　启动基因的表达。这种调节系统属于依赖于肽类信息素的　传感系统，广泛的存在于革兰氏阳性细菌中　。　基于此，Ｄｅ　Ｒｕｙｔｅｒ等首次在Ｌ．１ａｃｔｉｓ中构建了ＮＩＣＥ　表达系统。首先，分离基因ｎｉｓＲ和ｎｉｓＫ，并将其整合到　宿主菌的染色体中；其次分离启动子ｎｉｓＡ用于构建质粒　载体。将目的基因克隆到启动子ｎｉｓＡ的下游，并转化到　染色体中含有ｎｉｓＲ和ｎｉｓＫ基因的宿主菌中，在Ｎｉｓｉｎ的　诱导下，得到了目的基因的表达产物　。研究结果表明，　ｎｉｓＡ启动子在被修剪缩短至５０　ｂｐ时，用于构建转录和翻　译的融合载体，并成功地表达了氨基转移酶Ｎ，表达量为　菌体蛋白总量的５０％之多。　２．２．５．１　Ｎｉｓｉｎ诱导型的转录融合载体：转录融合载体含　有ｎｉｓＡ启动子区，从ｎｉｓＡ转录位点的．１５６￣＋１５６位，其　中包括ＮｉｓＲ和ＲＢＳ（核糖体结合位点）、一３５～一１０区序列　的转录位点、ｎｉｓＡ编码区及转录终止信号。目的基因含　有其自身的起始密码子，且起始密码子和ＲＢＳ之间的距　离可以随基因插入位点的不同而不同，二者之间多余的碱　基对转录的效率起了很大的作用　。　２．２．５．２　Ｎｉｓｉｎ诱导型的翻译融合载体：在启动子区的后　面引入了一个含有起始密码子（ＡＴＧ）的Ｎｃｏ　Ｉ限制性酶切　位点，可用于启动子区内其他携带有效ｎｉｓＡ和ＲＢＳ基因　的翻译融合。目的基因必须插入到该酶切位点，并保证　ＡＴＧ与ＲＢＳ间的有效距离，目的是要得到高效翻译和提　高表达水平。将ｇｕｓＡ作为报告基因的Ｎｉｓｉｎ诱导表达系　统在菌株Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＮＺ９８００和Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＮＺ３９００中已作了大量　的研究。结果表明，翻译融合载体与转录融合载体，其　Ｂ一葡萄糖苷酸酶活性相比，前者比后者提高６倍之多。　然而，转录融合载体的控制要相对的稳定一些，这是表达　毒素蛋白的潜在优势［３ｏ】。　２．２．５．３　Ｎｉｓｉｎ诱导型的定向重组表达载体：首先，构建　出一段由ｎｉｓＡ启动子区和目的基因组成的融合基因，然　后将此融合基因克隆到载体上进行表达。例如：载体　ｐＦＩ２３９１和ｐＦＩ２４３６，在ｎｉｓＡ之前分别携带了一段Ｌ－ｐｅｄＡ　和Ｌ．ｃｖａＣ重组基因。将这两段基因分别转化Ｎｉｓｉｎ产生菌　Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＦＩ５８７６和非Ｎｉｓｉｎ产生菌Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＦＩ７８４７中，在Ｎｉｓｉｎ　８２８　中国预防兽医学报　２００８笠　的诱导下表达了片球菌素ＰＡ一１和大肠杆菌素Ｖ【３】】。　３小结与展望　目前的研究结果表明，乳酸菌诱导表达载体系统在特　２．２．５．４　Ｎｉｓｉｎ的诱导：诱导作用需要野生型菌株产生的　Ｎｉｓｉｎ（或其突变体、类似物）。Ｄｅ　Ｒｕｙｔｅｒ等研究表明，产　生Ｎｉｓｉｎ菌株培养基的上清液也可以起到诱导作用。当带　有ｎｉｓＡ启动子及其所控制的外源目的基因的质粒导入不　加Ｎｉｓｉｎ而具有ｎｉｓＲ和ｎｉｓＫ基因的乳酸菌中时，外源基　因的表达很弱，甚至检测不到。但当对数生长期时在培养　定诱导物存在的条件下，目的基因能够在这些诱导型启动　子的控制下进行表达。诱导表达信号包括：ｐＨ值、噬菌　体　３１、糖类、温度及Ｎｉｓｉｎ。尽管体外试验表明，这些　载体都有可靠的诱导性，然而何种表达系统更适合作为口　基中加入Ｎｉｓｉｎ（０．０１　ｎｇ／ｍＬ～１０　ｎｇ／ｍＬ）后，由ｎｉｓＡ启动　子控制的外源基因的转录被激活，其表达水平在一定范围　内与Ｎｉｓｉｎ的添加量成正相关（剂量一效应关系），最大诱　导表达出现在诱导后２　ｈ，最高诱导效率可达１　０００倍以　上，表达目的蛋白占胞内溶解总蛋白的６０％【３２］。　ＮＩＣＥ系统由于其诱导表达效率高，并具可食性，故　其研究相对透彻。同时，也构建了许多比较成熟的诱导表　达载体，表达了大量的同源或异源的菌体蛋白、酶类、膜　蛋白、细菌素及某些抗原类等物质【　。　２．２．６宿主菌株：　“食品级”表达裁体最终要转化到受　体菌中发挥其功能。因此，宿主菌株的安全性、稳定性、　可鉴定性及通用性等尤为重要。目前，在可作为乳酸菌受　体菌株中，应用最多的有乳球菌属、肠球菌属和乳杆菌属　中的一些种。在乳球菌属中的Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＭＧ１３６３、Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＬＭ０２３０和Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＭＧ１６１４等已经作为标准的乳酸菌受　体菌株在实验室中应用；肠球菌菌属常用的受体菌属于　粪肠球菌，如Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ　ＯＧ１Ｘ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ　ＦＡ２．２、Ｅ．　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＤＬ３、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ　ＡＴＣＣ１９４３３；乳杆菌属中主要有　Ｌｂ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ及Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ等几个　种。应用过程中，可根据选择标记及载体的用途不同，对　宿主菌进行“食品级”要求范围内的遗传修饰。　研究表明，乳杆菌属、肠球菌属、枯草芽孢杆菌属、　链球菌属、乳明串珠菌、瑞士乳酸杆菌，特别是乳酸乳球　菌，都可以表达一定数量的ＮｉｓＲ和ＮｉｓＫ蛋白质，都可作　为ＮＩＣＥ系统的潜在宿主菌　。基于Ｎｉｓｉ的产生，已经构　建了两种类型的ＮＩＣＥ系统宿主菌：（Ｉ）能够产生Ｎｉｓｉｎ　的Ｌ．／ａｃｔ／ｓ，例如：Ｌ．／ａｃｔ／ｓ　ＦＩ５８７６和Ｌ．／ａｃ　ＮＺ９７００，均　来自经过质粒和噬菌体修饰的野生型菌株；（ＩＩ）一类自身　不能产生Ｎｉｓｉｎ的菌株。一种是由Ｎｉｓｉｎ产生菌衍生出来　的菌株，例如：Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＮＺ９８００（Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＮＺ９７００的衍生　菌）缺失了ｎｉｓＡ基因的４　ｂｐ；Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＦＩ７３３２（Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＦＩ５８７６的衍生菌）在其ｎｉｓＡ基因的Ｓａｃ　Ｉ位点上带有一个　红霉素抗性基因；Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＦＩ７８４７（Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＦＩ５８７６衍生菌）在　ｎｉｓＡ中插入了２０　ｂｐ的序列。另一种是来自于不产生　Ｎｉｓｉｎ的Ｌ　１ａｃｔｉｓ或其他菌属，在其染色体中整合入ｎｉｓＲＫ　基因，例如：Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＮＺ９０００和Ｌ．１ａｃｔｉｓ　ＮＺ３９００。这些菌　株都可作为ＮＩＣＥ的宿主菌。　服功能性生物制剂的载体仍需要进一步研究。　Ｍａｄｓｅｎ等研究表明，ｐＨ值诱导型表达系统中的启动　子（Ｐ１７０）是受低ｐＨ值与低温正向调节的，尽管体外试验　使Ｐ１７０的诱导提高１５０倍［２ｌ】。但基于该种表达载体除需　要低ｐＨ值诱导外，启动子的表达还要求低温以及特定的　离子浓度。因此，能否应用于口服生物制剂的载体仍有质　疑。　３１诱导表达系统以噬菌体侵染宿主为表达信号，　其特点是以宿主菌崩解为代价，将高效诱导的目的产物释　放到培养基中，因此，制约其用于载体的可持续性。此　外，该系统受限于特异的宿主．噬菌体相互作用，所以很　难达到工业化生产规模。糖类诱导表达系统中的诱导物　（乳糖）是常见的二糖，存在于所有研究过的哺乳动物的乳　汁中，乳糖的水溶性很低，因而在肠道内吸收相对很慢，　可被乳酸菌利用。糖诱导表达系统虽然安全、高效，但缺　乏广泛的宿主谱，而且诱导产物浓度不易控制，需要一个　更好更易于控制的有效阻遏系统进行调控，不适合大规模　发酵生产。而温度诱导表达系统中，启动子的最适宜温度　是４２℃［２６１。然而，人体肠道内的正常温度约为３７．５℃，　畜禽中猪、牛、马和家禽肠道内正常的温度分别约为　３９．２℃、３８．３℃、３７．６℃和４１．７℃。因此，该类型表达　系统可大量推广应用于体外发酵工业，而作为Ｅｌ服生物制　剂的载体则使用范围相对狭窄。并且，高温还可诱导许多　热休克蛋白质的表达，这是其不利因素。　相比之下，ＮＩＣＥ系统在执行诱导表达时具有如下优　点：（Ｉ）Ｎｉｓｉｎ是由乳酸菌产生的一类抗生物肽，作为　“食品级”诱导分子，具有高效、安全、无毒的特性，能　直接用于食品中。（ＩＩ）采用诱导型表达替代原来的组成型　表达，使细菌生长与外源基因的表达分为两阶段，从而减　轻了宿主细胞在表达目的蛋白时的代谢负荷　】。（ＩＩＩ）诱导　物的获得相对容易，产Ｎｉｓｉｎ菌株稀释的上清液即可用作　诱导物，所以生产Ｎｉｓｉｎ的菌株可以包含在发酵液中，并　可通过加入小量的Ｎｉｓｉｎ来进行诱导，而其他起始培养细　菌不会遭受亚抑制量Ｎｉｓｉｎ的损害。随着一些Ｎｉｓｉｎ突变　体的构建成功，可用比野生型菌株所需更低浓度的Ｎｉｓｉｎ　作为诱导物　。（ＩＶ）诱导后蛋白的表达量最高能达到菌体　胞内蛋白总量的６０％，并且表达水平＞１０００个诱导量　时，其诱导水平直接决定于Ｎｉｓｉｎ添加的剂量ｆ１７，３５１。ｆＶ）　受控严格，非诱导条件下不表达基因的产物或表达量很少　第１０期　郝凤奇，等．“食品级”乳酸菌表达载体系统的研究进展　８２９　以至于检测不到［３５】。迄今为止，该系统已经表达了多种以　疫苗和生物工程为研究目的的蛋白质、生物防腐剂和酶　类，是应用比较广泛的“食品级”乳酸菌表达载体系统。　此外，宿主的选择要依照载体的用途不同而异。作为　Ｅｌ服生物制剂的乳酸菌要依据人类和动物不同生理阶段，　选择胃肠道内的优势菌群；体外发酵用的乳酸菌则仅需考　虑载体的宿主谱即可。然而，如上所述适合ＮＩＣＥ系统的　宿主菌有两类，即产Ｎｉｓｉｎ和非产Ｎｉｓｉｎ的菌株。对于前　者来说，Ｎｉｓｉｎ不仅可以诱导克隆在启动子ｎｉｓＡ之后目的　基因的表达，也可以诱导其自身的合成。因此，这些菌株　可以作为自身诱导基因表达的宿主。对于后者来说，目的　基因的诱导表达要在菌体对数生长期时加入Ｎｉｓｉｎ时才能　实现。通常情况下，非Ｎｉｓｉｎ产生菌要比Ｎｉｓｉｎ产生菌衍　生而来的宿主菌诱导效率高，诱导所需Ｎｉｓｉｎ的浓度低。　因为后者的染色体内会携带Ｎｉｓ　Ｉ或其他免疫蛋白质　（ＮｉｓＦＥＧ）ｔ”］。况且，Ｎｉｓｉｎ产生菌可持续的产生诱导物，在　某种程度上无异于组成型表达，从而限制了该类菌株在可　控表达目的蛋白中的应用。所以，在选择宿主菌时，除应　考虑常规因素外，还要依据具体的用途选择不同的菌株。　通过乳酸菌表达载体的研究，在揭示乳酸菌基因组功　能的基础上，为乳酸菌基因工程及分子生物学的研究提供　了一种高技术操作平台，推动了生命科学的发展。其应用　涉及到食品、保健、医药及动物科学体系，为相关学科的　深入研究提供了可靠的理论依据。鉴于乳酸菌诱导表达系　统的诸多优势，今后的研究重点应着眼于拓展“食品级”　载体的宿主谱、提高诱导表达水平和表达产物的生物活性　等方面。构建出的“食品级”乳酸菌高效表达载体系统有　望在发酵工程和口服功能性生物制剂方面得到长足的发展。　参考文献：　［１］　王春风．乳酸菌在畜牧业中的应用【Ｍ］．长春：吉林科学技术　出版社，２００５，１．５．　［２］　Ｈａｖｅｎｉｔｈ　Ｃ　Ｅ．Ｓｅｅｇｅｒｓ　Ｊ　Ｆ．Ｇｕｔ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ　ｆｏｒ　ｏｒａｌ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ【Ｊ】．Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓ　Ｉｎ，２００２，２（３５）：１５１－１６３．　【３】　王荫榆．有关乳酸菌质粒和表达体系的研究【Ｄ］．上海：复旦　大学，２００３．　［４】　王春风．共生乳酸杆菌非抗性表达载体的构建及柔嫩艾美耳　球虫ＳＯ７基因的表达【Ｄ］．北京：中国农业大学，２００１．　［５］　Ｔａｋａｌａ　Ｔ　Ｍ，Ｓａｒｉｓ　Ｐ　Ｅ，Ｔｙｎｋｋｙｎｅｎ　Ｓ　Ｓ．Ｆｏｏｄ—ｇｒａｄｅ　ｈｏｓｔ／ｖｅｃｔｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ・－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏ－－ｂｅｔａ－－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｌａｃＧ　…．Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，６Ｏ（５）：５６４—５７０．　［６］　Ｖｏｓ　Ｗ　Ｍ．Ｓａｆｅ　ａｎｄ　ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　ｆｏｏｄ・ｇｒａｄｅ　ｆｅｒｍｅ・　ｎｔａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｍｏｄｉｉｆｅｄ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｄａｉｒｙ　Ｊ，１９９９，９（１）：３－１０．　［７】　Ｙｏｔｈｅｒ　Ｊ，Ｔｒｉｅｕ—ｃｕｏｔ　Ｐ，Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ　Ｔ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｓｔｒｅ—　ｐｔｏｃｏｃｃｉ，ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ，ａｎｄ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ：ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｉｘｔｈ　ｉｎｔｅｍａ—　ｔｉｏｎａｌ　ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００２，１８４（２２）：６０８５－６０９２．　［８］　Ｂｅｍａｒｄ　Ｒ　Ｇ，Ｊａｃｋ　Ｊ　Ｐ．分子生物技术．重组ＤＮＡ的原理与　应用［Ｍ］．陈丽珊，任大明主译．第３版，北京：化学工业出　版社，２００５，４８—５３．　［９］　Ｐｌａｔｔｅｅｕｗ　Ｃ，Ｖａｎ　Ａ　Ｂ，Ｖａｎ　Ｓ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｆｏｏｄ—ｇｒａｄｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ…．Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏ—　ｂｉｏｌ，１９９６，６２（３）：１００８—１０１３．　［１Ｏ］　Ｍａｃｃｏｒｍｉｃｋ　Ｃ　Ａ，Ｇｒｉｆｆｉｎ　Ｈ　Ｇ，Ｇａｓｓｏｎ　Ｍ　Ｊ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｆｏｏｄ・ｇｒａｄｅ　ｈｏｓｔ／ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｌａｃｔｏｓｅ　ｏｐｅｒｏｎ［Ｊ］．ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ，１９９５，ｌ２７（１—２）：１０５—１０９．　Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ　Ｋ，Ｂｏｌｈｕｉｓ　Ａ，Ｖｅｎｅｍａ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｆｏｏｄ・－ｇｒａｄｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ・－ｃｏｐｙ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　［ＪＪ．Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｉ９９８，４９（４）：４１７－４２３．　【１２］　Ｔａｋａｌａ　Ｔ　Ｍ，Ｓａｒｉｓ　Ｐ　Ｅ．Ａ　ｆｏｏｄ—ｇｒａｄｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｎｉｓｉｎ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｇｅｎｅ　ｎｉｓＩ【Ｊ］＿Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，５９（４—５）：４６７—４７１．　［１３］　Ｓｏｒｅｎｓｅｎ　Ｋ　Ｉ，Ｌａｒｓｅｎ　Ｒ，Ｋｉｂｅｎｉｃｈ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｆｏｏｄ・ｇｒａｄｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ【Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，６６（４）：１２５３—１２５８．　［１４］　Ｐｉｎｔｅｒ　Ｋ，Ｄａｖｉｓｓｏｎ　Ｖ　Ｊ，Ｓａｎｔｉ　Ｄ　Ｖ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ　［Ｊ］ｌ　ＤＮＡ，１９９８，７（４）：２３５－２４１．　［１５】　Ｂｒｏｎ　Ｐ　Ａ，Ｂｅｎｃｈｉｍｏｌ　Ｍ　Ｇ，Ｌａｍｂｅｒｔ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｉｒ　ｇｅｎｅ　ａｓ　ａ　ｆｏｏｄ－ｇｒａｄｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒ　ｉｎ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ【Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，６８（１　１）：５６６３—５６７０．　［１６］　Ｌｉｕ　Ｃ　Ｑ，Ｃｈａｒｏｅｃｈａｉ　Ｐ，Ｋｈｕｎａｊａｋｒ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉ—　ｐｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｐｌａｓｍｉｄ２　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｃｏｐｐｅｒ　ｒｅｓｉｓｔｎａｃｅ　ｏｐｅｒｏｎ　ｒｆｏｍ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ【Ｊ］＿Ｇｅｎｅ，２００２，２９７（１２２）：２４１－２４７．　【１７］　Ｋｕｉｐｅｒｓ　０　Ｐ，Ｄｅ　Ｒ　Ｐ，Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｏｖｅｒｐｒｏ—　ｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂｙ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ【Ｊ】．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｌｍｏｌ，　１９９７，１５（４）：１３５－１４０．　［１８】　Ｊｅｎｓｅｎ　Ｐ　Ｒ，Ｈａｍｍｅｒ　Ｋ．Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｓｐａｃｅｒｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｐｒｏｍ—　ｏｔｅｒｓ［Ｊ】．Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，６４（１）：８２—８７．　［１９］　张莉，秦泽荣，崔尚金，等．柔嫩艾美耳球虫ＴＡ４抗原基因　ｃＤＮＡ在乳酸乳球菌中的克隆与表达［Ｊ】．中国预防兽医学报，　２００６，２８（３）：２６—２８．　【２０］　Ｓａｎｄｅｒｓ　Ｊ　Ｗ，Ｖｅｎｅｍａ　Ｇ，Ｋｏｋ　Ｊ．Ａ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ—ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒ－　ｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｆｉｓ　［Ｊ］ｌ　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，ｌ９９７，６３（１２）：４８７７－４８８２．　［２１］　Ｍａｄｓｅｎ　Ｓ　Ｍ，ｍｒｎａｕ　Ｊ，Ｖｒａｎｇ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉａｚｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐＨ・・ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ－－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＰＩ　７０　ｏｆＬａｅｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ［Ｊ】．Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，ｌ９９９，３２（１）：７５－８７．　［２２］　Ｍａｄｓｅｎ　Ｓ　Ｍ，Ｈｉｎｄｒｅ　Ｔ，Ｌｅ　Ｐ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｔｗｏ　ａｃｉｄ—ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏ—　ｍｏｔｅｒｓ　ｆｒｏｍ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅ　ｔｈｅ　ｃｉｓ－－ａｃｔｉｎｇ　ＡＣｉＤ・－ｂｏｘ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ＲｃｆＢ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，５６　８３０　中国预防兽医学报　２００８焦　（３）：７３５—７４６．　【２３］Ｗａｌｋｅｒ　Ｓ　Ａ，Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ　Ｔ　Ｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｈａｇｅ—ｉａｄｕｃｉｂｌｅ　ｍｉｄｄｌｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｔｒａｎｓｃｆｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｆ０ｒ　ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｍｅｍｂｒｎｅ　ｐｒｏｔｅｉａｎｓ［Ｊ】．Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ，２００３，１６１０（１）：９７・１０８．　［３　１】Ｈｏｍ　Ｎ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ　Ａ，Ｄｏｄｄ　Ｈ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｎｉｓｉｎ—ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｒｏ・　ｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｄｉｏｃｉｎ　ＰＡ一１　ａｎｄ　ｃｏｌｉｃｉｎ　Ｖ　ｉｎ　ｎｉｓｉｎａｎｄ　ｎｏｎ—ｎｉｓｉｎ—　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｌａｃｔｏｃｏｅｃａｌ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ｐｈｉ３１［Ｊ］ｌ　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９８，　１８０（４）：９２１．９３１．　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］ｌ　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　２００４，７０（８）：５０３０－５０３２．　５６．　【２４］　郭本恒．益生菌［Ｍ］．上海：化学工业出版社，２００３，５５—ｌｌｅｍ　Ｍ　ｄｅ　Ｖｏｓ．Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃ－　［２５］　Ｗｉ【３２】Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ　Ｍ，Ｂｅｅｒｔｈｕｙｚｅｎ　Ｍ　Ｍ，Ｖａｕｇｈａｎ　Ｅ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｌｅｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ：ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ　ｎｉｓｉｎ—ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅｓ　ｆｏｒ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ，　ｔｅｒｉａ［Ｊ１ｌ　Ｃｕｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１　９９９，２（３）：２８９—２９５．　ｅｎｓ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ　【２６］　Ｎａｕｔａ　Ａ，Ｖａｎ　Ｂ　Ｂ，Ｋａｒｓｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｂｙ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｏｄｅ—　ａｎｄ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，６３（１　１）：　４５８１—４５８４．　ｌｉｎｇ［Ｊ］ｌ　Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１　９９７，１　５（１　０）：９８０—９８３．　ｉ　Ｌ　Ｅ，Ｋｕｉｐｅｒｓ　Ｏ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｑｕｏｒｕｍ　ｓｅｎｓｉｎｇ　［２７】　Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ　Ｍ，Ｑｕａｄｒｂｙ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｐｈｅｒｏｍｏｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｗｏ・・ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｓｉｎａｌｇ－－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　【３３】Ｚｈｏｕ　Ｘ　Ｘ，Ｌｉ　Ｗ　Ｆ，Ｍａ　Ｇ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｎｉｓｉｎ—ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ［Ｊ］．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ａｄｖ，２００６，２４（３）：２８５—２９５．　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｉｎ　Ｇｒａｍ—ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ】ｌ　Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，２４　（５）：８９５—９０４．　ｐｅｒｓ　Ｏ　Ｐ，Ｂｅｅｒｔｈｕｙｚｅｎ　Ｍ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　［２　Ｂ］　Ｄｅ　Ｒ　Ｐ，Ｋｕｉｎａｌａｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｉｓｉｎ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　【３４］徐波，曹郁生，陈燕，等．乳酸乳球菌两组分食品级ＮＩＣＥ　系统载体的构建［Ｊ］．食品研究与开发，２００６，２７（６）：２６—２９．　【３５］Ｗｕ　Ｃ　Ｍ，Ｌｉｎ　Ｃ　Ｆ，Ｃｈａｎｇ　Ｙ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｎｄ　ａｃｈａｒａｃｔｅｒｉ—　ｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｓｉｎ—ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ—　ｌａｃｔｉｓ［Ｊ　Ｊｌ　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９６，１７８（１２）：３４３４—３４３９．　ｃｈｅｎｂａｕｍ　Ｚ，Ｆｅｄｅｒｌｅ　Ｍ　Ｊ，Ｍａｒｒａ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌａｃｔｏ—　【２９］　Ｅｉｃｏｃｃａｌ　ｎｉｓＡ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｔｏ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｇｒａｍｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００６，７０（４）：７５７—７６７．　［３６】Ｋｕｉｐｅｒｓ　Ｏ　Ｐ，Ｄｅ　Ｒ　Ｐ，Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｑｕｏｒｕｍ　ｓｅｎｓｉｎｇ－　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　１９９８，６４（１）：１５－２１．　ｂａｃｔｅｒｉａ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ【Ｊ］．　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，６４（８）：２７６３・２７６９．　　Ｅ　Ｒ，Ｓｌｏｔｂｏｏｍ　Ｄ　Ｊ，Ｐｏｏｌｍａｎ　Ｂ．Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ａｓ　ｈｏｓｔ　［３０］　Ｋｕｎｊｉ（责任编辑：赵晓岩）　．、　石　石　ｌ、　石　、　石　．１；　石　石　ｌ、　石　石　－、　（上接第８１３页）　二重实时荧光ＰＣＲ检测方法比国标ＧＢ２０１９０Ｙ．２００６　的一般ＰＣＲ方法灵敏１Ｏ倍。因此，山羊和绵羊二　重实时荧光ＰＣＲ检测方法有望推广应用到饲料、肉　［３］　邵碧英，陈文炳，郑腾，等．动物产品中牛、羊源性成分多　重ＰＣＲ检测方法的建立［Ｊ１＿畜牧与兽医，２００４，３６（３）：７－９．　［４］　李胜，王建华，高巨星，等．陕西省反刍动物饲料产品和　制品、奶制品和生皮等动物产品的源性成分检测领　域，以有效防止食品和皮张等方面的掺假现象。　动物源性饲料中牛羊源性成分检测［Ｊ］ｌ动物医学进展，　２００７，２８（４）：３４－３８．　【５］　彭雁忠，贾宏，邹虹，等．多联实时荧光ＰＣＲ定量方法检测　四种肠道细菌的研究［Ｊ］．中国热带医学，２００５，５（５）：　参考文献　ＧＢ／Ｔ　２０１９０．２００６．饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合　酶链式反应（ＰＣＲ）法ｉｓ］．　【２］　曹际娟，卢行安，秦成，等．实时荧光ＰＣＲ技术检测肉骨粉　９４３—９４７．　【６］　秦智锋，吕建强，肖性龙，等．禽流感Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９亚型多　重实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建立［Ｊ】．病毒学报，　２００６，２２（２）：１３１－１３６．　ｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｋｅｄｕ．　［７］　《动物源性饲料安全卫生管理办法》．ｈｔｃｏｍ／ｃｎ／ｉｎｆｏ／ｉｎｆｏ１ａｒｃ５９８５８．ｈｔｍ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｋｅｄｕ．ａｃｏｍ／ｃｒｄｉｎｆｏ／　一中牛羊源性成分的方法［Ｊ］．生物技术通汛，２００２，１３（２）：　１５８一ｌ６１．　ｉｎｆｏ２ａｒｃ５９８５９．ｈｔｍ．　（本文编辑：陈立群）