脑梗死大鼠脑内移植超顺磁性氧化铁颗粒标记神经干细胞后的MR示踪研究

脑梗死大鼠脑内移植超顺磁性氧化铁颗粒

标记神经干细胞后的MR示踪研究

薛静　高培毅　李晋　孙崇然　黄华　安沂华

　　【摘要】　目的　探讨超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)标记的胎鼠神经干细胞(NSCs)在脑梗死模型大鼠脑内移植后,MR示踪观察的可行性。方法　大鼠脑梗死模型24只,按随机数字表法分为3组:第1组大鼠同侧尾状核移植SPIO和52溴脱氧尿核苷(BrdU)双标记的NSCs;第2组对侧尾状核移植双标记的NSCs;第3组对侧尾状核移植未标记的NSCs。移植后1、3、5、7周后进行MR示踪观察,选择T2WI和梯度回波(GRE)序列,成像后相应时间点每组处死2只大鼠,取脑组织冰冻切片后进行普鲁士蓝染色及BrdU染色。结果　移植后1周MRI显示:移植标记细胞组在注射点处可见类圆形低信号影,未标记细胞组注射点未见异常信号影;3周后,第1组梗死皮层下可见线状低信号影;移植

5周后,第2组沿胼胝体走行可见扇形低信号影,尖端指向病灶。GRE序列显示标记细胞较清晰,而T2WI显示梗死病灶和大鼠脑正常结构较清晰。相应时间点相应部位普鲁士蓝染色及BrdU染色可见

阳性细胞,与MRI结果相符。结论　超顺磁性氧化铁颗粒和BrdU双标记的神经干细胞移植至大鼠脑内后可迁移到病灶区;MR成像能够在活体内连续示踪观察神经干细胞的迁移及分布情况。

【关键词】　超顺磁性氧化铁;　磁共振成像;　干细胞;　脑梗塞;　大鼠

Magneticresonancetrackingoftransplantedneuralstemcellslabeledwithsuperparamagneticiron

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oxidenanoparticlesinischemicrat　　XUEJing,GAOPei2yi,LIJin,SUNChong2ran,HUANGHua,

3

ANYi2hua.DepartmentofNeuroradiology,TheAffiliatedBeijingTiantanHospitalofCapitalUniversityofMedicalSciences,Beijing100050,China

Correspondingauthor:GAOPei2yi,Email:cjr.gaopeiyi@vip.163.com

【Abstract】　Objective　Toexplorethemethodsoflabelingneuralstemcells(NSCs)withsuperparamagneticironoxide(SPIO)particles,andtomonitorthelabeledcellsaftertransplantationintotheischemicratwithMRscanning.Methods　Neuralstemcellswerederivedfromthebrainofembryonic142dayratandco2labeledwithSPIOmediatedbypoly2L2lysineandbromodeoxyuridine(BrdU).The24focalcorticalinfarctionmodelsofmaleSprague2Dawleyratswereinducedtendaysbeforetransplantation.Themodelsweredividedintothreegroupsinrandom:(1)ThelabeledNSCsweretransplantedintotheipsilateralcaudatenucleus;(2)ThelabeledNSCsweretransplantedintothecontralateralcaudatenucleus;(3)TheunlabeledNSCsweretransplantedintothecontralateralcaudatenucleus.MRscanningwasperformedtomonitorthetransplantedcellsafter1,3,5,7weeks.AfterMRimaging,tworatsofeachgroupwerekilledandperformedPrussianbluestainingandBrdUstainingofthehistologicalsections.Results　Duringthefirstpostimplantation,MRscanningshowedwell2definedhyperintensityinthecorticalinfarctlesion.TheimplantedlabeledcellswerevisibleonMRimagesasahypointenseareaattheinjectionsite(caudatenucleus)inthefirstandthesecondgroup.Ingroup3,theunlabeledcellswerenotobserved.Threeweekslater,linearhypointensitywasobservedinthesubcorticalinfarctlesioningroup1.Afterfiveweeks,thelowsignalintensitycouldbeseeninthecorpuscallosumandformedatriangle2liketroopwithitstipdirectedtothelesionsideingroup2.Sevenweekslater,hypointensitywasobservedinthelesionofthesecondgroup.GREsequencewasmoreclearlythanT2weightimaginginshowinglabeledcells.MRscanningresultswereconfirmedbyPrussianbluestainingandBrdUstainingofhistologicalsections.Conclusion　NSCscolabeledwithSPIOnanoparticlesandBrdUcouldmigrateintothelesionsaftertransplantedintorats′brains.MR

基金项目:北京市自然科学基金资助项目(7062013);北京市自然科学基金资助项目(7032009);国家自然科学基金资助项目(30370427);国家“十五”科技攻关项目(2004BA714B06202)

作者单位:100050首都医科大学附属北京天坛医院神经影像中心(薛静、高培毅);北京市神经外科研究所神经干细胞室(李晋、孙崇然、黄华、安沂华)

通信作者:高培毅,Email:cjr.gaopeiyi@vip.163.com

中华放射学杂志2006年2月第40卷第2期　ChinJRadiol,February2006,Vol40,No.2・123・

scanningisusefulandnoninvasivetotrackingthelocationanddistributionofthelabeledneuralstemcells.

【Keywords】　Superparamagneticironoxide;　Magneticresonanceimaging;　Stemcells;　Braininfarction;　Rats

　　近年来,通过移植神经干细胞治疗中枢神经系统损伤已取得了许多令人振奋的研究成果。但是如何在活体内无创性连续观察移植细胞的分布及生存状态是神经干细胞治疗应用于临床的必要条件。随着分子影像学的发展,科学家们设想能否通过MR成像这种无创伤性的方法示踪观察移植的干细胞?

超顺磁性MR显像剂的研制成功及其在细胞标记方面取得的快速进展,为这一难题开拓了方向。本研究采用纳米超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)和52溴脱氧尿核苷(BrdU)双标记大鼠胚胎神经干细胞,移植入局灶性大鼠脑梗死模型后,进行MR动态示踪成像,观察移植神经干细胞的迁移和[125]

法处死孕14～16d的SD大鼠,严格无菌条件下取出胎鼠,分离脑组织,解剖显微镜下剥除脑表面的蛛网膜和血管。然后研磨成组织匀浆,120目铜网过滤。将滤液接种于含30ng/mlbFGF、20ng/mlEGF

和1×B27的DMEM/F12(1∶1)。细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中,隔天半量换液。

2.胚胎神经干细胞的双标记:(1)标记SPIO:调

节SPIO和PLL的浓度,将50μg/mlSPIO、115μg/mlPLL(SPIO∶PLL=1∶0103)共同加入30ml含细胞培养基的75cm的培养瓶中,室温下振荡30～60min。将含神经干细胞的培养基离心,加入30ml新鲜培养基使细胞再次悬浮(调节细胞浓度

2分布情况,并通过组织切片的普鲁士蓝和BrdU染色验证MR成像结果,以探讨该方法的可行性。

材料与方法

一、材料

1.实验动物:健康孕14～16dSprague2Dawley(SD)大鼠1只,体重350g(购自中国医学科学院动

为2×10个/ml),在培养瓶中加入同体积的含SPIO2PLL的培养液(此时SPIO和PLL浓度分别为25μg/m和l0175μg/ml),放在37℃、5%CO2培养

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箱中共同培养18h。标记后使用亨氏液洗涤标记的干细胞3次,洗去游离的SPIO颗粒。(2)标记BrdU:将BrdU加入干细胞培养液中,使其终浓度为5μmol/L,与已用SPIO标记的神经干细胞共同培

物所)、24只清洁级SD雄性大鼠(购自维通力华动

物所),体重(250±20)g,每笼3～4只饲养,自由饮水和摄食,饲养室环境温度22～24℃,相对湿度70%左右,光照明暗比为12∶12。

2.主要实验试剂及主要仪器设备:细胞培养试

养,48h后用亨氏液反复清洗细胞3次,准备染色和移植。

3.标记细胞的普鲁士蓝染色(铁染色)和免疫

组化染色(BrdU染色):分别取标记和未标记的胚胎神经干细胞植入多聚赖氨酸处理的培养皿中,将培养液换成含10%小牛血清的DMEM/F12培养液,72h后用4%戊二醛固定30min、之后采用PBS洗

剂:培养基(DMEM/F12:1∶1,Gibco公司)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,PeproTech公司)、表皮生长因子(EGF,PeproTech公司)和B27(Gibco公司)购自晶美生物工程有限公司。SPIO(德国先灵公司),多聚左旋赖氨酸(PLL,Sigma公司),BrdU(Sigma公司)。抗BrdU单抗(Sigma公司),多聚甲醛(北京化学试剂公司),磷酸盐缓冲液(PBS,北京中山生物技术有限公司)。

倒置相差显微镜(AXIOV2MRCNikon)、手术显微镜(SXP21C,上海医疗器械股份有限公司),立体定位仪(B型,安徽淮北正华生物仪器设备股份有限公司)。

MR仪(GE公司,Signa3.0T超导型MR扫描

涤3次,分别进行铁染色和BrdU染色。铁染色:在含2%亚铁氰化钾的6%盐酸溶液(Perl试剂)中培养30min、PBS洗涤3次;1%核坚固红复染3min,蒸馏水吸去多余的核坚固红。BrdU染色:按使用说明书进行BrdU的单染操作。显微镜下观察结果。

4.制备大鼠局灶性脑梗死模型:24只SD大鼠,10%水合氯醛胶浆014ml/100g体重腹腔内注射

麻醉。左侧颞骨鳞部钻孔,局部开颅暴露左侧大脑中动脉末段,10号丝线局部结扎大脑中动脉,同时永久性结扎同侧(左侧)颈总动脉,暂时性夹闭对侧(右侧)颈总动脉115h。术后缝合皮肤伤口,待大

系统)。

二、方法

1.胎鼠神经干细胞(NSCs)的分离、培养:断髓

鼠清醒后回笼饲养。

5.神经干细胞的立体定向移植:按照随机数字

表法将实验动物分组,即移植前将已制备的24只大

・124・中华放射学杂志2006年2月第40卷第2期　ChinJRadiol,February2006,Vol40,No.2鼠脑梗死模型按体重大小编号,根据随机数字表给每只大鼠一随机数字,然后按随机数字区间进行分组,每组8只大鼠。第1组,大鼠左侧尾状核(梗死同侧)立体定向移植SPIO和BrdU双标记的NSCs;第2组,右侧尾状核(梗死对侧)移植双标记的NSCs;第3组,右侧尾状核(梗死对侧)移植未标记的NSCs。

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移植细胞数为2×10个,体积为20μl。梗死模型制作10d后,大鼠麻醉、固定,切开头顶皮肤,以中线左侧(第1组)或右侧(第2、3组)3mm、冠状缝前015mm为中心开骨孔,头皮针垂直进针,在进入515mm后缓慢推入细胞悬液20μl。留针10min后缓慢拔针。

6.MR成像:采用GE公司Signa310T超导型MR扫描仪,使用内径5in(1in=2154cm)表面线未见着色颗粒。BrdU染色阳性细胞胞核呈棕色。

3.MR成像示踪观察标记神经干细胞的分布及迁移情况:移植干细胞后1周,MR成像显示梗死病灶于T2WI呈高信号,第1、2组大鼠脑内注射点处(移植的标记细胞)可见类圆形低信号影,第3组大鼠脑内未见异常信号影;3周后,MR成像第1组梗死皮层下可见线状低信号影(图2,3);移植后5周MR成像第2组沿胼胝体走行可见扇形低信号影,尖端指向梗死皮层(图4);移植后7周,第2组于梗死皮层下可见低信号影。GRE序列显示移植细胞较清晰,而T2WI显示梗死病灶和大鼠脑正常结构相对较清晰。4.组织切片的铁染色和BrdU染色分析:1周时,第1、2组大鼠移植点处可见普鲁士蓝染色及BrdU染色阳性细胞(铁染色阳性细胞呈蓝色,BrdU染色阳性细胞呈棕色),第3组染色结果阴性;3周时,第1组于梗死皮层下可见线状排列的染色阳性细胞(图5,6);5周时,第2组胼胝体处可见呈带状排列的阳性细胞群(图7,8)。每组组织切片的阳性结果部位与MR成像结果相符。

讨

论

圈,选取T2WI快速自旋回波序列和梯度回波序列(T232GRE),冠状面扫描,分别于移植后1、3、5、7周

后行MR成像。参数:快速SE序列T2WI,TR3100ms,TE122ms;视野3cm×4cm;层厚2mm;矩阵512×512。GRE:TR450ms,TE25ms;反转角15°;带宽7181;视野3cm×4cm;层厚2mm;矩阵256×224。

7.组织切片的普鲁士蓝染色(铁染色)和BrdU染色:MR成像后相应时间点,每组分别处死2只大鼠,取10%水合氯醛胶浆014ml/100g体重腹腔内注射,左心室灌注4%多聚甲醛固定、10μm冰冻切片,行组织切片的铁染色和BrdU染色。方法同细胞染色。染色后光学显微镜下照相。

结

果

1.MR成像观察标记细胞的迁移和分布情况:

本研究表明,超顺磁性氧化铁颗粒经多聚左旋赖氨酸转染后,可以在体外标记胎鼠的神经干细胞,当标记细胞移植入大鼠脑梗死模型脑内后,利用MR成像能够连续示踪观察其在受体脑组织内的分布和迁移情况,其后的组织学染色证实了MR成像的结果。该结果与国外一些学者的研究相符,Hoehn等报道脂质体转染的MR对比剂SPIO标记胚胎干细胞,缺血大鼠脑内移植后,利用高场强MR(7T)观察到移植细胞向病灶区的迁移;他们的研究同时发现细胞的迁移与脑损伤局部释放的细胞因子有关,本实验小组也正在进行相关研究。Zhang等将SPIO标记的大鼠室管膜下区干细胞,移植入缺血模型大鼠的脑池系统内,也发现移植干细胞特异地向缺血

[8,9]

脑实质处迁移。Jendelova等使用USPIO和BrdU双标记大鼠骨髓间充质细胞,通过脑内直接移植和静脉移植,缺血区均可见标记细胞。同时最新研究表明,SPIO标记的神经前体细胞移植入缺血大鼠脑内后,移植细胞特异地向缺血组织边缘迁移,并参与缺血边缘新生血管的生成,MR成像发现局部脑血流量(CBF)和脑血容量(CBV)均升高。

[10]

2.与传统检测移植干细胞方法的比较:

[7]

[6]

1.胎鼠神经干细胞的体外增殖:接种到培养瓶

中的细胞以单细胞的方式悬浮生长,接种后24～

48h,显微镜下可见单细胞的比例明显减少,多为数个细胞形成的悬浮微球。使用机械方法将干细胞球分割成体积更小的微球或单个细胞后,进行传代培养。相邻的单个细胞或微球很快地彼此靠拢,单个细胞间形成由几个细胞构成的连接体,微球间则彼此相互融合,形成葫芦形或长椭圆形。传代3次后的神经干细胞可以用于标记和移植。

2.双标记神经干细胞的铁和BrdU染色分析:标记的细胞经普鲁士蓝染色(　×200)后在光学显微镜下观察,胞质内可见大量着色(蓝色)颗粒,分别计数2个小室共8个大方格内所有的着色细胞数,标记率为100%(图1)。未标记的细胞胞质内

中华放射学杂志2006年2月第40卷第2期　ChinJRadiol,February2006,Vol40,No.2・125・

啶、坚固蓝、特异性Y染色体原位杂交、乳酸受体基因标记准备移植的神经干细胞,进而利用免疫组织化学方法监测移植的干细[11,12]胞。这些标记方法虽然具有较高的标记效率,但最大的问题在于无法在活的生物体内显示标记细胞。这不仅不利于在动物实验中动态地显示移植细胞的成活及迁移情况,更限制了细胞移植在临床实践中的应用。因此,建立1种活体显示移植细胞的方法是十分[13,14]

必要的。本研究利用MR成像在活体内连续无创性监测移植的神经干细胞,相关的实验研究也证明SPIO标记的干细胞不影响细胞的功能和分化能力,且移植受体的肝肾器官功能和血液造血系统不受影响,这对于神经干细胞的临床实验研究具有重要的意义。

3.不同移植部位的选择:本实验选取2个移植部位,即同侧和对侧尾状核,移植同侧尾状核的干细胞先于移植到对侧尾状核的干细胞到达病灶区,且不同移植部位不影响干细胞的迁移能力。本小组目前正在进行脑室和蛛网膜下腔移植的研究,根据MR成像动态观察其迁移路线,这将为临床试验的移植途径的选择提供一定的参考价值。

通过本研究进一步证明,MR成像技术可以用于示踪观察移植

图1　标记细胞普鲁士蓝染色(×200),蓝染的铁颗粒位于胞质内　图2　T2WI,左侧梗死病灶呈高信号,下方线状低信号影为迁移的标记细胞　图3　GRE序列上迁移的细胞呈明显的低信号影　图4　对侧尾状核移植标记的干细胞,迁移干细胞呈低信号影沿胼胝体扇形分布、尖端指向病灶　图5　组织切片的普鲁士蓝染色(×60),沿梗死皮层下可见条带状蓝染的阳性细胞,与图2、3的MRI结果相符　图6　组织切片的BrdU染色(×100),标记的干细胞核显示阳性(棕色),位于病灶边缘　图7　组织切片的普鲁士蓝染色(×40),标记的神经干细胞蓝染沿胼胝体分布,与图结果相符

4MRI结果相符

[15]

入受体脑内的神经干细胞。但是,

尽管目前的动物实验已经取得众多令人满意的成果,却仍然存在着大量的未知领域,需要对其进行更加深入的研究,为下一步临床应用神经干细胞移植治疗多种中枢神经系统疾病打下坚实的基础。

参

考

文

献

图8　组织切片的BrdU染色(×40),标记的神经干细胞核棕染沿胼胝体分布,与图4MRI

监测移植后的神经干细胞是研究干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的关键问题,已进行的动物实验主要是通过以下几种方式,如:活性染料、氚化胸腺嘧

1Daldrup2LinkHE,RudeliusM,OostendorpRA,etal.TargetingofhematopoieticprogenitorcellswithMRcontrastagents.Radiology,

・126・中华放射学杂志2006年2月第40卷第2期　ChinJRadiol,February2006,Vol40,No.2NeurosciRes,2004,76:2322243.

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(收稿日期:2005210214)

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131415(本文编辑:薛爱华)

第7届全国介入放射学学术大会征文通知

　　由中华医学会放射学分会介入学组和中华放射学杂志编委会主办,中国医科大学附属第一医院承办的第7届全国介入放射学学术大会拟定于2006年7月在沈阳市召开。届时我们将邀请国内外著名专家作专题学术报告,同时还将以各种形式进行学术交流,包括继续教育、经验交流、论文展示、展板、特殊病例报告等,以适应不同层次学者的需要。并通过学术交流,增进各相关学科的团结协作,共同促进介入医学的蓬勃发展。因此,欢迎各相关学科的临床医师以及技术和护理人员参加本次会议。

1.征文范围:(1)周围血管疾病的综合介入治疗与疗效

险防范;(6)介入医学学科建设。

3.征文要求:(1)论文未在公开刊物上发表;(2)论著要

求提供800字左右的标准结构式摘要(包括目的、方法、结果、结论四要素)及3000字左右全文各1份;(3)所有稿件一律要求电脑打印并附软盘(Word格式),征文信封务请注明“会议征文”字样;(4)来稿均需写清论文题目,作者姓名、单位、详细地址、邮政编码、联系电话及其他联系方式(电子邮件地址等)。

4.截稿日期:2006年4月30日。

5.投稿请寄:中国医科大学附属第一医院放射科

观察;(2)神经系统疾病的介入治疗与疗效观察;(3)心血管疾病的介入治疗与疗效观察;(4)肿瘤性疾病的介入治疗与疗效观察;(5)非血管管腔疾病的介入治疗(含内镜治疗)与疗效观察;(6)介入医学的学科建设与发展方向。

2.征文内容:(1)介入医学的新理论、新发展;(2)介入

苏洪英、李红;地址:沈阳市和平区南京北街155号,邮政编码:110001;欢迎通过Email投稿,Email地址:cjr.xuke@vip.

163.com;xuke@cmuimaging.com。

6.联系电话:024223252365;传真:024223252365。

(中华放射学杂志编委会

治疗的基础和临床研究,以及经验总结;(3)介入治疗的新技术、新方法及新材料、新器械的应用;(4)介入治疗的方案和规范的探讨;(5)介入病房管理、临床护理及介入治疗风

中华医学会放射学分会介入学组)