[12]发明专利申请公布说明书
[21]申请号200510021729.8
[51]Int.CI.
A61K 31/704 (2006.01)A61K 31/7048 (2006.01)A61K 31/63 (2006.01)A61K 45/06 (2006.01)
[43]公开日2007年3月28日[22]申请日2005.09.23[21]申请号200510021729.8
[71]申请人成都市药友科技发展有限公司
地址610041四川省成都市高新区高朋大道23号[72]发明人唐小海 宋鑫 邱宇
[11]公开号CN 1935146A
[74]专利代理机构成都虹桥专利事务所
代理人李高峡
A61K 36/758 (2006.01)A61K 9/08 (2006.01)A61K 9/10 (2006.01)A61K 9/16 (2006.01)A61K 9/20 (2006.01)A61K 9/48 (2006.01)A61P 43/00 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 1 页
[54]发明名称
一种对抗细胞色素氧化酶P450抑制剂的药物组合物及其用途[57]摘要
本发明提供了一种对抗细胞色素氧化酶P450抑制剂的药物组合物，它是由含有有效量的甘草酸为活性成份，加上药学上可接受的辅料或辅料性成分制备而成的制剂。本发明还提供了该药物组合物的用途。本发明甘草酸作为对抗多种cyp450抑制剂的药物，使cyp450波动减小，从而为药物的联合应用拓宽了道路，为临床提供了一种新的用药选择。
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权 利 要 求 书
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1、一种对抗细胞色素氧化酶P450抑制剂的药物组合物，其特征在于：它是由含有有效量的甘草酸为活性成份，加上药学上可接受的辅料或辅料性成分制备而成的制剂。
2、根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述的药剂每制剂单位含有甘草酸：60～540mg。
3、根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述的药剂每制剂单位含有甘草酸：120～300mg。
4、根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述的药剂每制剂单位含有甘草酸：150mg～210mg。
5、根据权利要求1-4任一项所述的药物组合物，其特征在于：它是含有甘草酸、细胞色素氧化酶P450抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅料性成分制备而成的制剂，甘草酸与细胞色素氧化酶P450抑制剂的重量配比为：甘草酸20～90份、细胞色素氧化酶P450抑制剂30～200份。
6、根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述的细胞色素氧化酶P450抑制剂是：天然药材提取物、化合物。
7、根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述的天然药材提取物是：胡椒碱、肉桂提取物、吴茱萸提取物、小茴香提取物、花椒提取物。 8、根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述的化合物是：伊曲康唑、克拉霉素、红霉素、乙胺碘呋酮、氯西嗪、酮康唑、美托洛尔、甲硝唑、米康唑、去甲替林、口服避孕药、羟保泰松、奋乃静、保泰松、伯氨喹、普萘罗尔、奎尼丁、丙戌酸钠、磺吡酮、磺胺、硫利达嗪、甲氟苄啶或维拉帕米。
9、根据权利要求1-8任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述的制剂是口服制剂。
10、权利要求1所述的药物组合物在制备对抗细胞色素氧化酶P450抑制剂的药物中的用途。
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说 明 书
一种对抗细胞色素氧化酶P450抑制剂的药物组合物及其用途
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技术领域
本发明涉及一种对抗细胞色素氧化酶P450抑制剂的药物组合物，属药物领域。 背景技术
细胞色素氧化酶P450(cyp450)是一类参与内源性和外源性化合物代谢的酶，主要存在于生物体的内质网内，肝脏cyp450酶系统对外源性药物和毒物的代谢有非常重要的意义。这些化合物通过肝细胞中CYP450酶系统的代谢，可由疏水性强的形式转变成为亲水性强，易分泌排泄的形式。还有些外源性化合物也受肝外cyp450酶系统的影响，如胃肠道内cyp450对经口的外源化合物的生物转化有很重要的意义。其活性被抑制可导致多种药物代谢减缓，半衰期延长，为减轻或避免代谢性药物相互作用的发生，最简便易行的方法是合理选用药物，而考虑cyp450酶至关重要。 目前尚未见报道有对抗cyp450抑制剂的药物在临床上的应用。 发明内容
本发明的技术方案是提供了一种对抗细胞色素氧化酶P450抑制剂的药物组合物。 一种对抗细胞色素氧化酶P450(cyp450)抑制剂的药物组合物，它是由含有有效量的甘草酸为活性成份制备而成的制剂。
其中，所述的有效量的甘草酸是：60～540mg。 进一步地，所述的有效量的甘草酸是：120～300mg。 更进一步地，所述的有效量的甘草酸是：150～210mg。
所述的药物组合物是含有甘草酸、细胞色素氧化酶P450抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅料性成分制备而成的制剂，甘草酸与细胞色素氧化酶P450抑制剂的重量配比为：甘草酸20～90份、细胞色素氧化酶P450抑制剂30～200份。 其中，所述的细胞色素氧化酶P450抑制剂是：天然药材提取物、化合物。 进一步地，所述的天然药材提取物是：胡椒碱、肉桂提取物、吴茱萸提取物、小茴香提取物、花椒提取物。
进一步地，所述的化合物是：伊曲康唑、克拉霉素、红霉素、乙胺碘呋酮、氯西嗪、酮康唑、美托洛尔、甲硝唑、米康唑、去甲替林、口服避孕药、羟保泰松、奋乃
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静、保泰松、伯氨喹、普萘罗尔、奎尼丁、丙戌酸钠、磺吡酮、磺胺、硫利达嗪、甲氟苄啶或维拉帕米。
其中，所述的制剂是口服制剂。所述的口服制剂是片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液等药学上常用的口服剂型。
本发明还提供了该药物组合物在制备对抗细胞色素氧化酶P450抑制剂的药物中的用途。
由于cyp450作为一种氧化酶在多种药物的代谢过程中起着十分重要的作用。cyp450的变化可以改变药物固有的半衰期，使药物在体内停留的事件发生改变，当联合用药时，就有可能产生相互作用，影响疗效。本发明甘草酸作为对抗多种cyp450抑制剂的药物，使cyp450波动减小，能保证药物本身药效，且降低药物的副作用，从而为药物的联合应用拓宽了道路，为临床提供了一种新的用药选择。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 附图说明
图1甘草酸对抗胡椒碱抑制cyp450的剂量关系 图2甘草酸对抗胡椒碱抑制cyp450的剂量关系
图3血药浓度-时间曲线(A：胡椒碱+甘草提取物+芍药提取物；B：芍药提取物) 具体实施方式
剂量说明：在一个中药复方中，60kg成人甘草使用量为12g/day(参看中华人民共和国药典)，在制剂中甘草酸实际含量约为0.75％，即90mg。在该剂量下，同时口服给予胡椒碱90mg/day，不对肝药酶产生抑制作用，前述甘草酸有效剂量依据来源于下述动物实验。在大鼠动物实验中所用剂量为等比例人体的10倍，所选取的甘草酸剂量10mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、35mg/kg、50mg/kg、90mg/kg折算成60kg成人每日剂量分别为60mg、120mg、150mg、210mg、300mg、540mg。 实施例1本发明药物的制备
取市售胡椒碱标准品(含胡椒碱98％)30mg分别与市售甘草酸标准品(含甘草酸98％)10mg、20mg、25mg、35mg、50mg、90mg混合，得到胡椒碱与甘草酸纯品
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的混合物。
实施例2本发明药物的制备
取甘草药材用70％乙醇提取浓缩后经大孔吸附树脂精制，得到含甘草酸25％的提取物；取胡椒用95％乙醇提取后经萃取及重结晶精制后得到含胡椒碱80％的提取物.取甘草提取物40g胡椒碱提取物37.5g经混合后，加入微粉硅胶10g，羧甲基淀粉钠10g，预胶化淀粉252.5g，混合均匀，制成1000粒胶囊。每粒含甘草酸10mg，含胡椒碱30mg的胶囊剂。
实施例3本发明药物的制备
取甘草药材用70％乙醇提取浓缩后经大孔吸附树脂精制，得到含甘草酸25％的提取物；取胡椒用95％乙醇提取后经萃取及重结晶精制后得到含胡椒碱80％的提取物。取甘草提取物80g胡椒碱提取物37.5g经混合后，加入微粉硅胶10g，羧甲基淀粉钠10g，预胶化淀粉212.5g，混合均匀，制成1000粒胶囊。每粒含甘草酸20mg，含胡椒碱30mg的胶囊剂。
实施例4本发明药物的制备
取甘草药材用70％乙醇提取浓缩后经大孔吸附树脂精制，得到含甘草酸25％的提取物；取胡椒用95％乙醇提取后经萃取及重结晶精制后得到含胡椒碱80％的提取物。取甘草提取物100g胡椒碱提取物37.5g经混合后，加入微粉硅胶10g，羧甲基淀粉钠10g，预胶化淀粉192.5g，混合均匀，制成1000粒胶囊。每粒含甘草酸25mg，含胡椒碱30mg的胶囊剂。
实施例5本发明药物的制备
取甘草药材用70％乙醇提取浓缩后经大孔吸附树脂精制，得到含甘草酸25％的提取物；取胡椒用95％乙醇提取后经萃取及重结晶精制后得到含胡椒碱80％的提取物。取甘草提取物140g胡椒碱提取物37.5g经混合后，加入微粉硅胶10g，羧甲基淀粉钠10g，预胶化淀粉152.5g，混合均匀，制成1000粒胶囊。每粒含甘草酸35mg，含胡椒碱30mg的胶囊剂。
实施例6本发明药物的制备
取甘草药材用70％乙醇提取浓缩后经大孔吸附树脂精制，得到含甘草酸25％的提取物；取胡椒用95％乙醇提取后经萃取及重结晶精制后得到含胡椒碱80％的提取物。取甘草提取物200g胡椒碱提取物37.5g经混合后，加入微粉硅胶10g，羧甲基淀粉钠10g，预胶化淀粉92.5g，混合均匀，制成1000粒胶囊。每粒含甘草酸50mg，含胡椒碱30mg
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的胶囊剂。
实施例7本发明药物的制备
取甘草药材用70％乙醇提取浓缩后经大孔吸附树脂精制，得到含甘草酸25％的提取物；取胡椒用95％乙醇提取后经萃取及重结晶精制后得到含胡椒碱80％的提取物。取甘草提取物360g胡椒碱提取物37.5g经混合后，加入微粉硅胶10g，羧甲基淀粉钠10g，预胶化淀粉82.5g，混合均匀，制成1000粒胶囊。每粒含甘草酸90mg，含胡椒碱30mg的胶囊剂。
实施例8本发明药物的制备
取芍药和甘草药材用70％乙醇提取浓缩后经大孔吸附树脂精制，得到含芍药苷25％、含甘草酸10％的提取物；取胡椒用95％乙醇提取后经萃取及重结晶精制得到含胡椒碱80％的提取物。取芍药甘草混合提取物140g，胡椒碱提取物12.5g经混合后，加入微粉硅胶10g，羧甲基淀粉钠10g，预胶化淀粉177.5g，混合均匀，制成1000粒胶囊。每粒含芍药苷35mg、含甘草酸14mg，含胡椒碱10mg的胶囊剂。 实施例9本发明药物的制备
取甘草药材用70％乙醇提取浓缩后经大孔吸附树脂精制，得到含甘草酸25％的提取物；取甘草提取物120mg，分别与小茴香提取物45mg，肉桂提取物36mg混合后，溶于3ml双蒸水中制成混合物，加入淀粉，制颗粒、压片，得片剂。 实施例10本发明药物的制备
取甘草药材用70％乙醇提取浓缩后经大孔吸附树脂精制，得到含甘草酸25％的提取物；取甘草提取物120mg，分别与伊曲康唑40mg，克拉霉素100mg、维拉帕米50mg混合后，溶于3ml双蒸水中制成混合物，制备得口服液。
为了更好地描述本发明公开的内容，以下举出了一些实例来进一步说明。 试验例1甘草酸+胡椒碱复方中药对cyp450的影响的实验 1.1试剂和仪器
胡椒碱标准品、甘草酸标准品购自江西本草天工科技有限责任公司；所用试剂均为分析纯，试验用水为双蒸水。996PAD可见紫外检测器为美国Waters公司产品；台式高速冷冻离心机为德国Heraeus公司产品。Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半，体重180-200g。 1.2方法
1.2.1给药剂量与方法
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72只大鼠，随机分成9组，每组雌雄各4只。A组给予胡椒碱30mg/kg，ig；B组给予甘草酸180mg/kg，ig；C、D、E、F、G、H组分别给予胡椒碱30mg/kg+甘草酸10mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、35mg/kg、50mg/kg、90mg/kg，ig；正常对照组给予等量生理盐水。连续给药7天后禁食24h，断颈处死。 1.2.2肝微粒体的制备
处死后的大鼠尽量放血，迅速打开腹腔取出肝脏，用4℃预冷的生理盐水反复冲洗，除净血污，滤纸吸干；肝称重后剪成细小的碎块，加10ml匀浆液(含0.25M蔗糖、0.01M Tris-HCl、1mM EDTA，pH7.4)，在玻璃匀浆器中制成匀浆。匀浆液4℃、9000g离心15min，弃去沉淀，上清夜中缓慢加入50％聚乙二醇至终浓度为8.5％，以10000g离心20min，弃去上清夜，沉淀部分用150mmol/L KCl缓冲液(150mmol/LKCl-10mmol/L Tris-HCl 1mmol/L EDTA，pH7.4)漂洗，再加入聚乙二醇至终浓度为8.5％，重复离心后即得到微粒体组分，用10ml匀浆液悬浮沉淀-70℃冰箱保存。 1.2.3cyp450浓度测定
由于还原型的cyp450与CO结合后在450nm处有最高的吸收峰，根据这一原理应用比较光谱可测定cyp450浓度，并以此作为微粒体含量的指标。方法如下：取微粒体悬液0.5ml，加入0.1M KH2PO4缓冲液(pH7.4含0.1mM EDTA)5.5ml，分装入两个3ml的比色杯中。在两个比色杯中各加入约1mg的连二亚硫酸钠，其中一个作为空白，另一个作为样品通CO(浓H2SO4+HCOOH的气体发生装置)60sec，在分光光度计上400nm-500nm范围进行扫描，以450nm和490nm的吸光差除以消光系数91CM-1mM-1算出P450浓度。 1.2.4统计方法
所有数据采用均数±标准差
的方式表示，P450
浓度用(nmol/ml)表示。 1.3结果
实验结果如表1所示。
表1不同组别大鼠肝微粒体中cyp450含量的测定 组别ABCDEFGH对照
P450含量(nmol/ml)2.734±0.0134.921±0.6103.081±0.4863.921±0.6804.447±0.2374.686±0.7615.124±0.5235.162±0.8254.971±0.631
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实际甘草酸含量对抗胡椒碱抑制肝cyp450的剂量关系如图1.
结果表明，与正常对照组相比，A组肝cyp450含量明显降低，B组肝cyp450含量无明显变化，而C、D、E、F、G、H组其肝P450的含量随甘草酸剂量的增加而增加，说明甘草酸与对抗细胞色素氧化酶P450抑制剂的作用呈量效关系。 1.4小结：说明甘草酸具有对抗胡椒碱对大鼠肝P450抑制的作用。 试验2甘草酸+胡椒碱复方中药对cyp450的影响的实验 2.1试剂和仪器
甘草提取物、芍药提取物由成都药友科技有限公司提供；苯巴比妥钠，上海新亚药业公司生产，批号9501121；胡椒碱购自上海试剂厂；所用试剂均为分析纯，试验用水为双蒸水。996PAD可见紫外检测器为美国Waters公司产品；台式高速冷冻离心机为德国Heraeus公司产品。Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半，体重180-200g。 2.2方法
2.2.1给药剂量与方法
72只大鼠，随机分成9组，每组雌雄各4只。A组给予胡椒碱30mg/kg，i.g.；B组给予甘草提取物120mg/kg，i.g.；C组给予苯巴比妥钠50mg/kg，i.g.；D、E、F、G、H、I组分别给予实例1-6所述胶囊1粒溶于3ml双蒸水中，ig；正常对照组给予等量生理盐水。连续给药7天后禁食24h，断颈处死。 2.2.2肝微粒体的制备
处死后的大鼠尽量放血，迅速打开腹腔取出肝脏，用4℃预冷的生理盐水反复冲洗，除净血污，滤纸吸干；肝称重后剪成细小的碎块，加10ml匀浆液(含0.25M蔗糖、0.01M Tris-HCl、1mM EDTA，pH7.4)，在玻璃匀浆器中制成匀浆。匀浆液4℃、9000g离心15min，弃去沉淀，上清夜中缓慢加入50％聚乙二醇至终浓度为8.5％，以10000g离心20min，弃去上清夜，沉淀部分用150mmol/L KCl缓冲液(150mmol/LKCl-10mmol/L Tris-HCl 1mmol/L EDTA，pH7.4)漂洗，再加入聚乙二醇至终浓度为8.5％，重复离心后即得到微粒体组分，用10ml匀浆液悬浮沉淀-70℃冰箱保存。 2.2.3cyp450浓度测定
由于还原型的cyp450与CO结合后在450nm处有最高的吸收峰，根据这一原理应用比较光谱可测定cyp450浓度，并以此作为微粒体含量的指标。方法如下：取微粒体悬液0.5ml，加入0.1M KH2PO4缓冲液(pH7.4含0.1mM EDTA)5.5ml，分装入两个3ml的比色杯中。在两个比色杯中各加入约1mg的连二亚硫酸钠，其中一个
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作为空白，另一个作为样品通CO(浓H2SO4+HCOOH的气体发生装置)60sec，在分光光度计上400nm-500nm范围进行扫描，以450nm和490nm的吸光差除以消光系数91CM-1mM-1算出P450浓度。 2.2.4统计方法
所有数据采用均数±标准差
的方式表示，P450
浓度用(nmol/ml)表示。 2.3结果
实验结果如表2所示。
表2不同组别大鼠肝微粒体中cyp450含量的测定
组别ABCDEFGHI对照
P450含量(nmol/ml)2.734±0.0134.840±0.09416.620±0.5033.081±0.4863.908±0.7844.215±0.2374.829±0.7525.075±0.3245.052±0.4454.971±0.631
实际甘草酸含量对抗胡椒碱抑制肝cyp450的剂量关系如图2. 结果表明，与正常对照组(4.971±1.631nmol/ml)相比，A组肝cyp450含量(2.734±1.013nmol/ml)明显降低，B组肝cyp450含量(4.840±1.094nmol/ml)无明显变化，C组肝cyp450含量(16.620±3.503nmol/ml)明显升高，而D、E、F、G、H、I组其肝P450的含量随甘草酸剂量的增加而增加。
2.4小结：说明甘草酸具有对抗胡椒碱对大鼠肝P450抑制的作用。 试验例3甘草酸消除温里类中药提取物对cyp450抑制作用的大鼠试验 3.1试剂和仪器
苯巴比妥钠，上海新亚药业公司生产，批号9501121；甘草提取物、芍药提取物、小茴香提取物、肉桂提取物由成都药友科技有限公司提供；聚乙二醇6000购自上海试剂厂；所用试剂均为分析纯，试验用水为双蒸水。996PAD可见紫外检测器为美国Waters公司产品；台式高速冷冻离心机为德国Heraeus公司产品。Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半，体重180-200g。 3.2方法
3.2.1给药剂量与方法
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56只大鼠，随机分成7组，每组雌雄各4只。A组给予甘草提取物120mg/kg，i.g.；B组给予小茴香提取物45mg/kg，i.g.；C组给予肉桂提取物36mg/kg，i.g.；D组给予甘草提取物120mg/kg+肉桂提取物36mg/kg，i.g.；E组给予甘草提取物120mg/kg+小茴香提取物45mg/kg，i.g.；F组给予苯巴比妥钠50mg/kg，i.g.；正常对照组给予等量生理盐水。连续给药7天后禁食24h，断颈处死。 3.2.2肝微粒体的制备
处死后的大鼠尽量放血，迅速打开腹腔取出肝脏，用4℃预冷的生理盐水反复冲洗，除净血污，滤纸吸干；肝称重后剪成细小的碎块，加10ml匀浆液(含0.25M蔗糖、0.01M Tris-HCl、1mM EDTA，pH7.4)，在玻璃匀浆器中制成匀浆。匀浆液4℃、9000g离心15min，弃去沉淀，上清夜中缓慢加入50％聚乙二醇至终浓度为8.5％，以10000g离心20min，弃去上清夜，沉淀部分用150mmol/L KCl缓冲液(150mmol/LKCl-10mmol/L Tris-HCl1mmol/L EDTA，pH7.4)漂洗，再加入聚乙二醇至终浓度为8.5％，重复离心后即得到微粒体组分，用10ml匀浆液悬浮沉淀-70℃冰箱保存。 3.2.3 cyp450浓度测定
由于还原型的cyp450与CO结合后在450nm处有最高的吸收峰，根据这一原理应用比较光谱可测定cyp450浓度，并以此作为微粒体含量的指标。方法如下：取微粒体悬液0.5ml，加入0.1M KH2PO4缓冲液(pH7.4含0.1mM EDTA)5.5ml，分装入两个3ml的比色杯中。在两个比色杯中各加入约1mg的连二亚硫酸钠，其中一个作为空白，另一个作为样品通CO(浓H2SO4+HCOOH的气体发生装置)60sec，在分光光度计上400nm-500nm范围进行扫描，以450nm和490nm的吸光差除以消光系数91CM-1mM-1算出P450浓度。 3.2.4统计方法
所有数据采用均数±标准差
的方式表示，P450
浓度用(nmol/m1)表示。 3.3结果
实验结果如表3所示：
组别ABCDEF对照
P450含量(nmol/ml)4.840±1.0943.235±0.7233.114±0.5744.615±1.2374.408±0.78416.620±3.5034.971±1.63110
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结果表明，与正常对照组(4.971±1.631nmol/ml)相比，B、C组肝cyp450含量(3.235±0.723nmol/ml、3.114±0.574nmol/ml)明显降低，A、D、E组肝cyp450含量(4.840±1.094nmol/ml、4.615±1.237nmol/ml、4.408±0.784nmol/ml)无明显变化，F组肝cyp450含量(16.620±3.503nmol/ml)明显升高。
3.4小结：甘草酸可以对抗温里类中药小茴香、肉桂等引起的肝P450的抑制。 试验例4甘草酸消除化合物对cyp450抑制作用的大鼠试验 4.1试剂和仪器
甘草提取物、芍药提取物由成都药友科技有限公司提供；苯巴比妥钠，上海新亚药业公司生产，批号9501121；伊曲康唑口服液购自比利时杨森制药公司；克拉霉素胶囊剂，125mg/粒，批号970710，由济南军区药剂研究中心提供；盐酸维拉帕米片，购自天津市中央药业有限公司；聚乙二醇6000购自上海试剂厂；所用试剂均为分析纯，试验用水为双蒸水。996PAD可见紫外检测器为美国Waters公司产品；台式高速冷冻离心机为德国Heraeus公司产品。Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半，体重180-200g。 4.2方法
4.2.1给药剂量与方法
56只大鼠，随机分成7组，每组雌雄各4只。A组给予甘草提取物120mg/kg，ig；B组给予伊曲康唑40mg/kg，ig；C组给予克拉霉素100mg/kg，i.g.；D组给予维拉帕米50mg/kg，i.g.；E组给予甘草提取物120mg/kg+维拉帕米50mg/kg，i.g.；F组给予甘草提取物120mg/kg+伊曲康唑40mg/kg，i.g.；G组给予甘草提取物120mg/kg+克拉霉素100mg/kg，i.g.；H组给予苯巴比妥钠50mg/kg，i.g.；正常对照组给予等量生理盐水。连续给药7天后禁食24h，断颈处死。 4.2.2肝微粒体的制备
处死后的大鼠尽量放血，迅速打开腹腔取出肝脏，用4℃预冷的生理盐水反复冲洗，除净血污，滤纸吸干；肝称重后剪成细小的碎块，加10ml匀浆液(含0.25M蔗糖、0.01M Tris-HCl、1mM EDTA，pH7.4)，在玻璃匀浆器中制成匀浆。匀浆液4℃、9000g离心15min，弃去沉淀，上清夜中缓慢加入50％聚乙二醇至终浓度为8.5％，以10000g离心20min，弃去上清夜，沉淀部分用150mmol/L KCl缓冲液(150mmol/LKCl-10mmol/L Tris-HCl 1mmol/L EDTA，pH7.4)漂洗，再加入聚乙二醇至终浓度为8.5％，重复离心后即得到微粒体组分，用10ml匀浆液悬浮沉淀-70℃冰箱保存。 4.2.3 cyp450浓度测定
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由于还原型的cyp450与CO结合后在450nm处有最高的吸收峰，根据这一原理应用比较光谱可测定cyp450浓度，并以此作为微粒体含量的指标。方法如下：取微粒体悬液0.5ml，加入0.1M KH2PO4缓冲液(pH7.4含0.1mM EDTA)5.5ml，分装入两个3ml的比色杯中。在两个比色杯中各加入约1mg的连二亚硫酸钠，其中一个作为空白，另一个作为样品通CO(浓H2SO4+HCOOH的气体发生装置)60sec，在分光光度计上400nm-500nm范围进行扫描，以450nm和490nm的吸光差除以消光系数91CM-1mM-1算出P450浓度。 4.2.4统计方法
所有数据采用均数±标准差
的方式表示，P450浓
度用(nmol/m1)表示。 4.3结果
实验结果如表4所示：
组别ABCDEFGH对照
P450含量(nmol/m1)4.840±1.0942.063±0.2362.698±0.7543.008±0.7845.145±0.2374.875±0.3245.003±0.50716.620±0.5034.971±1.631
结果表明，与正常对照组(4.971±1.631nmol/ml)相比，B、C、D组肝cyp450含量(2.063±0.236、2.698±0.754、3.008±0.784nmol/ml)明显降低，A、E、F、G组肝cyp450含量(4.840±1.094、5.145±0.237、4.875±0.324、5.003±0.507nmol/ml)无明显变化，H组肝cyp450含量(16.620±3.503nmol/ml)明显升高。
4.4小结：说明甘草酸可以消除克拉霉素、维拉帕米、伊曲康唑等化合物对肝药酶P450的抑制作用。
试验例5联合给予胡椒碱和甘草酸后对药物代谢影响 5.1试剂和仪器
芍药提取物；胡椒碱；甘草提取物。所用试剂均为分析纯，试验用水为双蒸水。高效液相色谱仪2690，996PAD可见紫外检测器，Millennium 32数据工作站为美国Waters公司产品；台式高速冷冻离心机为德国Heraeus公司产品。Beagle犬8只，购自四川省医学科学院医学实验动物中心，平均体重9.5kg(8.4～12.0kg)。
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5.2方法
5.2.1给药剂量与方法
Beagle犬于实验前晚禁食过夜，随机分为2组，每组4只。A组给予实例7中所述胶囊1粒；B组给予芍药提取物500mg/kg。将药物溶解于100ml双蒸水中，使用橡皮管插管ig给药。给药后再给温水50ml，观察没有药物从口腔呕出。 5.2.2血浆的制备
给药后分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0h自前肢静脉采血1.5ml，血样本收集于肝素抗凝试管中，于1500rpm离心15min，分离血浆，血浆样品保存于-20℃待测。 5.2.3血浆中药物浓度的测定
取血浆0.5ml，加入乙腈1ml，于涡旋振荡器上混合放置20min，16000rpm离心25min，取上层澄清液体为样品。使用HPLC检测血浆样品中药物的含量，色谱柱为Phenomenex公司Luna C18柱(250mm×4.6mm)，流动相为甲醇-水(30∶70)，体积流量为1ml/min，检测波长230nm，使用外标法峰面积定量。 5.2.4药物动力学参数的计算
采用中国药理学会制订的实用药物动力学计算程序3P87进行数据处理，采用统计矩计算AUC等参数，Cmax与Tmax根据实际血药时间数据读出，得到与药物消除有关的t1/2α和t1/2β，采用t检验进行各组数据之间的统计学差异比较。 5.3结果
A组和B组的各个采样时间点的血药浓度见图3，药物动力学参数见表5。C组和D组药动学参数见表6.
表5 Beagle犬单剂量灌胃A组和B组的药物动力学参数
t
A组B组
1/2α
(hr)t
1/2β
(hr)
两组比较经方差分析：P＜0.05；P＞0.050.8238±0.24
**
0.7320±0.32*
**
4.1582±5.0
**
2.6698±1.6
实验结果显示，各实验组药物与对照组相比，反映分布的t1/2α和反映消除的t1/2β无显著性差异。
5.4小结：说明甘草酸和胡椒碱联合给予后对芍药苷或其它药物的药物动力学不
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产生影响。
试验例6联合给予胡椒碱和甘草酸后对药物代谢影响 6.1仪器和试剂
马来酸多潘立酮片(商品名：多美力通)，规格10mg/片，韩国韩美药品株式会社生产，批号：H10004，；格列吡嗪片，规格5mg/片，珠海联邦制药股份有限公司中由分公司生产，批号030901；利巴韦林片，规格100mg/片，江西南昌济生制药厂生产，批号030308，甘草提取物、胡椒提取物由成都药友科技发展有限公司提供。高效液相色谱仪2690，996PAD可见紫外检测器，Millennium32数据工作站为美国Waters公司产品；台式高速冷冻离心机为德国Heraeus公司产品。 6.2方法
6.2.1给药剂量和方法
健康男性志愿受试者60名，年龄(21±2.8)岁，体重(61±5.2)kg，身高(171±5.3)cm。试验前，经体格检查与血、尿常规，心、肝、肾功能检查均正常。试验前12h吃清淡晚餐后禁食，次日清晨8:00空腹分别给予口服格列吡嗪片10mg，200ml温开水送服；甘草提取物+胡椒提取物+格列吡嗪片；口服利巴韦林片600mg，200ml温开水送服；甘草提取物+胡椒提取物+利巴韦林片；口服多美力通10mg，200ml温开水送服；甘草提取物+胡椒提取物+多美力通。 6.2.2血样采集
于服药前0和服药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24h取肘静脉血4mL，置肝素抗凝管中，于常温下静置0.5～1h后，4000rpm离心6min，上层血浆置-20℃保存待测。
6.2.3血浆中药物浓度的测定
取血浆0.5ml，加入乙腈1ml，于涡旋振荡器上混合放置20min，16000rpm离心25min，取上层澄清液体为样品。使用HPLC检测血浆样品中药物的含量，色谱柱为Phenomenex公司Luna C18柱(250mm×4.6mm)，流动相为甲醇-水(30∶70)，体积流量为1ml/min，检测波长230nm，使用外标法峰面积定量。 6.2.4药物动力学参数的计算
采用中国药理学会制订的实用药物动力学计算程序3P87进行数据处理，Cmax与Tmax根据实际血药时间数据读出，得到与药物消除有关的t1/2ke采用t检验进行各组数据之间的统计学差异比较。
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6.3结果
各组药物消除的半衰期参数见表6。 表6各组的药物动力学参数
t
马来酸多潘立酮
马来酸多潘立酮+胡椒甘草提取物格列吡嗪
格列吡嗪+胡椒甘草提取物利巴韦林
利巴韦林+胡椒甘草提取物
*
**
(hr)
1/2ke
13.2±4.2
**
11.1±4.73.3±0.9
**
3.5±0.522.3±4.2
**
24.1±2.5
两组比较经方差分析：P＜0.05；P＞0.05
实验结果显示，各实验组药物与对照组相比，反映消除的t1/2ke无统计学差异。 6.4小结：说明甘草酸和胡椒碱联合给予后对多种药物的药物动力学不产生影响。 上述试验说明，甘草酸与细胞色素氧化酶P450抑制剂配伍使用，能对抗其它药物对P450的抑制作用，且保持抑制剂本身的药效稳定，该配伍使用为临床提供了一种新的对抗cyp450抑制剂的药物。
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说 明 书 附 图
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