NF-KB与微循环障碍
核因子－KB（nuclear factor-kappa B,NF-KB)•蛋白家族是一种多效性的转录因子，可以与多种基启动子部位的KB位点发生特异性的结合从而促进其转录表达。其受氧化应激、细菌脂多糖，细胞因子等多种刺激而活化后，能调控前炎症性细胞因子、细胞表面受体、转录因子、粘附分子等的生成。而这些刺激因素及其调控的因子与微循环障碍的发生、发展均有着密切的关系。本文就NF-KB的组成结构，•活化调节及与微循环障碍的关系等方面做一综述，以期从一新的角度阐述微循环障碍发生的机制及改善的途径。
1.NF-KB的概述
1.1 NF-KB/Rel蛋白家族及结构
1986年，Sen 等首次从鼠B淋巴细胞核提取物中，发现一种能与免疫球蛋白K轻链基因增强子KB序列(GGGACTTTCC)特异结合，调节其基因表达的核蛋白因子，•称之为NF-KB。
随后大量的研究又陆续发现了NF-KB•家族的其它成员，•其构成亚基分别是NF-•KB1 (P50)、NF-KB2(P52)、P65（RelA）、c-Rel（Rel)、RelB等，因这些亚基的N-末端均崐有约300个氨基酸残基的Rel同源区（rel homology domain ,RHD)•，•故统称为NF-KB/Rel蛋白家族。其RHD内含DNA结合区，二聚体化区和核定位序列，分别具有与DNA KB序列结合、与同源或异源亚基二聚体化以及与NF-KB抑制蛋白（IKB）家族成员相互作用并携带核定位信号（NLS），参与活化的NF-KB由细胞质向细胞核的迅速移动等功能。
又根据结构、功能和合成方式的不同，Rel蛋白分为两类。•一类为P50(•NF-•KB1）和P52(•NF-•KB2），•分别由含有C-末端锚蛋白重复序列（ahkrin ••repeat motif）的前体蛋白p105和p100通过ATP依
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赖蛋白水解过程裂解而形成。该类蛋白含有RHD，但缺乏转录活性区，无独立激活基因转录的功能。另一类为p65(RelA)，Rel（c-Rel),Rel B和果蝇的dorsal、Dif和Relish,它们没有前体，除N端的RHD外，•其C-端有一个或多个转录活性区，具有直接作用转录设备而激活基因转录的功能。
Rel蛋白成员间可形成多种形式的同源或异源二聚体，•如p50/RelA、•p50/p50、RelA/Rel等，但并不是都可构成二聚体，如RelB只能与p50或p52二聚体化，•而不能构成同源二聚体。 Rel间的二聚化作用是其与DNA结合的特性所决定的，因为KB位点为二元对称结构，二聚体中的每一成员只与半个识别序列发生作用。而且不同的NF-KB/Rel•蛋白二聚体具有不同的结合序列（KB位点），因而具有各自的特性。如NF-KB的KB序列为十聚体的5'－GGGRNNYYCC-3'，而p65/c-Rel二聚体的KB序列为十聚体的5'-HGGARNYYCC-3',(H代表A,C或T,R代表嘌呤，Y代表嘧啶）。这样保证了NF-KB/Rel•家族对基因调控的特异性，这种特异性还与细胞类型、亚细胞结构定位、相互作用的IKB•类型及激活的方式等有关。
通常所指的NF-KB的组成为p50/p65异源二聚体，其几乎存在于体内所有细胞，且含量常常最高。除RHD外，其组分p50有很少其它序列，而P65则有250个氨基酸残基的C－未端，内含2-3•个独立的转录活性区，有增强靶基因转录激活的作用，而且p65的另一个重要功能是与IKB成员直接偶然。
其他的同源或异源二聚体的核因子－KB在体内含量极少，但可能对某些特定的启动子有独特和重要的作用。Lehming等报道存在于淋巴细胞中p50同源二聚体能以结构型与DNA链KB序列结合，对转录起抑制作用。讫今为止的体内外实验发现NF-KB/Rel蛋白复合物大多以这样有二种类型存在于胞浆中：同源或异源二聚体与IKB蛋白家族构成的三聚体；Rel蛋白（如p65•）与未裂解的前体（如p105）组成的二聚体。信号转导可诱导IKB•和p105•磷酸化而降解，•从而使NF-KB活化再由胞浆转核而发挥效应。
1.2 IBK家族
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IKB蛋白家族成员有IKBα(MAD-3,pp40)、IKBβ、IKBγ/p105、IKBδ/p100、IKBε、Bcl-3以及果蝇属的Cactus等。•其家族结构特点是均有多个约33•个氨基酸的重复序列，•称为崐SWI6/锚蛋白重复序列，主要参与与Rel蛋白的RHD相互作用。IKB•蛋白主要有以下三个部分构成：1.与蛋白降解有关的N-末端区；2.能与NF-KB•相互作用的内部区（区内含有锚蛋白重复序列）；3.称为PEST的C•－端区，•主要参与“囚禁”NF-KB在细胞浆中。
1.2.1 IKBα，IKBβ 主要与含有p65和c-•Rel•的二聚体具有高亲和力，•与其它Rel蛋白亲和力低，是体内NF-KB（p50-p65)的主要调控抑制蛋白。IKB•α的基因启动子上有KB位点，故其合成也受到NF-KB的调控，因此形成对NF-KB的负反馈调节。IKBβ则无这种机制。这种调节差异可致NF-KB调控的靶基因的表达表现在时间上和水平上的差异。
1.2.2 IKBγ, IKBδ 作为p50和p52蛋白前体的p105和p100，由于在结构上有能与RHD相互作用锚蛋白的重复序列，在功能上有类于NF-KB抑制剂的作用，因此将之归于IKB•家族，•称为p105/IKBγ,p100/IKBδ。例如：p105既含有在N-未端区的p50，又含有3-4•个锚蛋白重复序列的C-未端区，因而它既能掩蔽p65、c-Rel,又可以通过蛋白水解释放出p50。
1.2.3 IKBε,Bcl-3 IKBε主要与p65发生抑制作用，专一性地与p65和c-•Rel结合，与IKBα具有多方面的共同特性。Bcl-3位于胞核，虽然表现出能抑制含有p50•的二聚体，但与p52在DNA上结合后却发挥了转录共激活的功能。
1.3 NF-KB的活化信号转导途径
非活化状态的NF-KB以与IKB聚合的三聚体形式或与前体蛋白聚合的二聚体的形式存在于细胞浆中，在多种因素的刺激作用下，通过多种信号转导途径使IKB磷酸化，再在蛋白水解酶作用下发生降解，从而使NF-KB得以活化而转核发挥其调控作用。•这个过程大致分三部分：
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1.3.1刺激因素的信号转导：多种因素如细胞因子（TNF-α、 IL-1β、IL-2）、病毒（流感病毒、•鼻病毒）、双链ANA、氧化剂、细菌脂多糖、多种抗原及紫外线照射等均是NF-KB活化的刺激信号，能通过多种不同的信号转导途径，由胞外向胞内传递，使NIK（NF-KB-inducing kinase）或活化途径中的其它激酶激活，而致NF-KB的活化。
Cao等提出IL-1的活化途径是：IL-1与胞膜上的IL-1受体（IL-1R）识别结合后，IL-1R胞浆内组份立即与IL-1R辅助蛋白（IL-1R accessory protein,IL-RAcP）联结，IL-1RAcP再聚集活化一种接合体蛋白髓细胞样分化蛋白（Myeloid differentiation protein MyD88）,MyD88再聚集两种丝氨酸/苏氨酸激酶：IL-1受体活化激酶（IL-1 •receptor-•activated •kinase IRAK）•和IRAK2而共同形成受体复合体。IRAK、IRAK2又随后又跟一种接合体分子TNF•受体结合因子6（TNF receptor-associated factor 6,TRAF6）相互作用。TRAF-6使IRKA、IRAK2•与NF-KB诱导激酶（NF-KB-inducing kinase NIK）相联结，NIK被激活。zhang等则通过实验证明，LPS与其受体结合后要通过IL-1的浆内信号介导途径激活NIK.从而活化NF-KB的。而Takeuchi等揭示TNF•激活NIK•是通过TNF•受体、TNF受体结合死亡区•（TNF •reeeptor •associated •death •domain,TRADD）、TRAF2及丝氨酸/苏氨酸激酶RIP的过程。
双链DNA（double-stranded DNA,dsDNA）和佛波酯(PMA)则分别通过dsDNA依赖的蛋白激酶（dsDNA-dependent•protein kinase, PKR）和PKC、丝裂原激活蛋白激酶（MAPK-PP90rsk）来使IKB磷酸化。
1.3.2 IKB的磷酸化及降解
NIK属于丝裂原激活蛋白激酶MAPKKK家族的。NIK活化IKB激酶复合体IKKα、IKKβ, IKKα、IKKβ催化IKB•上Ser32/36磷酸化,•然后IKB•上Lys21/22遍在•蛋白化（ubiquitination）,再遍在蛋白连接酶（ubiquitin conjugation enzymes）作用下与蛋白酶小体（proteasome）连接，•在蛋白酶小
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体作用下IKB降解，NF-KB活化。
1.3.3 NF-KB核转位及调控基因表达。
IKB降解后，暴露NF-KB上的核定位信号，NF-KB迅速发生转核，与调控基因启动子上的KB位点结合，启动基因转录。
2.NF-KB在微循环障碍发生发展中的作用。
NF-KB•活化后能调控一系列基因的表达：如粘附分子家族的细胞间粘附分子－1•（intercellular adhesion nolecule-1,ICAM-1）、•血管细胞粘附分子－1(•vascullar cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、E-•选择素（E-•selectin）•、•p-•选择素（P-selectin）前炎症性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL－2、IL-6，化学趋化因子单核细胞趋化蛋白－1（Monocyte chemoattoactant protein-1,MCP-1）、IL-8•以及一些受体分子IL-2受体、T细胞受体α、β 链，等等。•而这些物质都能直接或间接地作用于微血管内皮细胞或血细胞或者介导它们之间的相互作用，从而导致微循环障碍。
2.1 NF-KB介导的微管内皮细胞的损伤。
2.1.1炎症性浸润引发的损伤 已知ICAM-1基因启动子上有１个基本的NF-KB位点，VCAM-1基因有2个NF-KB位点，E-sel基因有3个NF-KB位点。在TNF、IL-1、LPS•及活性氧作用下，能在30min内使NF-KB活化升高，并且持续很长时间，•然后单独或与其它因子协同作用下，使ICAM-1、VCAM-1、E-sel在2-4小时内表达增加，6-12小时内达到峰值，而且其表达升高与刺激物质呈时间、剂量依赖的方式。不同途径抑制NF-KB•的活化或清除刺激来源后，均能相应地抑制这种活化和表达。ICAM-1、VCAM-1、E-sel能与白细胞表面的配体相应地结合，介导白细胞的贴壁粘附，致白细胞聚集、浸润，从而导致局部炎症的发生，微血管内皮细胞损伤，表现为微血管通透性增加、组织水肿等，微循
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环障碍发生。
••P-sel•又名血小板活化依赖颗料表面膜蛋白（Platelet •activation dependent granule-external membrane,PADGEM或GMP-140），•参与介导内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞的粘附。研究表明在鼠P-sel基因启动子上-218•GGGGGTGACCC(•-207)处有KB位点，TNF-α、LPS刺激下，NF-KB与结合cAMP•反应元件的核因子协同促进P-sel基因的表达，在2h时能检测到这种增高。
NF-KB通过调控IL-8及MCP等化学趋化因子的表达，从而募集大量的单核巨噬细胞、中性粒细胞，引发炎症浸润和损伤。Ping等认为在LPS、TNF-α促进MCP的表达中，p65是必需的Rel家族蛋白，而Stylianon则指出Mcp上的两个KB•位点Ａ1和Ａ2中c-Rel只与A2结合，而且在IL-1刺激MCP表达过程中，出现c-Rel－p65•和(p65)2选择性反式作用于A1、A2位点的现象。
NF-KB还能促进IL-2受体，T细胞受体α、β链的表达，从而介导了IL-2的毒性损伤以及T细胞与内皮细胞粘附，导致内皮细胞受损。
2.1.2 NF-KB活化后促内皮细胞的凋亡，致微血管损伤。
NF-KB的活化能诱导内皮细胞的凋亡，主要有以下几种方面的证据：⑴在许多促调亡基因：C-myc、TNF及IL-1转化酶（IL-1 converting enzyme,ICE）启动子上都发现了KB位点。⑵TNF-α诱导凋亡中出现了NF-KB的伴随活化。⑶胸腺细胞能活化NF-KB而诱导细胞凋亡。⑷通过清除NF-•KB•的诱导物活性氧（reactive oxygen species,ROS）能抑制凋亡的发生。
也有研究表明在恶性肿瘤，变态反应和自身免疫疾病中，NF-KB通过上调凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis,IAP）而抑制瘤细胞等的凋亡，•从而加重了疾病的发生，这可能与Rel家族不同成分及不同的刺激、信号途径有关。
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2.2 NF-KB活化影响凝溶的平动态衡，促微血栓形成。
2.2.1 NF-KB活化促进vWF(von Willebrand Factor)的表达。vWF•是Ⅷ因子的相关因子，它与Ⅷ因子结合，能有效防止Ⅷ在血浆中迅速降解。VWF与Ⅷ结合，组成FⅧ/VWF，一端与血小板糖蛋白Ib结合，另一端与内皮细胞下的胶原纤维连接，介导血小板粘附血管内皮，促进微血栓形成。Keightley报道p50能与VWF•启动子结合，从而影响血液中vWF水平。镰刀型贫血病时高水平的vWF介导镰刀型RBC的聚集及与内皮细胞的粘附，并且促进血小板内皮细胞粘分子（platelet-endothelial •cell adhesion molecule-1,PECAM-1）的磷酸化，抑制NF-KB则明显改善这些指标。
2.2.2 NF-KB调控内皮细胞合成组织因子（Tissue factor），这是一种亲脂性蛋白能作为受体与Ⅶ因子和Ⅶa结合而形成复合物，使IX和X裂解，从而既激活外凝系统又激活内凝系统。IL-1、LPS、TNF均能通过刺激NF-KB促进其的合成，在2h达到峰值，且存在时间，剂量依赖性，已在内毒素血症DIC的发生发展中得到证实。
2.2.3 NF-KB对纤溶的影响 纤溶与抗纤溶在正常情况下维持动态平衡。但纤溶酶原激活抑制物－2（Plasminogen activator inhibitor type-2,PAI-2）启动子上有两个KB位点。TNF-α能刺激NF-KB促PAI-2的表达。Dechend也报道动脉粥样硬化时内皮细胞产生的PAI、组织因子等促凝血蛋白质的升高伴随着NF-KB的活化。而p65•的持续活化则能促进uPA（urokinase-type PA）的表达，因为uPA•启动子上也发现了一个KB位点。NF－KB的活化能紊乱微血管的纤溶系统。
2.3 NF-KB在微循环障碍中的自我调控
2.3.1 NF-KB经细胞外的正反馈调节：NF-KB活化后，可增强TNFα、IL-1•β、IL-2的基因转录，TNF-α、IL-1β、IL－2•产生和释放增多，•进而再次激活NF-KB；同时还可使IL-6、IL-8等这些前炎症因子产生、释放增多，从而导致最初的炎症信号进一步放大，加重机体损伤及微循环障碍，直至DIC
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或死亡。•这种情况多见于脓毒综合征（sepsis syndrome)和急性呼吸窘迫综合征（ARDS)等。但通常这种情况在机体内不是这样无止境无限制的，因为NF-KB有负反馈调节。
2.3.2 NF-KB经细胞内、外的负反馈调节：⑴在胞内NF-KB•活化后除启动炎症介质基因转录外,同时还上调IKBα、Bcl-3以及具有双重功能的p100、p105前体蛋白，这些新增加抑制蛋白,能迅速在核内或核外重新灭活活化的NF-KB。从而终止炎症介质的转录，限制急性炎症反应。其中IKBα的效果最明显,NF-KB在活化后30min就有了IKBα的合成,因而单纯刺激IKBα的磷酸化只能引起短时相的NF-KB的活化。IKBβ的合成不受NF-KB的调控，因此IKBβ磷酸化能引起NF-KB长时相的活化。 故若缺乏IKBα，则易引起广泛的全身性炎症。此外NF-KB的活化也使p50同源二聚体生成增多，此种二聚体不能被IKB有效结合，并缺乏转录激活区。•易位至细胞核后，可与NF-KB竞争性结合KB序列，抑制NF-KB的活性。
⑵在细胞外，LPS、TNF-α和IL-1β能刺激反向调节细胞因子IL-10的产生，IL－10能阻止单核细胞中内毒素诱导的NF-KB的活化，从而限制急性炎症反应，•缓解微循环障碍。
NF-KB能促进Mn SOD（manganese superoxide dismutase ,MnSOD）及iNOS(inducing nitric oxide synthase,iNOS)的表达。MnSOD启动子上有KB位点，LPS、•ROS刺激下，NF-KB和C/EBP、NF-1等共同作用，促进MnSOD的表达，从而清除自由基，抑制NF-KB活化，减少自由基的损伤作用。蛋白酶抑制剂MG341、TLCK能抑制IL-1诱导的iNOS的升高，通过抑制IKB的降解过程。
展望：
微循环障碍广泛发生于临床各种疾病、创伤及某些生理应激情况下,其发生不仅是局部或全身组织器官的损伤的标志,而且持续的微循环障碍更加重了疾病的发生、发展及预后。因此通过抑制NF-KB的激活,从而阻断NF-KB调控的炎症反应，缓解微循环障碍,减轻机体组织的损伤，正日益成为研究的热点。
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当前实验研究从基因治疗、蛋白激酶抑制、免疫抑制及抗氧化几个途径着手来抑制IKB的降解或直接抑制NF-KB的活性,已经取得了一定的突破，并且对糖皮质激素、阿司林、Vc、Ve等的抗炎症、抗氧化损伤机制提出了新的药理认识，指导了临床应用。相信将来能更尽一步弄清NF-KB的活化及调控机制，从而能够实施针对性、•特异性治疗。
NF-kb探针
5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’
3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’
NF-κB一般以同源或异源二聚体形式存在，激活后与靶基因上特定的DNA序列（κB位点，其核心序列为GGGRNNYYCC，R：嘌呤Y：嘧啶N：任意碱基）结合并调节基因转录。只要有这段核心序列就行，无种属差异。
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