萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究
（东北农业大学，生命科学学院，黑龙江省 哈尔滨市 150030）
摘要：
酶是酶是一种生物催化剂，它具有催化剂属性，同是也具有一些无机催化剂所不具有的特性。催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。本实验通过利用淀粉酶水解还原糖，还原糖能使3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕色的3-氨基-5硝基水杨酸。淀粉酶活力与还原糖的量成正比，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成还原糖的量表示酶活力。以淀粉在碘液中显蓝色性质，探究酶活性影响因素，常见的影响因素有：温度 pH 活性剂和抑制剂等。
Abstract:Enzyme is a biological catalyst is an enzyme, the catalyst having the property, the same also
has some inorganic catalysts do not have the characteristics. Proteins catalyze specific chemical reactions,RNA or a composite thereof. Are biological catalysts,by reducing the activation energy of the reaction to accelerate the reaction rate, but does not change the equilibrium reaction. In this study, the use of enzymatic hydrolysis of starch sugar, sugar makes 3,5-dinitrosalicylic acid reduction ,a brown 3-amino-nitro-salicylic acid.Proportional to the amount of amylase activity and reducing sugars,measuring the amount of amylase in starch sugar produced by colorimetry ,a unit mass of the sample at the certain time.
关键词：
淀粉酶 活性 温度 PH 激活剂和抑制剂
引言：
新陈代谢是生命活动的基础，是生命活动最重要的特征。而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化与能量变化，都是在酶催化下进行的。生物的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。酶是细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂，与一般催化剂比较有以下不同点：酶易失活、酶具有很高的催化效率、酶具有高度专一性、酶活性受到调节和控制。而调节和控制又包括调节酶浓度、抑制剂和激活剂的调节等。[1] 按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶和麦芽糖酶四种类型。实验证明，当谷类种子萌发时，两类淀粉酶（α，β型）都存在，淀粉酶总酶
1
活性随种子萌发将升高，有利于淀粉被降解为植物生长发育所需的葡萄糖。许多微生物包括细菌、真菌和酵母都能生产淀粉酶，这些廉价的淀粉酶来源，已广泛应用于食品、医药、饲料和环保等生产实践中。［2］
酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的大小可以在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示。酶催化的反应速率越大，酶的活力越高；反应速率越小，酶的活力zx]越低，所以测定酶的活力就是侧订酶促反应速率。[3]通过两种方法可以进行酶活力的测定，其一测定完成一定量的反应时间，其二测定单位时间内的酶催化的反应量。而本实验所采用的是方法二，测定5min内反应量。酶活力的测定方法有分光光度法、荧光法、同位素测定方法、电化学方法，还有一些适用于个别酶的方法，如旋光法、量气法、量热法和层析法等。本实验采用的是分光光度法。
1 材料与方法
1.1材料
实验材料为小麦。
1.2主要实验仪器及试剂
离心机 分光光度计 容量瓶 研钵 电炉 恒温水浴 离心管 标准麦芽糖溶液（1mg/ml）
3，5-二硝基水杨酸 0.1 mol/l的柠檬酸缓冲液 1% 淀粉溶液等
1.3实验方法
1.3.1麦芽糖标准曲线的制作
取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表13-1加入试剂 管号
麦芽糖标准液/ml
1 0
2 0.4
3 0.8
4 1.2
5 1.6
6 2.0
2
蒸馏水/ml 麦芽糖含量/ml
3,5-二硝基水杨酸/ml 光密度值
2.0 0 2.0 0 1.6 0.4 2.0 0.044 1.2 0.8 2.0 0.101 0.8 1.2 2.0 0.158 0.4 1.6 2.0 0.215 0 2.0 2.0 0.273
摇匀，置沸水浴煮沸5分钟。取出后流水冷却，加蒸馏水定容只20ml. 以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度纵坐标，绘制标准曲线。实验数据的记录如表13-2 麦芽糖含量 光密度值
0 0
0.4 0.044
0.8 0.101
1.2 0.158
1.6 0.215
2 0.273
标准曲线绘制如图13-3
1.3.2淀粉酶粗酶液的提取
称取2g萌发3d的小麦种子，置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆到入刻度试管中，定容至25mL。提取液在室温下放置提取15-20min，每隔数分钟搅动一次，使其充分提取。然后在4000r/min转速下离心10min，将上清液倒入一个干净的试管中，即为淀粉酶粗酶液。［3］
1.3.3酶活力的测定
取3支干净试管，编号，按表13-4加入试剂
3
表13-4
项目 试管号 淀粉酶原液（ml） 钝化-淀粉酶 酶稀释液 (ml)
预保温 PH5.6缓冲液（ml） 0.4mol/LNaoH(ml) 1%淀粉（ml）
保温
0.4mol/L NaoH(ml)
取3支干净试管，编号，按表13-5加入试剂 表13-5 项目
试管号 淀粉酶原液（ml） 钝化-淀粉酶 酶稀释液 (ml)
预保温 PH5.6缓冲液（ml） 0.4mol/LNaoH(ml) 1%淀粉（ml）
保温
0.4mol/L NaoH(ml)
将各试管摇匀，分别取2ml放入25ml刻度管中，再加入2mlDNS试剂混匀沸水浴煮沸5min取出冷却，再用蒸馏水稀释至25ml混匀，在分光光度计上540nm处进行比色，测定光密度值，记录测定结果。 原始数据记录：
编号 α-淀粉酶 总 酶
结果计算：
II-1 0.189 0.245
II-2 0.312 0.404
II-3 0.314 0.413
0
1.0 1.0 4.0 2.0 II-1 0
总淀粉酶活性的测定
II-2 0 1.0 1.0 0 2.0
4.0
II-3 0 1.0 1.0 0 2.0
4.0`
0 0 1.0 4.0 2.0 II-1 1.0
α淀粉酶活性的测定 II-2 1.0 0 1.0 0 2.0
4.0
II-3 1.0 0 1.0 0 2.0
4.0`
置于70℃水浴中15min,冷却
将各试管和淀粉溶液置于40℃水浴中保温10min
在40℃恒温水浴中5min
置于70℃水浴中15min,冷却
将各试管和淀粉溶液置于40℃水浴中保温10min
在40℃恒温水浴中5min
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α-淀粉酶活性=[(2.21-1.32）×25×8]/[1.1×2]=80.9mg/g.min
总酶活性 = [(2.91-1.72）×25×8]/[1.1×2]=216.3mg/g.min
1.3.4淀粉酶学性质的研究
1.3.4.1淀粉粉酶液的制备
称取2g萌发3d的小麦种子(芽长约1cm)，置于研钵中，加少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入刻度试管中，定容至25ml.提取液在室温下放置提取15-20min, 每隔数分钟搅动一次，使其充分提取。然后在4000r/min转速下离心，将上清液倒入一个干净的试管中，即为淀粉酶液。［4］
1.3.4.2温度对淀粉酶活性的影响 取10支试管，编号，按表13-6加入试剂，并记录观察到的结果
表13-6温度对淀粉酶活性的影响
管号
缓冲（PH=5.6） 淀粉溶液/ml 淀粉酶提取/ml 预保温10min 混合
酶促反（10min） 碘液 显色
蓝色
无色
A 1 2.5 - 4℃ A倒入a 4℃
a - - 1
B 1 2.5 -
b - - 1
C 1 2.5 -
c - - 1
D 1 2.5 -
d - - 1
室温 B倒入b 室温
40℃ C倒入c 40℃ 各3滴 无色
沸水浴 D倒入d 沸水浴
无色
1.3.4.3 PH对淀粉酶活性的影响
取三支试管，编号，按表13-7记录观察到的颜色
缓冲液/ml 淀粉溶液/ml 淀粉提取液/ml
表13-7 PH对淀粉酶活性的影响
I II
2（PH=3.0）
2（PH=5.6） 各2.5 各1
摇匀，40℃水浴10min
各3滴
5
III
2（PH=8.0）
酶促反应（10min） 碘液
显色 浅蓝色 无色 浅蓝色
1.3.4.4激活剂和抑制剂对酶活性的影响 取四支试管，编号，按表13-8操作，并记录观察到的颜色
表13-8活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响 I
缓冲液/ml（ph=5.6） NaCL CuSO4 H2O 淀粉溶液 酶提取液 酶促反应 碘液 显色
无色 1 - -
II
各2ml
- 1 - 各2.5ml 各1ml 混匀，40℃10min
各1滴 浅蓝色
III
- - 1
无色
2 实验现象
2.1温度对淀粉酶活性的影响
现象分析：淀粉酶的最适温度是40℃，温度偏高偏低都会影响酶的活性甚至导致酶的失活。致使在一定时间内淀粉的水解，如果淀粉失活这淀粉不水解（例如本实验的100℃的试管）。。在一定温度范围内，淀粉酶的活性随温度的升高而增强，当达到某一温度（40℃左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一温度后，酶的活性随温度的升高而减弱。
6
2.1PH对淀粉酶活性的影响
现象分析：pH=5.6是小麦淀粉酶的最适PH。 PH值是影响酶活的主要因素，通常各种酶只在一定的PH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的PH下所表现的活性不同，其活性最高时的PH称为酶的最适PH值。PH影响酶分子构象的稳定性,影响酶分子极性基团的解离状态,也影响底物的解离。PH值不是酶的特定常数,它可随底物的浓度和种类、酶的纯度、缓冲液的种类和浓度、温度、反应时间长短以及抑制物的作用等而改变。
2.3激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响
现象分析：NaCl中Cl离子为淀粉酶激活剂，Cl离子使淀粉酶活性增强；CuSO4中Cu离子为淀粉酶抑制剂，Cu离子使淀粉酶活性减弱,水对酶活性几乎无影响。
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3 实验结果分析
3.1温度对淀粉酶活性的影响
4℃：酶的活性几乎完全被抑制，淀粉未被水解，加入碘液后呈深蓝色； 室温：酶的活性受到一定的抑制，淀粉被部分水解，加入碘液后呈浅蓝色； 40℃：酶的活性达到相对最大，淀粉完全被水解，加入碘液后接近无色； 沸水浴：酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深蓝色； 由此可以看出40℃是小麦淀粉酶的最适温度。
淀粉酶的最适温度是40℃，温度偏高偏低都会影响酶的活性甚至导致酶的失活。致使在一定时间内淀粉的水解，如果淀粉失活这淀粉不水解（例如本实验的100℃的试管）。。在一定温度范围内，淀粉酶的活性随温度的升高而增强，当达到某一温度（40℃左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一温度后，酶的活性随温度的升高而减弱。［5］
3.2PH对淀粉酶活性的影响
PH=3.0：淀粉酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深蓝色较深 PH=5.6：淀粉酶活性达到相对最大，淀粉被完全水解，加入碘液后呈无色 PH=8.0：酶活性受抑制，淀粉被少量水解，加入碘液后呈蓝色 由此可以看出pH=5.6是小麦淀粉酶的最适PH
pH=5.6是小麦淀粉酶的最适PH。 PH值是影响酶活的主要因素，通常各种酶只在一定的PH
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范围内才表现出活性，同一种酶在不同的PH下所表现的活性不同，其活性最高时的PH称为酶的最适PH值。PH影响酶分子构象的稳定性,影响酶分子极性基团的解离状态,也影响底物的解离。PH值不是酶的特定常数,它可随底物的浓度和种类、酶的纯度、缓冲液的种类和浓度、温度、反应时间长短以及抑制物的作用等而改变。
3.3激活剂与抑制剂对淀粉酶活性的影响
空白对照组：加入碘液后几乎呈无色
加NaCl的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈无色 加CuSO4的溶液：淀粉酶活性降低，淀粉被部分水解，加入碘液后呈深蓝色 由此可以看出NaCl是小麦淀粉酶的激活剂；CuSO4小麦淀粉酶的抑制剂
NaCl中Cl离子为淀粉酶激活剂，Cl离子使淀粉酶活性增强；CuSO4中Cu离子为淀粉酶抑制剂，Cu离子使淀粉酶活性减弱，水对淀粉酶活性几乎无影响，酶的抑制剂分类大致分为可逆抑制和不可逆抑制，酶的抑制剂的研究对生物化学相关实验的开展有着重要意义。
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4 讨论
4.1实验讨论
1、 温度、环境PH值、激活剂、抑制剂是影响酶活性的几个重要因素，研究其中一个因素对酶活性的影响时，要控制其他因素不变（其他因素尽量控制在使酶活性最高的水平上），从而研究这一单一因素对酶活性的影响。通过对淀粉酶活性初步研究得出结论如下：温度、PH、激活剂、抑制剂是影响淀粉酶活性的重要因素。在一定温度范围内，淀粉酶的活性随温度的升高而增强，当达到某一温度（40℃左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一温度后，酶的活性随温度的升高而减弱;在一定PH范围内，酶的活性随PH的升高而升高，当达到某一PH（5.6左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一PH时，酶的活性随PH的升高而降低，直到失去活性；Cl-使酶的活性增强Cu2+使酶活性减弱。通过与他人的实验结果比较发现，该实验容易出现个体偏差。实验耗时长短结果会有偏差。 萌发天数不同的材料，糖化时间不同。春季与冬季测定的结果有较大差异。估计酶的性质可能受多种因素影响。
2、通过对淀粉酶活性初步研究,说明温度、PH、激活剂、抑制剂是影响淀粉酶活性的重要因素。在一定温度范围内，淀粉酶的活性随温度的升高而增强，当达到某一温度（40℃左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一温度后，酶的活性随温度的升高而减弱;在一定PH范围内，酶的活性随PH的升高而升高，当达到某一PH（5.6左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一PH时，酶的活性随PH的升高而降低，直到失去活性；Cl-使酶的活性增强Cu2+使酶活性减弱[3]。
3、研究酶有重要的意义。生物体内的各种代谢变化都是由酶驱动的,酶有两种功能:其一,催化各种生化反应,是生物催化剂;其二,调节和控制代谢的速度、方向和途径,是新陈代谢的调节元件。酶对细胞代谢的调节主要有两种方式:一是通过激活或抑制以改变细胞内已有酶分子的催化活性;另一种是通过影响酶分子的合成和降解,以改变酶分子的含量。这种酶水平的调节机制是代谢的最关键的调节[4]
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。现代酶学正向着两个方向发展：酶的分子生物学和酶工程学，它们是现代生物技术的重要组成部分，应用范围包括医药，食品，化学工业，诊断分析和生物传感器，涉及的品种不少，如淀粉酶，其市场需求生产规模和产值均很乐观，并已产生巨大经济效益[5]。
4、对于酶活力测定的方法有很多,比如测定酶活性的凝胶扩散法和组织印渍法[3],该法建立了改良凝胶扩散法和组织印渍法检测α-淀粉酶活性的方法,此法的实验条件容易控制,重复性好。组织印渍法在玉米种子吸水约5h后即可检测到α-淀粉酶活性; 再如2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷作底物直接测定α-淀粉酶法,该法用新底物2－氯－4－硝基苯－α－半乳糖－麦芽糖苷（Gal－G2－α－CNP）直接测定α－淀粉酶，不需要辅助酶，延滞时间短（＜15s），线性范围宽（可达2200U／L），试剂稳定性好，不使用KSCN、NaN3等激活剂，不受内源性葡萄糖苷酶的干扰，与EPS法对比相关良好[6]。
5、我组由于实验时所得结果不理想，故补做一次实验。在实验温度对酶活性的影响时，我们通过严格的操作，得到了正确结果。但因考虑到淀粉在常温下不易溶于水，且在40摄氏度时仍无法混合均匀，所以我组进行了改进。第一，采用“小份法”，每支试管中放入0.25g淀粉，然后量取1ml 40摄氏度的蒸馏水，摇匀，其他步骤同原实验。这样避免了吸取淀粉时由于淀粉溶解不均匀而导致各试管淀粉含量不一，现象有误差。第二，因为我们第一次做此实验时发现：4摄氏度下的试管中淀粉多沉淀在底部，且无法摇匀并完全倾倒出来，故我们将含酶溶液导入含淀粉的试管，保证淀粉无损失。最后得到的效果十分明显。
[参考文献]
[1]王林嵩．生物化学实验技术[M]．北京：科学出版社，2001，29—32．
[2]刘春莉,张文学,江孝明,杨瑞.新型耐酸性液化糖化酶的分离提取及其特性 [J];酿酒; 2003年03期
[3]胡琼英，狄洌等．生物化学实验[M]．北京：化学工业出版社，2007，24—26 [4]王镜岩，朱圣庚，徐长法. 生物化学（下）. 北京：高等教育出版社，2002，543 [5] 罗贯民，曹淑桂等．酶工程[M]．北京：中国农业出版社，2000，1—4． [6] 李勇. 2-氯-4-硝基苯-D-葡萄糖苷合成方法的研究[D]南京理工大学 , 2004
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