1 乳酸菌代替抗生素在水产养殖上的应用_张家国

◎文 张家国1 刘翠玲1，2

1.国家农产品现代物流工程技术研究中心 250103 2.上海海洋大学水产与生命学院 201306

一、乳酸菌代替抗生素在水产上的应用

据中国冷链物流网报道：2013年，我国的水产养殖总量占世界60%以上，水产品连续13年位居国内大宗农产品出口首位，出口额占我国农产品出口总额比重达到30%。但是伴随而来的环境问题、水产品质量安全问题却日益突出，究其原因主要是落后的水产养殖管理模式、专业的水产养殖知识的普及率低以及安全无污染的水产用药开发的滞后，这与水产养殖业的快速发展不相协调，因此，形成水质变坏、产品质量下降、抗生素滥用、药物残留、产品质量下降的恶性循环。而安全无残留的益生菌制剂的应运而生便给我们水产养殖业的可持续发展带来了福音。乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用可发酵糖产生乳酸的细菌的总称，是目前应用最为广泛的益生菌，为动物和人的胃肠道中的优势菌群，在鱼的肠道中也是正常的菌群成员，以乳酸菌属和双歧杆菌属的益生效果最好。一方面可以作为水质改良剂泼洒到水体中起到净化水质的效果；另一方面，由于其较好的定植能力，可以通过其自身的生长繁殖及代谢，降低肠道pH值，抑制有害菌的生长，起到改善胃肠道环境的作用，对水产动物疾病的预防和治疗以及免疫力的提高有一定的效果。1.乳酸菌代替抗生素在水质改良上的应用（1）集约化养殖的水环境现状随着集约化养殖模式的发展，抗生素作为抗菌促生长的药物广泛地应用于水产养殖业，并且对水产动物的健康和快速生长做出了巨大的贡献，它们有的是先经过消化吸收后以代谢物的形式排出，而大多数还是以原型排出，这样，在水产动物的频繁使用就会造成水环境的污染，并且长此以往，还会对以这些水赖以生存的人和动物构成潜在的威胁。梁惜梅等调查了珠江口典型水产养殖区除β-内酰胺类的四大类抗生素的污染特征后发现：喹诺酮类>四环素类>大环内酯类的抗生素，磺胺类未检出。并且沉积物中的抗生素的检出率和种类均比水中要高，这说明以粪便形式排出的抗生素会慢慢的在沉积物中积累，然后再逐渐释放的水中，从而造成水环境的污染。（2）乳酸菌净化水质的机理及效果以饲料形式投喂的乳酸菌一部分可以在肠道内定植，而大部分则通过粪便排泄到水中，从而使水体中的乳酸菌的数量升高成为优势菌，一方面可通过竞争性抑制作用明显抑制肠道和水体中的弧菌，另一方面还可通过直接的化学作用和间接的促进微生物的反硝化作用消除水体中的亚硝酸盐，起到净化水质的效果。例如，武鹏等用免疫增强剂（乳酸菌、芽孢杆菌为主）、复合芽孢杆菌和EM菌（不含乳酸菌）饲喂刺参幼参，结果表明，三种微生态制剂虽不能完全消除水体中粪便和残饵，但是均可降解铵态氮和亚硝态氮，其中免疫增强剂组最差，但是对生长的促进效果最好。另外，乳酸菌也可作为水质改良剂直接泼洒到水体中，盖建军等试验表明：乳酸菌对降低水体中的亚硝态氮有很好的效果，但是对其它水质指标改善效果较差，而以乳酸菌、芽孢杆菌和光合细菌为主的EM菌则对水体中的溶氧、pH值、氨氮、亚硝态氮都具有较好的调控效果。因此，乳酸菌泼洒到水中虽然具有一定的水质改良效果，但是单独使用效果并不理想，所以要根据生产实际情况，选择合适的菌种，或者直接使用EM菌可以达到全方位的效果。2.乳酸菌代替抗生素在治疗水产动物疾病方面上的应用

乳酸菌作为目前最广泛应用的一类益生菌，在肠道中定植后，可通过自身的生长，繁殖及其代谢产物改善水产动物的胃肠道环境。而肠炎，是水产养662014年第7期│责任编辑 李振龙│技术交流殖整个过程中都会随时爆发的疾病，其致病菌为肠型点状气单胞菌和温和气单胞菌，此外，弧菌也是海水养殖动物的主要病原菌，存在于水体和肠道中，为条件致病菌，而养殖户为了避免疾病爆发，便会在饲料中添加抗生素，而低剂量长期服用含抗生素的饲料，一方面会使肠道菌群失调加重肠炎，更有可能产生耐药菌株，造成抗生素的失效，使治疗情况更加艰难，有研究显示乳酸菌就对肠道细菌如气单胞菌引起的肠炎和腹泻具有一定的预防和保护作用。而乳酸菌调节肠道菌群的能力取决于其在肠道中的定植能力、定植位点以及定植后的代谢产物。（1）乳酸菌在肠道中的定植能力关于细菌定植能力，一方面取决于细菌细胞和肠粘膜的亲和力，另一方面和环境中是否存在该菌及其数量也有关系。有研究显示，乳酸菌可以通过脂磷壁酸以及菌体分泌的表面蛋白对肠道粘膜细胞产生强大的粘附作用，例如，靳彩娟研究了47株不同来源的乳酸菌对小鼠巨噬细胞、脾脏细胞、肠上皮细胞及肠黏液的黏附能力以及和其表面疏水性、自凝聚、致病菌共凝聚能力及体外抑菌作用的关系，结果表明，乳酸菌对不同细胞的黏附具有选择性，并且黏附能力越高的菌，其表面疏水率也越大，自凝聚和致病菌共凝聚能力也越高，电镜下也显示菌株细胞表面粗糙，对副溶血型弧菌的凝聚与沉降作用也越高。而且较强的黏附能力可以延长乳酸菌在肠道中的停留时间，因此，在生产实践中，可以通过显微镜下观察菌株表面光滑或粗糙来作为其黏附能力强弱的初步判断标准，减少菌株筛选的工作量。此外，有研究认为，用缓冲液冲洗鸡、猪肠道表皮4次，肠壁上还残留很高的乳酸菌数，因此，这也为筛选黏附性能较好的益生乳酸菌提供了便利。另外，刚孵化的鱼的胃肠道是无菌的，但当跟环境和饲料接触后，一些能够适应鱼类胃肠道的微生物便陆续定植，有研究显示，在饲料中添加乳酸菌或泼洒到水中，可以显著影响其肠道定植菌群，而且乳酸菌是肠道菌群的正常组成成分，因此，在此期间可以在饲料或水中添加筛选好的定植能力较强的乳酸菌，使其在肠道中迅速定植并成为优势菌，从而改变肠道菌群的发展趋势。（2）乳酸菌在肠道中的定植位点乳酸菌益生效应的高低取决于其定植位点是否与致病菌的黏附受体相同或相近，否则难以发挥效应。一般认为，双歧杆菌是通过磷壁酸与粘膜上皮细胞结合而占据肠粘膜表面的，而乳杆菌属的多数菌则通过其表层蛋白，介导菌体与宿主的粘附，而且双歧杆菌和乳杆菌在体内还能产生胞外糖苷酶，降解肠道细胞壁上复杂的多糖成分，从而减少肠粘膜上病原菌的受体，降低病原菌的定殖和入侵。有研究显示，乳酸杆菌Barl 3具有很强的定植能力，并且能将68%的大肠杆菌H10407和90%的猪霍乱沙门氏菌从定植部位移除，王福强等研究表明，从牙鲆肠道分离的两种乳杆菌均能在肠道定植，并且可以明显抑制小肠部位的弧菌的繁殖，陈营等也有相似发现。夏磊等研究显示，复合乳酸菌对肠型点状气单胞菌感染引起的肠炎具有一定的治疗效果，能推迟发病时间及减少死亡数量，但是效果并不明显。但也有研究证明，饲料中添加益生菌对斑节对虾肠道中弧菌数量影响并不显著，因此，益生菌的抑菌能力可能与水产动物的种类有关系，并且从以上研究来看，乳酸菌虽然对肠炎疾病的治疗具有一定的效果，但不能作为疾病爆发时的首选。因此在养殖过程中，一定要提高水产动物的免疫力，并且做好疾病的防治工作。（3）乳酸菌代谢产物对肠道菌群的影响①水产动物肠道菌群的分布及关系研究显示，同种鱼的肠道菌落分布为前肠段小于中肠段和后肠段，同一肠段的厌氧菌数量高于需氧菌，一般相差2～3个数量级，而不同种鱼各对应肠段的好氧菌数量相差很大，厌氧菌总数却相差不大，并且淡水鱼肠道内专性厌氧菌以A、B型Bacteroides(拟杆菌属)等为主，好氧和兼性厌氧细菌以Aeromonas（气单胞菌属）、Enterobacteriaceae(肠杆菌属)等为主，而海水鱼肠道菌群相对简单，主要以弧菌为主。正常的肠道菌群能够为动物的生长、消化和免疫起到促进作用。有研究显示，若增加动物肠道厌氧菌、双歧杆菌和乳酸杆菌含量，减少好氧菌、产气荚膜梭菌含量能促进动物的生长发育，起到抗病防病之作用。②乳酸菌代谢物对肠道菌群的调节机制及效果乳酸菌在肠道定植后，一方面可以竞争性的利用肠道中的可溶性碳水化合物合成大量的有机酸和细菌素等物质，从而降低了肠道pH值，刺激肠道蠕动，加速病原菌的外排，也抑制了大肠杆菌、沙门菌、梭菌等有害菌的繁殖，并且由于其兼性厌氧的特性还能消耗肠道中的氧气，从而抑制有害需氧菌的繁殖，起到调节肠道菌群的作用。例如，杨莺莺等用乳酸菌发酵液及其上清液探索乳酸菌及其代谢产物对两种弧菌的抑制效果发现，它们具有协同抑制效果，并且对不同菌的抑制效果也不一样。杨勇和窦晓明等的研究也证明，乳酸菌代谢产物和胞外产物对鳗弧菌和副溶血弧菌都具有较强的抑制作用。刘小玲等用含有不同浓度的嗜酸乳酸菌的饲料饲喂罗非鱼后发现肠道中大肠杆菌的数量得到明显的抑制。陈营等用菌液和冻干菌2014年第7期67技术交流│责任编辑 李振龙│粉饲养牙鲆稚鱼30天后，乳酸菌在肠道内数量达到稳定并在肠道内定植，而且由于乳酸菌的定植，肠道中的弧菌数量明显减少。因此，投喂含乳酸菌的饲料可以起到调节机体肠道菌群，保证肠道的微生态平衡的作用。3.乳酸菌对水产动物免疫的影响鱼类虽为低等脊椎动物，但已具备了免疫的基本特质，其免疫应答器官与组织主要包括前肾、脾脏、胸腺以及消化道淋巴组织与血液淋巴等，其免疫调节机制包括吞噬细胞、补体、干扰素和溶菌酶等的非特异性免疫以及以抗体为主的体液免疫和以T细胞为主的细胞免疫的特异性免疫，还具有以黏膜反应免疫为主的局部免疫，并且相对于高等脊椎动物，鱼类更依赖于非特异性免疫调节。而甲壳动物也是以非特异性免疫为主，并无特异性免疫。乳酸菌的免疫调节功能主要是通过加强动物肠黏膜屏障功能及其免疫功能发挥作用。Ouwehand等认为益生素对免疫系统刺激作用的可能途径是抗原性物质以其代谢物小分子的形式直接进入淋巴组织或自身细胞通过胞饮作用进入淋巴组织后，经抗原呈递细胞处理或直接交给淋巴细胞，从而产生相应的免疫应答。一方面乳酸菌可以刺激黏膜表面和血清中IgA、IgM、IgG水平，增强体液免疫，还可促进 T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，加强细胞免疫，也能增强单核吞噬细胞、多形核白细胞的活力，刺激活性氧、溶酶体酶和单核因子的分泌，加强非特异性免疫反应。例如，张日俊等用含乳酸菌的复合微生态制剂的饲料饲喂仔鸡，结果发现其可刺激仔鸡胸腺、脾脏和法氏囊明显发育，并且增强T、B淋巴细胞的活性。王国霞等研究证明，在饲料中添加嗜酸乳酸菌能显著性影响血清中的溶菌酶和过氧化氢酶，并可提高SOD和酚氧化酶的活性，刘小玲等也有相似发现。Son等和廖志勇等均发现，植物乳杆菌不仅可以提高石斑鱼血清溶菌酶活性，还可显著提高巨噬细胞的活性、吞噬指数及头肾白细胞的爆发性呼吸力。另外，管魁等研究发现，乳酸菌的代谢产物对刺参幼体的体腔细胞数量、吞噬活性以及免疫酶活性等免疫指标的促进效果和乳酸菌相似。近几年，肠球菌属的乳酸菌，主要是屎肠球菌和粪肠球菌越来越多地运用到动物生产试验中。1984年美国食品和药品管理局（FDA）及美国饲料监察协会（AAFCO）已经允许屎肠球菌和粪肠球菌作为饲料安全菌种使用，我国《饲料添加剂品种目录（2008）》也包括这２种菌。马如龙从70天石斑鱼的肠道中筛选了5株益生菌，其中包括两株芽孢杆菌、一株嗜冷杆菌、一株乳酸乳球菌和一株屎肠球菌，并且研究发现，屎肠球菌对5种石斑鱼潜在致病菌的体外抑制效果最好，对生长没有促进作用，但可以降低饵料系数。曾东筛选了具有一定耐热性并对致病性大肠杆菌和嗜水气单胞菌具有拮抗作用的5株细菌，其中包括2株芽孢杆菌、2株肠球菌(Enteroeoceus)(EZ、LZ)和l株柠檬酸杆菌(citrobacter)(D2)，拟作为鲤益生菌的候选菌株。结果显示，来源于鱼的肠球菌在肠道中黏附效果最好，而养殖试验的效果并不好，考虑原因可能由于在制粒过程中损失较大，饲料中活菌数下降所致，所以在以后的生产中可以采用包被肠球菌来实现其益生促生长之效果。二、在生产中应用乳酸菌产生的问题与对策

虽然乳酸菌的益生效果较好，但是当停止投喂含乳酸菌的饲料或者在水中停止泼洒后，鱼肠道或养殖池中的乳酸菌数量就会显著减少，而益生菌在水产动物消化道内的定植研究结果表明，益生菌可在小肠内定植2～65天不等。王福强等发现在停喂7天后的牙鲆的各段消化道中乳酸菌的数量出现不同程度的下降，但均高于试验初始值。因此，在生产中我们应当根据其消耗规律定期不间断的投入，从而防止停止添加后水体和肠道中菌量的减少甚至失效，以便稳定其益生优势。此外，由于大多数乳酸不能产生芽孢，不耐氧、不耐热，抗逆性差，不利于饲料的加工和保存，因此，要想更好的服务于水产养殖业，必须开发或筛选抗逆性强的菌种。研究显示，对乳酸菌进行微胶囊化包被后也可以显著提高乳酸菌的抵抗力，目前，常用的方法主要包括相分离法、界面聚合法、挤压法和喷雾干燥法。其次，乳酸芽孢杆菌是一种能产生芽孢的乳酸菌，曹要玲等研究发现，其所用的芽孢乳酸菌能够在80℃水浴10分钟后能耐受pH1.5～4.0的强酸环境，在5g/L～50g/L的NaCL浓度的渗透压及模拟肠道溶液的环境下生长良好。慈丽宁等用含乳酸芽孢杆菌的饲料饲喂团头鲂8周，结果显示，试验组的生长和免疫指标均高于对照组，因此，乳酸芽孢杆菌可以弥补乳酸菌的缺点，更广泛的应用于水产养殖业。三、乳酸菌在水产养殖中的应用前景

随着科技的发展，乳酸菌已经越来越多的应用到水产养殖业，但是相对于应用于陆生动物而言，由于水产动物种类、大小的复杂性，其益生机理性研究还不透彻，还需要不断的深入研究。另外，考虑到单独使用一种益生菌的缺陷，可以配合芽孢杆菌、光合细菌和硝化细菌等有益菌一起使用，起到相辅相成的效果。相信在研究人员的共同努力下，乳酸菌将能更科学、更规范的代替抗生素应用于水产养殖业以及获得更加广阔的发展前景。682014年第7期