第36卷 第1期2010年1月吉 林 大 学 学 报 (医 学 版)JournalofJilinUniversity(MedicineEdition)Vol.36No.1 Jan.2010
[文章编号] 16712587Ⅹ(2010)0120040205
大肠杆菌β2半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定
许淑芬,刘 磊,孙牧男,赵 帅,方艳秋,谭 岩
(吉林大学第一医院中心实验室,吉林长春130021)
β[摘 要] 目的:制备大肠杆菌β2半乳糖苷酶(2galactosidae)酶供体(ED)和酶受体(EA)片段,获得具β有全酶活性的β2半乳糖苷酶。方法:以pSV22galactosidasecontrolvector为模板设计引物,用PCR方法获得
ED和EA片段DNA序列,插入克隆载体pGEM2T2easy中,获得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,
将酶切目的片段分别插入原核表达载体pET20b+,并转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导表达出ED、EA融合蛋白,以亲和层析纯化蛋白,通过ED与EA蛋白形成β2半乳糖苷酶、全酶活性试验来判断ED、EA的功能。β结果:获得与pSV22galactosidasecontrolvector一致的ED、EA碱基序列,构建了重组表达质粒pET20b2ED及
pET20b2EA,并分别转化入大肠杆菌DE3,以IPTG诱导行SDS2PAGE电泳,在相对分子质量为14000及116000处分别可见ED蛋白和EA蛋白条带,应用镍凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。结论:成功地制备了ED、EA蛋白,形成全酶活性的β2半乳糖苷酶。
β[关键词] 2半乳糖苷酶;酶受体;酶供体;免疫测定
[中图分类号] R69613;Q78 [文献标志码] ACloning,expressionandactivityassayof
ED/EAofβ2galactosidaseinE1coli
XUShu2fen,LIULei,SUNMu2nan,ZHAOShuai,FANGYan2qiu,TANYan(CentralLaboratory,FirstHospital,JilinUniversity,Changchun130021,China)
Abstract:Objective Toobtainrecombinantenzymedonor(ED)andenzymeacceptor(EA)fragmentsof
β2galactosidaseinE1coliandestablishnewclonedenzymedonorimmunoassays(CEDIA)forclinicaluse1βMethods TheencodingsequencesofEDandEAfragmentswereamplifiedwithpSV22galactosidasecontrolvector
astemplateandinsertedintopGEM2Teasyvector,thetargetgenewaschosenbydoubledigestion,PCRandsequencing,thenEDandEAfragmentswereinsertedintotheexpressionvectorpET20b+1ThecompetentcellsofhoststrainofBL21weretransformedbytherecombinantplasmid.TheexpressionofthetargetproteinwasinducedwithIPTGandpurifiedbyNi2+2NTAagarosecolumn.Theβ2galactosidaewithactivityisformed.Results The
βclonedfragmentsofEDandEAwere100%consistentwiththatofpSV22galactosidasecontrolvector.The
expressionvectorpET20b2EDandpET20b2EAwereconstructedandexpressed.ThetargetproteinwaspurifiedbyNi2+2NTAagarosecolumn.Theexpressedfusion2proteinEDfragmentwas14000andEAfragmentwas116000inSDS2PAGEasexpected.Conclusion EDandEAproteinsarepreparedsuccessfullyandβ2galactosidasewithactivityisformed.
Keywords:β2galactosidase;enzymeacceptor;enzymedonor;immunoassay
[收稿日期] 2009210228
[基金项目] 吉林省科技厅重点项目资助课题(2006041721,2008043521);吉林省长春市科技局计划项目资助课题(长
科技合2008254号,08YJ37)
[作者简介] 许淑芬(1963-),女,吉林省长春市人,副主任技师,主要从事免疫与分子生物学实验技术的研究。[通信作者] 谭 岩(Tel:0431285668196,E2mail:tanyan49@hotmail1com)
许淑芬,等1 大肠杆菌β2半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定
41
美国学者[122]对β2半乳糖苷酶(β2
galactosidase)的结构及α2互补特性进行了很多的基础性研究,其中α2受体和α2供体是CNBr2及M15蛋白。此后有学者提出的酶供体(enzymedonor,ED)、和酶受体(enzymeacceptur,EA)
45s,55℃退火45s,72℃延伸1min,30个循环;72℃终延伸10min。以P3、P4引物扩增EA片
蛋白对都是在此基础上设计的。Henderson等[3]在
1986年利用基因工程技术生产大肠杆菌β2半乳糖苷酶EA和ED,并利用其α2互补功能创立了克隆ED免疫分析技术。大肠杆菌β2半乳糖苷酶(E1C131211123)是由4个相同亚基组成的四聚
段,PCR参数:94℃预变性5min;94℃变性
90s,55℃退火90s,72℃延伸2min,30个循环;72℃终延伸15min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并分别回收PCR产物,将纯化后的PCR产物克隆至pGEM2T2easy载体,获得克隆质粒pGEM2T2ED
体。每一个亚基可分成大小2个片段,大片段被称为EA,小片段被称为ED。每种片段在分开时没有酶活性,但当两者在一起时就可以形成β2半乳糖
β苷酶亚基,进而聚合成具有酶活性的四聚体。2半
乳糖苷酶的EA、ED这种α2互补性己被广泛用于分子生物学研究、蛋白质与蛋白质相互作用的研究、克隆ED均相免疫分析技术等[326]。本实验室在上述研究的基础上,制备了EA、ED蛋白,并在体外获得了β2半乳糖苷酶全酶活性,为进一步开展克隆酶供体免疫测定(clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA)技术检测小分子蛋白研究提供实验基础。1 材料与方法
和pGEM2T2EA,分别转化大肠杆菌感受态细菌
JM109,经过蓝白筛选、酶切鉴定、PCR鉴定初筛阳性克隆菌株,委托大连宝生物工程公司测序。114 重组表达载体的构建 将测序正确的重组克隆质粒和表达质粒pET20+分别进行双酶切和凝胶回收处理,切取的ED、EA片段经T4DNA连接酶插入pET20b+,构建出重组表达质粒pET20b2ED、pET20b2EA,将重组表达质粒转化大肠杆菌DE3感受态细胞,经抗生素耐药性筛选、酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性克隆。115 ED和EA菌株的诱导表达 阳性克隆菌接种于LB固体培养基,挑选4个重组菌单菌落分别接种于2mLLB液体培养基,37℃、60r・min-1振摇过夜,次日以1∶50接种于2mLLB液体培养基中,37℃、230r・min-1振荡培养至A600值为016时,加入终浓度为1mmol・L-1的IPTG诱导
α(本室111 主要材料 大肠杆菌JM109、DH5保存),原核表达质粒pET20b+(TransGen
Biotech公司),AMV、pGEM2T2easy载体(promega公司,美国),限制性核酸内切酶NocⅠ、SalⅠ、T4DNA连接酶(Takara公司),Trizol试剂(Ivitrogen公司),镍离子亲和层析柱(Ni2+2NTA)
(Qiagen公司),质粒提取试剂盒、
DNA凝胶回收试剂盒(Vitagene公司)。
培养5h,继续培养4h,4℃、12000g离心1min,收集菌体,进行SDS2PAGE电泳。116 ED和EA蛋白纯化 诱导200mL阳性表达菌液,离心收集菌体沉淀,加入超声裂解液,-70℃反复冻融3次,离心上清4℃保存,得到的包涵体用变性裂解缓冲液重悬。分别对裂解上清和包涵体进行SDS2PAGE电泳,经镍凝胶亲和层析法纯化目的蛋白。117 ED和EA形成β2半乳糖苷酶全酶活性测定 采用微量反应板法,总体积为200μL,含011mol・L-1PBS(pH710),1mmol・L-1MgSO4,5mmol・L-1DTT,1g・L-1ONPG,不同浓度的EA/ED蛋白,37℃反应,在不同时间读取A404值。2 结 果
211 ED和EA基因片段的克隆及测序结果 PCR
β112 寡核苷酸引物设计与合成 以PSV22galactosidasecontrolvector为模板设计两对引物:P1,5′2GCCCATGGCCGTAGTTTTACAACG23′;P2,5′2TGTCGACTTAACAACCGTGCATCTG2CCA23′;P3,5′2TAACCATGGATCGCCCTTC2CCAACAATTGCGCAGC23′;P4,5′2CGCGGTC2GACTTATTTTTGACACCACACCAACTGG23′(划线部分为酶切位点)。委托大连宝生物工程公司
合成。
β113 PCR扩增及测序 以pSV22galactosidasecontrolvector为模板,以P1、P2引物扩增ED片
扩增电泳结果见图1(ED约260bp)及图2(EA
β约2940bp),测序结果与PSV22galactosidasecontrolvector比较有98%的同源性,氨基酸无变
段,PCR参数:94℃预变性5min,94℃变性
化。
212 重组表达质粒鉴定 构建出重组表达质粒
42吉林大学学报(医学版) 第36卷 第1期 2010年1月
pET20b2ED和pET20b2EA,将重组表达质粒转化IPTG诱导含重组表达质粒pET20b2ED和pET20b2EA的大肠杆菌DE3,经5h后进行SDS2
PAGE(图5和6),ED片段相对分子质量约为14000,EA片段相对分子质量约为116000。本实
大肠杆菌DE3感受态细胞,药物筛选后经NcoⅠ、SalⅠ双酶切,电泳可见260bp左右ED片段(图3)及2900bp左右EA片段(图4),与目的片段大小一致。
验选购了PET表达载体和大肠杆菌DE3作为目的蛋白的表达系统。pET表达载体中含有一段polB信号肽,可以使所表达的外源蛋白以可溶形式分泌到胞周基质中,给外源蛋白的进一步纯化带来很多方便。经过对冻融上清和包涵体沉淀进行SDS2PAGE电泳,可见ED、EA蛋白主要分泌到冻融上清中。利用重组蛋白所带的6个组氨酸靶与预先处理好的镍凝胶柱中的Ni2+高结合力纯化目的蛋白,SDS2PAGE结果显示:ED蛋白与经计算的有差别,这可能是因为增加了6个组氨酸和1个半胱氨酸,也可能与pET20b+的信号肽有关。
图1 ED片段PCR琼脂糖凝胶电泳
Fig11 AgarosegelelectrophoresisofPCRproductsofED
M:DNAmarkerDL2000+15000;Lane1,2:PCRproductsofED.
图2 EA片段PCR琼脂糖凝胶电泳
Fig12 AgarosegelelectrophoresisofPCRproductsofEA
M:DNAmarkerDL2000+15000;Lane1-3:PCRproductsofEA.
图4 pET20b2EA质粒酶切和PCR鉴定
Fig14 IdentificationofEAbyrestrictionendonucleaseandPCR
LaneM:DNAMarkerDL2000+15000;Lane1,2:DigestionofpET20b2EAvectorwithNcoⅠandSalⅠ;Lane3:PCRproductsbyrecombinantplasmidppET20b2EAasatemplate;Lane4:PCRproductsofEA.
图3 pET20b2ED质粒酶切和PCR鉴定
Fig13 IdentificationendonucleaseandPCR
M:DNAmarkerDL2000+15000;Lane1,2:PCRproductsbyrecombinantplasmidpET20b2EDasatemplate;Lane3:pET20b2EDvectordigestedwithNcoⅠandSalⅠ,Lane4:PCRproductsofED.
ofpET20b2EDbyrestriction
图5 ED蛋白的SDS2PAGE鉴定
Fig15 IdentificationoftheEDproteinbySDS2PAGE
Lane1,2:Supernatantproteinsinthedegeneratesplittingbuffer;Lane3:Precipitationproteinsinthedegeneratesplittingbuffer;Lane4:ProteinsafterbindingwithNi+22NTAagaroseaffinitychromatography;M:Standardproteinmarker;Lane5,6:EDproteinsinthewashingliquidcontaining100mmol・L-1imidazole.
213 重组蛋白的表达和纯化 以1mmol・L-1
许淑芬,等1 大肠杆菌β2半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定
43
214 ED和EA形成β2半乳糖苷酶活性测定结果
采用微量反应板法,以不同稀释度的EA和ED蛋
白作反应物,加入酶底物,建立如下反应:总体积为200μL,含011mol・L-1PBS(pH710),1mmol・L-1MgSO4,5mmol・L-1DTT,1g・L-1ONPG,放入37℃培养箱中,在不同时间读取A404值。ED和EA的浓度越大形成全酶的活性越强,增加反应时间反应更完全。结果见表1。
图6 EA蛋白的SDS2PAGE鉴定
Fig16 IdentificationoftheEAproteinbySDS2PAGE
M:Standardproteinmarker;Lane1-3:Supernatantproteinsinthedegeneratesplittingbuffer;Lane4,5:EAproteinsinthewashingliquidcontaining100mmol・L-1imidazole.
表1 不同浓度ED和EA经37℃孵育30min和45min后A404值的变化Tab11 ThechangesofA404valuesofEDandEAwithdifferentconcentrations30and45minafterincubationat37℃(x±s)
Concentration
30minA404
(EA)1/20
017560.1980.1051/400.3880.0750.065
1/800.2560.1100.058
1/201.4020.7780.378
45minA404
1/400.7690.4100.251
1/800.5930.2700.170
ofED
1/201/401/80
3 讨 论
CEDIA的基本原理[7211]是大肠杆菌β2半乳糖
苷酶由4个相同的亚基组成的四聚体,利用基因工程技术把β2半乳糖苷酶亚基分成大小2个片段EA、ED,EA与ED分开时没有酶活性,但当两
者在一起就能通过α2互补形成β2半乳糖苷酶亚基,进而聚合形成具有全酶活性的四聚体。把待测分子标记到ED上,当有相应的抗体(抗待测分子)存在时,发生抗原抗体反应,该反应导致空间位阻使得酶的装配受阻。待测物与ED标记待测物竞争抗体,产生的酶与游离的待测物含量成正比。通过检测酶活性,从而定量分析待测物。把待测分子标记到ED上通常有2种方法,一种是通过化学藕联,另外一种是在cDNA水平把待测分子的cDNA插到ED的cDNA5′端或3′端。本研究采用了前者,目的是得到有构成活性β2半乳糖苷酶的ED片段,同时在ED的3′端加上一个半胱氨酸,方便连接多种待测物。本研究结果显示:构建的ED片段中半胱氨酸没有影响形成β2半乳糖苷酶活性。
本研究选用pET20b大肠杆菌表达系统表达目的蛋白有3个初衷:①该表达系统中的大肠杆菌
+
菌株TransRosetta(DE3)补充了大肠杆菌缺乏
的6种稀有密码子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA)对应的tRNA,能够提高外源基因,尤其是真核基因在原核表达系统中的表达水平;②将ED、EA基因构建到polB信号肽下游使目的蛋白通过分泌表达到细菌的外周质中,减少了以往从包涵体中提取目的蛋白的诸多环节,同时还利于目的蛋白保持生物活性;③构建表达载体时将目的蛋白引入到编码6个组氨酸的核苷酸序列的N端,6个组氨酸没有免疫原性,一般不影响蛋白的折叠和干扰重组蛋白的结构和功能,同时组氨酸靶最大的优点是允许重组蛋白固定于金属鏊合表面上,有利于重组蛋白的纯化。实验中经过对纯化后的ED、EA蛋白的功能活性测定并未发现其影响β2半乳糖甘酶全酶活性。本实验结果为进一步开展CEDIA技术检测小分子蛋白研究奠定了实验基础。
[参考文献]
[1]
LangleyKE,VillarejoMR,FowlerAV,etal.Molecularbasisofbeta2galactosidasealpha2complementation[J].ProcNatlAcadSciUSA,1975,72(4):125421257.[2]
ZabinI.beta2Galactosidasealpha2complementation.Amodelofprotein2proteininteraction[J].MolCellBiochem,1982,
44
49(2):87296.[3]
吉林大学学报(医学版) 第36卷 第1期 2010年1月
clonedenzymedonorimmunoassay[J].2004,333(1):1362147.[8]
Yasui2Furukori
N,
Saito
M,
Furukori
H,
et
al.
Establishmentofnewclonedenzymedonorimmunoassays
Monitoringprotein2
[9]
(CEDIA)forhaloperidolandbromperidol[J].TherDrugMonit,2004,26(3):3362341
eukaryoticcellsbybeta2
AnalBiochem,
HendersonDR,FriedmanSB,HarrisJD,etal.CEDIA,anewhomogeneousimmunoassaysystem[J].ClinChem,1986,32(9):163721641.
[4]RossiF,CharltonCA,BlauHM.proteininteractionsinintact1997,94(16):840528410.
galactosidasecomplementation[J].ProcNatlAcadSciUSA,[5]
TachiT,KajiN,TokeshiM,etal.AnalSci,2009,25(2):1492151.[6]
YangX,JanatovaJ,JuenkeJM,etal.AnImmunoChipprototypeforsimultaneousdetectionofantiepilepticdrugsusinganenhancedone2stephomogeneousimmunoassay[J].AnalBiochem,2007,365(2):2222229.[7]
JeonSI,YangX,AndradeJD.Modelingofhomogeneous
Microchip2based
张 钧,沈建根,谢鑫友,等.大肠杆菌β2半乳糖苷酶EA、
ED融合蛋白的表达[J]1中华微生物和免疫学杂志,2003,23(2):11321141
homogeneousimmunoassayusingaclonedenzymedonor[J].[10]程香普,段芳龄,张智清,等.阳离子脂质体Lipofectin介
导的β2半乳糖苷酶基因在HepG2及GRC细胞株中的表达
[J].郑州大学学报:医学版,2004,39(3):4552457.[11]王 茜,杜珍武,卜丽莎,等.四环素基因表达调控β2半乳
糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达[J].吉林大学学报:医学版,2009,35(2):3042308.
辽河油田居民吸烟现况调查分析辽宁省辽河油田第二职工医院(辽宁盘锦124010) 赵立新,刘红梅,李剑平,叶连新,刘丽君,李 明
1 资料与方法
调查对象:采取随机整群抽样方法抽取辽河油田某公司4000名职工为本次调查对象。调查内容和方法:采取统一调查问卷,调查员经过培训,进行统一的流行病学现场调查。危险因素判定标准:以每日吸烟至少1支,持续或累计6个月以上者为吸烟者;戒烟超过2年者为成功戒烟者。吸烟者、现在吸烟者是指符合吸烟者条件,调查时正在吸烟,并且每天至少吸1支及以上烟的人。重型吸烟者是指调查时每天吸20或20支以上香烟的吸烟者。总吸烟率、现在吸烟率和重型吸烟率分别是指吸烟者、现在吸烟者和重型吸烟者在被调查人群中的百分比。数据处理:将数据用Epidate2遍录入,转入
SAS610软件包进行统计学分析处理。2 结 果
211 吸烟率 发放问卷4000份,收回有效问卷3809份,其中报告吸烟1157人,总吸烟率为30138%;男性吸烟率
2
(52159%)高于女性(5111%)(χ=26168,P<01001)。初中以上学历男性吸烟率高于初中学历以下;女性吸烟率随文化
程度的提高呈下降趋势。40～50岁人群吸烟率最高,60岁以上组最低,随着年龄组增高,女性吸烟率呈上升趋势。
212 吸烟量 吸烟者中日平均吸烟量11135支,有25186%的人群日吸烟量在20支以上。大部分女性日吸烟量小于10支。
开始吸烟年龄越小,吸烟量越大。
213 开始吸烟年龄 开始吸烟平均年龄为21142岁,青少年阶段开始吸烟占吸烟人数的35189%,其中男性占37123%,
女性占20141%。53143%的人成年后开始吸烟,42186%的女性30岁开始吸烟,92111%的男性开始吸烟年龄在30岁以前。
214 开始吸烟的主要原因 好奇尝试(47161%)、社交需要(21162%)、解乏(11182%)为开始吸烟的主要原因。青少
年阶段开始吸烟者的主要吸烟原因为好奇尝试占55111%,30岁以上开始吸烟者社交和解乏已成为主要吸烟原因。
215 戒烟率 戒烟率为7172%。吸烟者中,戒过烟者占74124%,戒烟成功率为10159%,男性吸烟者曾戒率为63104%,
女性吸烟者曾戒率为54146%。
216 戒断期限 戒烟累积时间<6个月占46157%,戒烟>2年者仅为10159%。
217 戒烟的主要原因 在857名戒烟者中有48177%的人戒烟是因为意识到吸烟的害处,20189%的人是因家人反对而戒
烟,戒烟的第3个主要原因是由于疾病所致。
3 讨 论
本次调查结果显示:居民吸烟率为30138%,低于1996年全国调查(3716%)和同期全国卫Ⅶ项目结果(36%)。男性吸烟率、吸烟量均显著高于女性,显示男性烟民依然是控烟运动的重点人群。开始吸烟年龄越早吸烟量越大,以社交、好奇心理开始吸烟为成人吸烟的主要原因,表明该年龄段人群行为可塑性较强,常成为吸烟的危险人群,也是控制吸烟的主要人群,因此控烟运动应从青少年抓起。本次调查结果显示:影响吸烟率的主要因素仍是年龄、性别、职业、文化程度等,但与全国部分大城市调查结果不同的是文化程度并未显示与吸烟率呈反比关系。辽河油田居民戒烟率为7172%,低于卫Ⅶ项目结果(8163%),虽然有74124%的吸烟者曾戒过烟,但成功戒烟率仅为10159%,因此对已吸烟者加强戒烟知识和戒烟技能的宣传也是控制吸烟的重要工作之一。
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