数字PCR定量检测方法[发明专利]

2022-05-10 来源：爱问旅游网

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110066857 A(43)申请公布日 2019.07.30

(21)申请号 201810070377.2(22)申请日 2018.01.24

(71)申请人思纳福（北京）医疗科技有限公司

地址 100094 北京市海淀区北清路68号院

24号楼A座4层0235(72)发明人盛广济　

(74)专利代理机构北京华进京联知识产权代理

有限公司 11606

代理人赵永辉(51)Int.Cl.

C12Q 1/6851(2018.01)

权利要求书2页说明书69页附图38页

(54)发明名称

数字PCR定量检测方法(57)摘要

通过数字PCR定量检测方法可以实现所述多个微液滴的动态跟踪，在所述多个微液滴进行温度循环过程中都可以找到每个微液滴对应的具体位置，可以实现核酸扩增的全部过程的监测。通过所述数字PCR定量检测方法不仅摆脱了对标准曲线的依赖，排除了由标准曲线引起的定量结果不确定的问题，并且解决了液滴式数字PCR终点检测方式的限制，打破了只采用了一个p(x＝0)的数据对待测样本整体进行参数估计的局限性。同时，通过对所述多个微液滴荧光曲线进行处理，并进行不依赖于均匀性假设进行的统计修正，提高了数字PCR定量检测的准确性。CN 110066857 ACN 110066857 A

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1.一种数字PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S4110，获取所有微液滴的多个实时荧光图像，根据所述多个实时荧光图像获得进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线；

S4120，根据所述实时荧光曲线，获得所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值；S4130，根据所述Ct值与进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数的关系，获得所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数；

S4140，根据所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数，获得所述核酸起始拷贝数的频数分布；

S4150，根据所述核酸起始拷贝数的频数分布，计算泊松分布的参数λ。2.如权利要求1所述的数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述S4110包括：S4111，根据每个实时荧光图像，获得每个进行核酸扩增的微液滴的荧光强度值；S4113，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的荧光强度值，获得每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线；

S4115，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的荧光曲线，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线。

3.如权利要求1所述的数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述S4120包括：S4121，对每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线求导，获取所述每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线的斜率；

S4123，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线的斜率，获取所述每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线的斜率中斜率固定不变的数值；

S4125，根据所述斜率固定不变的数值，获取其对应的起始循环数，所述起始循环数为每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值；

S4127，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值。

4.如权利要求1所述的数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述S4120还包括：S4122，根据每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线，获得每个进行核酸扩增的微液滴的荧光域值的缺损值；

S4124，根据每个进行核酸扩增的微液滴的荧光域值的缺损值，获得其对应的循环数，所述循环数为每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值；

S4126，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值。

5.如权利要求1所述的数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述S4140包括：S4141，根据所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数中的最大值和最小值；

S4143，根据所述最大值与所述最小值，选取组距和组数，获得所述核酸起始拷贝数的频数分布。

6.如权利要求1所述的数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述S4150中计算泊松分布的参数λ时，采用最大似然估计方法。

7.一种数字PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

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S4210，获取所有微液滴的多个实时荧光图像，根据所述多个实时荧光图像获得进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线；

S4220，根据所述实时荧光曲线，获得所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值；S4230，根据所述Ct值与进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数的关系，获得所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数；

S4240，根据所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数，选取部分核酸起始拷贝数；

S4250，根据所述部分核酸起始拷贝数，获取所述部分核酸起始拷贝数得频数分布；S4260，根据所述部分核酸起始拷贝数的频数分布，对泊松分布进行点估计，获取泊松分布的参数λ。

8.如权利要求7所述的数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述S4260包括在一个区间[λλλ，使得所述部分核酸起始拷贝数的频数值误差平方和err最小。min,max]内搜索

9.如权利要求7所述的数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述S4260中对泊松分布进行点估计的方法还包括矩估计法、顺序统计量法或最大似然法。

10.如权利要求7所述的数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述S4260中的所述误差平方和err为：

其中，每个微液滴中含有的DNA起始拷贝数为随机变量x，部分微液滴的DNA起始拷贝数对应的频数值为nk，N为所述多个微液滴的总数。

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说　明　书数字PCR定量检测方法

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技术领域

[0001]本发明涉及数字PCR定量分析领域，特别是涉及一种数字PCR定量检测方法。背景技术

[0002]数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。由于液滴式数字PCR只能进行终点检测，因此只能分辨液滴中是否含有目标DNA，而无法确定起始DNA的拷贝数。同时，传统的液滴式数字PCR都要求生成的液滴数量足够多，且样本浓度不是很大的情况下适用。

[0003]现有液滴数字PCR终点检测方式的限制，最终只采用了一个的数据对样本整体进行参数估计。样本整体的参数估计精度完全取决于阴性液滴数量统计的准确性。当DNA浓度较高时，液滴总量较少时都会造成数量减少，从而影响估计的准确性；在极端情况下，则无法实现定量检测。因此，现有液滴数字PCR终点检测方法有局限性，检测精度低。发明内容

[0004]基于此，有必要针对现有液滴数字PCR终点检测方法检测精度低的问题，提供一种适用性高，检测精度高的数字PCR定量分析方法。

[0005]本发明提供一种数字PCR定量检测方法包括以下步骤：[0006]S4110，获取所有微液滴的多个实时荧光图像，根据所述多个实时荧光图像获得进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线；[0007]S4120，根据所述实时荧光曲线，获得所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值；[0008]S4130，根据所述Ct值与进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数的关系，获得所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数；[0009]S4140，根据所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数，获得所述核酸起始拷贝数的频数分布；[0010]S4150，根据所述核酸起始拷贝数的频数分布，计算泊松分布的参数λ。[0011]在其中一个实施例中，所述S4110包括：[0012]S4111，根据每个实时荧光图像，获得每个进行核酸扩增的微液滴的荧光强度值；[0013]S4113，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的荧光强度值，获得每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线；[0014]S4115，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的荧光曲线，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线。[0015]在其中一个实施例中，所述S4120包括：[0016]S4121，对每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线求导，获取所述每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线的斜率；

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S4123，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线的斜率，获取所述每

个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线的斜率中斜率固定不变的数值；[0018]S4125，根据所述斜率固定不变的数值，获取其对应的起始循环数，所述起始循环数为每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值；[0019]S4127，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值。

[0020]在其中一个实施例中，所述S4120还包括：[0021]S4122，根据每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线，获得每个进行核酸扩增的微液滴的荧光域值的缺损值；[0022]S4124，根据每个进行核酸扩增的微液滴的荧光域值的缺损值，获得其对应的循环数，所述循环数为每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值；[0023]S4126，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值。

[0024]在其中一个实施例中，所述S4140包括：[0025]S4141，根据所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数中的最大值和最小值；[0026]S4143，根据所述最大值与所述最小值，选取组距和组数，获得所述核酸起始拷贝数的频数分布。

[0027]在其中一个实施例中，所述S4150中计算泊松分布的参数λ时，采用最大似然估计方法。

[0028]在其中一个实施例中，一种数字PCR定量检测方法，包括以下步骤：[0029]S4210，获取所有微液滴的多个实时荧光图像，根据所述多个实时荧光图像获得进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线；[0030]S4220，根据所述实时荧光曲线，获得所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值；[0031]S4230，根据所述Ct值与进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数的关系，获得所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数；[0032]S4240，根据所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数，选取部分核酸起始拷贝数；

[0033]S4250，根据所述部分核酸起始拷贝数，获取所述部分核酸起始拷贝数得频数分布；

[0034]S4260，根据所述部分核酸起始拷贝数的频数分布，对泊松分布进行点估计，获取泊松分布的参数λ。

[0035]在其中一个实施例中，所述S4260包括在一个区间[λλλ，使得所述部min,max]内搜索分核酸起始拷贝数的频数值误差平方和err最小。[0036]在其中一个实施例中，所述S4260中对泊松分布进行点估计的方法还包括矩估计法、顺序统计量法或最大似然法。[0037]在其中一个实施例中，所述S4260中的所述误差平方和err为：

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其中，每个微液滴中含有的DNA起始拷贝数为随机变量x，部分微液滴的DNA起始拷

贝数对应的频数值为nk，N为所述多个微液滴的总数。

[0040]通过数字PCR定量检测方法可以实现所述多个微液滴的动态跟踪，在所述多个微液滴进行温度循环过程中都可以找到每个微液滴对应的具体位置，可以实现核酸扩增的全部过程的监测。通过所述数字PCR定量检测方法不仅摆脱了对标准曲线的依赖，排除了由标准曲线引起的定量结果不确定的问题，并且解决了液滴式数字PCR终点检测方式的限制，打破了只采用了一个p(x＝0)的数据对待测样本整体进行参数估计的局限性。同时，通过对所述多个微液滴荧光曲线进行处理，并进行不依赖于均匀性假设进行的统计修正，提高了数字PCR定量检测的准确性。

附图说明

[0041]图1为本发明提供的数字PCR检测仪的整体结构示意图；[0042]图2为本发明提供的数字PCR检测仪的微液滴生成装置；

[0043]图3为本发明一实施例提供的吐液枪头的出口端运动时液滴的受力示意图；[0044]图4为本发明一实施例提供的吐液枪头的出口端的速度变化示意图；

[0045]图5为本发明一实施例提供的吐液枪头的出口端运动时微液滴生成过程示意图；[0046]图6为本发明另一实施例提供的吐液枪头的出口端运动时液滴的受力示意图；[0047]图7为本发明一实施例提供的液滴随吐液枪头的出口端运动时理想情况下粘滞阻力变化示意图；

[0048]图8为本发明一实施例提供的吐液枪头的出口端两个运动周期生成一个微液滴的过程示意图；

[0049]图9为本发明一实施例提供的吐液枪头的出口端一个运动周期生成一个微液滴的过程示意图；

[0050]图10为本发明一实施例提供的吐液枪头的出口端一个运动周期生成两个微液滴的过程示意图；

[0051]图11为本发明一实施例提供的吐液枪头摆动时微液滴的生成过程示意图；

[0052]图12为本发明一实施例提供的第二液体的粘度变化时微液滴的生成过程示意图；[0053]图13为本发明一实施例提供的更换吐液枪头时微液滴的生成过程示意图；

[0054]图14为本发明一实施例提供的吐液枪头的出口端在不同的运动轨迹下微液滴的生成过程示意图；

[0055]图15为本发明另一实施例提供的吐液枪头的出口端速度变化示意图；[0056]图16为本发明一实施例提供的吐液枪头的出口端结构示意图；[0057]图17为本发明另一实施例提供的吐液枪头的出口端结构示意图；[0058]图18为本发明一实施例提供的吐液枪头结构示意图；[0059]图19为本发明另一实施例提供的吐液枪头结构示意图；

[0060]图20为本发明一实施例提供的斜切结构吐液枪头生成微液滴的过程示意图；[0061]图21为本发明另一实施例提供的斜切结构吐液枪头生成微液滴的过程示意图；[0062]图22为本发明一实施例提供的弯折结构吐液枪头生成微液滴的过程示意图；[0063]图23为本发明另一实施例提供的弯折结构吐液枪头生成微液滴的过程示意图；

CN 110066857 A[0064][0065][0066][0067][0068][0069][0070][0071][0072][0073][0074][0075][0076][0077][0078][0079]

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图24为本发明一实施例提供的吐液枪头表面处理方法流程图；图25为本发明另一实施例提供的吐液枪头表面处理方法流程图；图26为本发明一实施例提供的方案一实验结果分布图；

图27为本发明一实施例提供的方案一生成的均一性高的微液滴放大图；图28为本发明一实施例提供的方案一生成的均一性低的微液滴放大图；图29为本发明一实施例提供的方案二实验结果分布示意图；

图30为本发明一实施例提供的方案二生成的均一性高的微液滴放大图；图31为本发明一实施例提供的方案二生成的均一性低的微液滴放大图；图32为本发明一实施例提供的方案二生成的热稳定性高的微液滴放大图；图33为本发明一实施例提供的方案二生成的热稳定性低的微液滴放大图；图34为本发明一实施例提供的方案三生成的微液滴放大图；

图35为本发明一实施例提供的方案四生成的均一性高的微液滴放大图；图36为本发明一实施例提供的方案四生成的热稳定性高的微液滴放大图；图37为本发明一实施例提供的流体控制机构与吐液枪头连接示意图；图38为本发明一实施例提供的流体控制机构结构示意图；

图39为本发明一实施例提供的吐液枪头在驱动液体驱动下生成微液滴过程示意图40为本发明另一实施例提供的流体控制机构结构示意图；图41为本发明一实施例提供的运动控制机构结构示意图；图42为本发明一实施例提供的闭环控制电机控制原理图；

图43为本发明一实施例提供的压电式运动控制机构结构示意图；

图44为本发明一实施例提供的电磁-弹性件式运动控制机构结构示意图；图45为本发明另一实施例提供的电磁-弹性件式运动控制机构结构示意图；图46为本发明一实施例提供的电磁-轴承式运动控制机构结构示意图；图47为本发明另一实施例提供的电磁-轴承式运动控制机构结构示意图；图48为本发明再一实施例提供的电磁-轴承式运动控制机构结构示意图；图49为本发明荧光检测装置结构示意图；图50为本发明温控装置结构示意图；

图51为本发明温控装置结构切面结构示意图；

图52为本发明温控装置的半导体电偶对电极连接结构示意图；图53为本发明温控装置的瞬态性能测试示意图；图54为本发明温控装置的稳态性能测试示意图；图55为本发明微液滴容器结构示意图；

图56为本发明微液滴容器结构平面结构示意图；图57为本发明微液滴容器的反应单元结构示意图；图58为本发明微液滴容器的一种切面结构示意图；图59为本发明微液滴容器的一种切面结构示意图；图60为本发明微液滴容器的一种切面结构示意图；图61为本发明数字PCR检测仪的分析方法流程图；

图；

[0080][0081][0082][0083][0084][0085][0086][0087][0088][0089][0090][0091][0092][0093][0094][0095][0096][0097][0098][0099][0100][0101]

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图62为本发明微液滴平铺方法流程图；

[0103]图63为本发明微液滴容器底板微液滴堆积示意图；

[0104]图64为本发明完全抽样的数字PCR定量检测方法流程图；[0105]图65为本发明部分抽样的数字PCR定量检测方法流程图；

[0106]图66为部分抽样的数字PCR定量检测方法与其他方法CPD的标准偏差进行对比图；[0107]图67为不同体积数字PCR的定量分析方法流程图。[0108]其中：1-数字PCR检测仪；10-微液滴生成装置；20-温控装置；30-荧光信号检测装置；40-定量分析装置；50-控制器；110-吐液枪头；111-入口端；112-出口端；113-针梗；114-针栓；115-储液槽；116-卡槽；190-第一液体；195-液滴；199-微液滴；120-流体驱动机构；121-变容积组件；1211-注射筒；1212-推杆；1213-进出液口；1214-驱动液体；122-动力组件；1221-驱动电机；1222-丝杆；1223-滑块；123-细管；124-三通换向阀；125-储液罐；130-运动控制机构；131-支撑架；132-连接件；1321-接头；1322-连接轴；133-振动电机；134-延伸板；135-压电陶瓷；136-弹性件；137-电磁铁；138-磁性件；170-第一控制器；60-微液滴容器；699-第二液体；f1-浮力；f2-粘滞阻力；f3-最大附着力；G-重力；20-温控装置；210-第二控制器；212-温度控制单元；214-控制电路；220-柔性电路板；221-第二电极片；222-第一电极；223-第二电极；230-多个半导体电偶对；231-P型电偶；232-N型电偶；240-加热基板；241-第一表面；242-第二表面；243-第一电极片；250-导热增强层；260-温度传感器；270-散热装置；271-基板；272-散热片；273-风扇；30-荧光检测装置；310-第三控制器；330-荧光探测组件；331-相机；332-物镜；333-第二滤光片；340-激发光源；341-LED光源；342-准直镜；343-第一滤光片；344-二向色镜；345-复眼透镜；346-聚焦透镜；微液滴容器60；610-容器底板；611-底面；620-第一环形侧板；621-第一环形侧面；630-收纳空间；631-开口；640-环形板；641-环形面；650-第二环形侧板；660-第三环形侧板；612-反应单元；613-多个环形凸条；614-微液滴收纳槽；670-密封盖。具体实施方式

[0109]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0110]需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。相反，当元件被称作“直接在”另一元件“上”时，不存在中间元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。实施例附图中各种不同对象按便于列举说明的比例绘制，而非按实际组件的比例绘制。

[0111]数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。[0112]目前，数字PCR包括液滴式PCR检测方法和芯片式检测方法。芯片式检测方法中单

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个芯片上的有效反应腔数量一般只有数千个，远少于液滴式。所以，芯片式数字PCR的动态范围相对于液滴式较窄。液滴式PCR检测方法将样本分散成油包水的反应单元，之后对每个反应单元进行实时或终点荧光分析。但是，目前的数字PCR仪器存在有效反应单元数量少，耗材成本高、动态范围较窄，工作效率低以及集成化程度不高的问题。[0113]基于此，有必要针对目前数字PCR仪器的问题，提供一种数字PCR检测仪。[0114]请参见图1，本发明提供一种数字PCR检测仪1，所述数字PCR检测仪1包括：微液滴生成装置10、温控装置20、荧光信号检测装置30、定量分析装置40以及控制器50。所述微液滴生成装置10用以将核酸扩增反应液微滴化，形成多个微液滴。所述温控装置20与所述微液滴生成装置10通过轨道连接，用以将所述多个微液滴转移至所述温控装置20，进行温度循环，实现核酸扩增。所述荧光信号检测装置30与所述温控装置20相对设置，用以对核酸扩增后的所述多个微液滴进行拍照检测。所述定量分析装置40与所述荧光信号检测装置30通过数据线连接，用以实现所述多个微液滴荧光信息的传输，进行定量分析。所述控制器50分别与所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、荧光信号检测装置30以及定量分析装置40连接，用以控制所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、荧光信号检测装置30以及定量分析装置40。

[0115]所述数字PCR检测仪1可以将所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、所述荧光信号检测装置30以及所述定量分析装置40集成化，从而使得操作人员可以实现自动化操作。所述数字PCR检测仪1具有较高的工作效率。[0116]所述数字PCR检测仪1在工作时，所述微液滴生成装置10可以将所述待测核酸扩增反应液进行微滴化，从而形成多个微液滴。所述温控装置20可以对所述多个微液滴进行核酸扩增。所述荧光信号检测装置30实时拍测所述多个微液滴的荧光变化图片。通过所述多个微液滴的荧光变化图片，可以获取所述多个微液滴的荧光变化曲线。根据所述荧光变化曲线，可以获取所述多个微液滴的Ct值，并通过Ct值与起始拷贝数的关系对初始DNA的浓度进行定量分析。其中，Ct值是指每个微液滴的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。[0117]所述温控装置20对所述多个微液滴进行核酸扩增反应，并通过所述荧光信号检测装置30采集核酸扩增反应后的所述多个微液滴的产物信号，如荧光、紫外吸收、浊度等信号。利用所述多个扩增与非扩增微液滴在组成上的差异，对获得目标序列扩增的液滴数量进行分析，最终实现对核酸分子的定量分析。通过实时监测所述多个微液滴的荧光变化图片，检测结果具有直接性，可以解决所述多个微液滴中的假阳性和假阴性的问题。[0118]所述数字PCR检测仪1将所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、所述荧光信号检测装置30以及所述定量分析装置40集成化，使得所述操作人员可以实现自动化操作，不进提高了工作效率，还具有反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强和结果清晰的优点。[0119]目前医学临床检验、纳米材料制备、食品及环境检测、生化分析等应用领域都对微量液体精确操作具有广泛需求。微量液体操作的核心技术之一是把微升量级的液体进一步分割为纳升甚至皮升体积的液滴，作为微反应体系。微反应体系生成的一个主要技术分支是乳化微液滴生成。[0120]近些年来，在文献中报道了多种微液滴生成技术，如膜乳化法、喷雾乳化法、微流控芯片法和吐液枪头注射/喷射法。然而，通过吐液枪头生成乳化微液滴的方法在实际应用中都各存在一定的缺点。有的方法利用微量液体在气液相界面变换时的界面能和流体剪切

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力，克服液体在吐液枪头出口的表面张力和附着力，使流出吐液枪头管口的液滴能顺利地脱离吐液枪头，并在不相溶液体中形成大小可控的液滴。但是这种方法需要吐液枪头在液面上下切割运动，还需要对吐液枪头相对于液面的起始和终点位置进行高精度的定位，在工程实现上难度很大。上述方法在吐液枪头反复快速进出液相的过程中，液相的表面易形成不稳定的驻波，限制了微液滴的生成速率。还有的方法通过吐液枪头在液体里的圆周或者螺旋匀速运动产生的剪切力切断注入的不相溶液体而形成液滴。但是，这种方法由于吐液枪头产生液滴的大小受到各种系统因素变化的影响较大(比如液体的粘稠度、环境的温度、运动速度、运动轨迹等)，从而产生误差。并且，这一误差会随着产生液滴的数量增多而积累，因而大批量液滴生成的体积大小均一性的控制难度很大。[0121]基于此，有必要针对在生成微液滴的过程中存在的微液滴生成速率较慢、生成微液滴体积大小均一性难以控制的问题，提供一种微液滴快速生成且体积大小均一性高的微液滴生成方法及装置。[0122]请参见图2，在一个实施例中，所述微液滴生成装置10包括吐液枪头110、流体驱动机构120、运动控制机构130以及第一控制器170。所述吐液枪头110具有出口端及入口端，并用于储存第一液体。微液滴生成装置10可以与微液滴容器配合使用。所述微液滴容器中储存有第二液体，所述吐液枪头110的出口端插入所述第二液体的液面下。[0123]所述第一液体与所述第二液体之间互不相溶或具有界面反应。第一液体和第二液体可以为任意不互溶的两种液体，在本发明的一个实施例中，所述第一液体为水溶液，所述第二液体为与水不互溶的油性液体，如矿物油(包括正十四烷等)、植物油、硅油和全氟烷烃油等，生成的液滴为水溶液液滴。或者，所述第一液体为矿物油，如十四烷和正己烷等有机相，所述第二液体为与矿物油不互溶的全氟烷烃油。所述第一液体和第二液体可以为不互溶的双水相，在本发明的另一个实施例中，所述第一液体为水溶液，所述第二液体为与水不互溶的水性液体，如第一液体为右旋糖酐溶液，第二液体为聚乙二醇(PEG)水溶液，生成的液滴为右旋糖酐溶液液滴。

[0124]所述第一液体和第二液体也可以为具有界面反应的两种液体，在本发明的一个实施例中，所述第一液体为海藻酸纳水溶液，所述第二液体为氧化钙水溶液，如质量浓度为1％的氧化钙水溶液，两者存在界面反应，生成的液滴为海藻酸钙凝胶微球。本申请还可以通过更换吐液枪头或吐液枪头内流出第一液体的组分，顺次在开口容器中形成多个不同组分和体积的液滴，既可以用于实现大批量的微体积高通量筛选，也可以实现多步骤的超微量生化反应和检测，具有广阔的应用前景。

[0125]所述流体驱动机构120与所述吐液枪头110的入口端连接，用于将储存在所述吐液枪头110内部的所述第一液体从所述吐液枪头110的出口端排出。所述运动控制机构130用于控制所述吐液枪头110的出口端与所述第二液体之间产生设定轨迹或设定速度或设定加速度的相对运动，以使排出所述吐液枪头110的出口端的第一液体克服表面张力及所述吐液枪头110对其的附着力形成微液滴。所述第一控制器170分别与所述流体驱动机构120以及所述运动控制机构130连接，用以控制所述流体驱动机构120以及所述运动控制机构130协调工作。

[0126]有文献报道了微液滴生成技术，如膜乳化法、喷雾乳化法、微流控芯片法、吐液枪头注射/喷射法等。其中，吐液枪头注射/喷射法作为最新的微液滴生成技术，在微液滴的生

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成方面及耗材成本控制方面均具有良好的应用前景。一般的吐液枪头注射/喷射法需要吐液枪头在液面上下切割运动以生成微液滴。但这种方法会在液面形成不稳定的驻波，微液滴的生成过程不稳定。[0127]基于此，有必要针对一般的吐液枪头注射/喷射法存在的微液滴生成过程不稳定的问题，提供一种微液滴生成过程稳定的微液滴生成方法。[0128]如图3所示，在本发明一实施例中，在运动控制机构130的带动下，吐液枪头110的出口端112可以在第二液体液面下做包含瞬时加速的运动，加速度大小为a1。第一液体从吐液枪头110的出口端112排出后形成附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195。液滴195在吐液枪头110的出口端112瞬时加速的瞬间脱离吐液枪头110的出口端112形成微液滴。微液滴在脱离吐液枪头110的出口端112之前的所受到的作用力分别为重力G、第二液体的浮力f1、第二液体的粘滞阻力f2以及吐液枪头110的出口端112与液滴195之间的最大附着力f3。微液滴在脱离吐液枪头110的出口端112之前的质量为m、加速度大小为a2。根据牛顿第二运动定律，得出

吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3与吐液枪头110的表面自由能、液滴195的表面张力以及吐液枪头110的几何尺寸有关。吐液枪头110的出口端112做瞬时加速运动时，吐液枪头110的出口端112对液滴195附着力的方向与加速度的方向相同。将附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195简化为球状。由斯托克斯(Stokes)公式可知，液滴195在第二液体中运动时所受到的粘滞阻力f2＝6πηrv，其中η为第二液体的粘滞系数，r为液滴195的半径，v为液滴195的运动速度。在吐液枪头110的出口端112做瞬时加速之前液滴195的速度为零，因此液滴195在吐液枪头110的出口端112瞬时加速的瞬间在第二液体中受到的粘滞阻力f2为零或极小。在微液滴生成的过程中，一般液滴195的直径范围在皮升至微升的数量级，且液滴195的重力G和第二液体的浮力f1方向相反，因此液滴195的重力G与第二液体的浮力f1的矢量和约为零。由于粘滞阻力f2为零或极小，以及重力G与浮力f1的矢量和约为零，所以

由牛顿第二运动定律可知，吐液枪头110的

[0129]

出口端112做瞬时加速运动时，液滴195在第二液体中能达到的最大加速度为a2≈f3/m，其中m为液滴195的质量。当液滴195的加速度a2小于吐液枪头110的出口端112的加速度a1时，液滴195从吐液枪头110的出口端112掉落形成微液滴。因此，液滴195脱离吐液枪头110的出口端112(即生成一个微液滴)的条件近似为：a2≈(f3/m)＜a1。

[0130]运动控制机构130能够精确控制吐液枪头110的出口端112瞬时加速度的大小。因此，通过控制吐液枪头110的出口端112每次瞬时加速度的值均较大，吐液枪头110的出口端112做瞬时加速运动能够有效的生成液滴195。[0131]基于此，本发明还提供一种微液滴生成方法，包括以下步骤：[0132]S201，提供具有出口端112的吐液枪头110，吐液枪头110内储存有第一液体；提供储存有第二液体的微液滴容器，微液滴容器具有开口，其中第一液体与第二液体为任意互不相溶的两种液体或具有界面反应的两种液体；[0133]S202，吐液枪头110的出口端112由微液滴容器的开口插入第二液体的液面下；[0134]S203，吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下做包含瞬时加速的运动，同时第一液体由吐液枪头110的出口端112排出，排出吐液枪头110的出口端112的第一液体形成

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附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195，液滴195在吐液枪头110的出口端112的瞬时加速运动过程中脱离吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下形成微液滴。[0135]上述微液滴生成方法中，由于所述吐液枪头110的出口端112瞬时加速时加速度数值较大，附着在所述吐液枪头110的出口端112的液滴195与所述吐液枪头110的出口端112之间的附着力不足以带动液滴195与所述吐液枪头110的出口端112同步加速，从而使得附着在所述吐液枪头110的出口端112的液滴195脱离所述吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下形成微液滴。本发明所提供的微液滴生成方法，所述吐液枪头110的出口端112在第二液体的液面下做瞬时加速运动时产生微液滴，减小了所述吐液枪头110的出口端112运动时对第二液体造成的扰动，保证了微液滴生成过程的稳定性。[0136]可选的，在步骤S203中，第一液体由吐液枪头110的出口端112排出的方式可以为连续排出或非连续排出。具体的排出方式，可根据实际工况进行相应的设计。在本实施例中，在步骤S203中，第一液体由吐液枪头110的出口端112连续排出，以充分利用吐液枪头110的出口端112的每一次瞬时加速生成微液滴。在一个实施例中，在步骤S203中，第一液体由吐液枪头110的出口端112以恒定的流速排出，意即在相等的时间间隔内，排出吐液枪头110的出口端112的第一液体体积总是相等的。第一液体由吐液枪头110的出口端112以恒定的流速排出，有利于通过控制吐液枪头110的出口端112的运动实现微液滴生成的控制。[0137]在本发明一实施例中，步骤S203中，吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下做包含瞬时加速的周期运动。吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下做周期运动，意即吐液枪头110的出口端112的位移、速度及加速度均呈现出周期性的变化。吐液枪头110的出口端112做包含瞬时加速运动的周期运动，配合第一液体由吐液枪头110的出口端112以恒定的流速排出，实现了微液滴的等时间间隔生成。或者第一液体排出吐液枪头110的出口端112的流速是变化的，但在吐液枪头110的出口端112的一个运动周期内，第一液体排出吐液枪头110的出口端112的体积保持相同。以此保证每次吐液枪头110的出口端112瞬时加速前液滴195的体积是相同的，以生成体积大小一致的微液滴。[0138]在不更换吐液枪头110及第一液体的情况下，吐液枪头110的表面自由能、吐液枪头110的几何尺寸及液滴195的表面张力作为影响吐液枪头110的出口端112与液滴195之间最大附着力f3的两个因素是确定的。因此，在不更换吐液枪头110及第一液体的情况下，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3是固定的。在流体驱动机构120的带动下，第一液体能够实现以均匀的流速连续排出吐液枪头110的出口端112。运动控制机构130能够精确控制吐液枪头110的出口端112做瞬时加速度a1运动的时刻及瞬时加速度a1的大小。流体驱动机构120与运动控制机构130相互配合能够容易的实现当液滴195的体积达到固定值的瞬间，驱动吐液枪头110的出口端112产生加速度为a1的瞬时加速度，以生成体积大小一致的微液滴。如果流体驱动机构120控制第一液体均匀、连续的排出吐液枪头110的出口端112，只需运动控制机构130驱动吐液枪头110的出口端112产生等时间间隔的瞬时加速运动，即可生成体积大小一致的微液滴。

[0139]当使用多个吐液枪头110同时或者顺次生成微液滴时，吐液枪头110的表面自由能及吐液枪头110的几何尺寸作为影响吐液枪头110的出口端112与液滴195之间最大附着力f3的两个因素是变化的。但批量加工能够控制吐液枪头110的表面自由能及吐液枪头110的几何尺寸在一定的区间内变化。液滴195的表面张力作为影响吐液枪头110的出口端112与

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液滴195之间最大附着力f3的另一个因素也只是在很小的范围内变化。因此，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3只在很小的区间内波动。流体驱动机构120能够驱动第一液体以均匀的流速连续排出吐液枪头110的出口端112。运动控制机构130能够精确控制吐液枪头110的出口端112做瞬时加速度a1运动的时刻及瞬时加速度a1的大小。流体驱动机构120与运动控制机构130相互配合能够容易的实现当液滴195的体积达到固定值的瞬间，驱动吐液枪头110的出口端112产生加速度为a1的瞬时加速度，以生成体积大小一致的微液滴。如果流体驱动机构120控制第一液体均匀、连续的排出吐液枪头110的出口端112，只需运动控制机构130驱动吐液枪头110的出口端112产生等时间间隔的瞬时加速运动，即可生成体积大小一致的微液滴。

[0140]流体驱动机构120在将第一液体匀速排出吐液枪头110的出口端112的同时，配合运动控制机构130在液滴195的体积达到设定值的瞬间做加速度值较大的瞬时加速运动。本发明提供的微液滴生成方法不仅保证了使用同一根吐液枪头110生成体积大小均一的液滴195，同时能够保证多根吐液枪头110同时或者顺次生成的微液滴体积大小的均一性。本实施例提供的微液滴生成方法在保证微液滴体积大小均一性的同时，可通过多根吐液枪头110同时生成微液滴提高微液滴的生成效率。[0141]进一步的，在运动控制机构130的控制下，吐液枪头110的出口端112在一个周期性运动内包括多次瞬时加速运动，多次瞬时加速运动的加速度大小相同，且多次瞬时加速运动的时刻均分吐液枪头110的出口端112的一个运动周期。吐液枪头110的出口端112在一个周期性运动内包括多次瞬时加速运动有助于在吐液枪头110的出口端112在一个运动周期内生成多个微液滴。可选的，步骤S203中，吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下的运动轨迹包括直线段、圆弧段、多边形等多种轨迹中的一种或多种的组合。作为一个可实现的方式，当吐液枪头110的出口端112在一个周期性运动内包括两次瞬时加速运动时，吐液枪头110的运动轨迹为直线或者圆弧。当吐液枪头110的出口端112在一个周期性运动内包括两次以上的瞬时加速运动时，吐液枪头110的出口端112在第二液体内做轨迹为正多边形，包括正三角形、正方形、正五边形、正六边形等。[0142]作为一种可实现的方式，在步骤S203中，吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下的周期运动过程中，吐液枪头110的出口端112的速度大小呈矩形波变化。吐液枪头110的出口端112的速度大小呈矩形波变化，加速阶段结束以后即进入匀速阶段，有利于运动控制机构130实现对吐液枪头110的出口端112的运动状态的精确控制。可选的，表示吐液枪头110的出口端112运动速度大小变化的矩形波的高位时间和低位时间可以是相等的也可以是相异的。进一步，在步骤S203中，吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下的周期运动过程中，吐液枪头110的出口端112的速度大小呈方波变化。表示吐液枪头110的出口端112运动速度大小变化的矩形波的高位时间和低位时间是相等的。表示吐液枪头110的出口端112运动速度大小变化的矩形波处于低位时，吐液枪头110的出口端112的速度为零或具有相对于高位时反方向的速度。如图4所示，更进一步的，所述吐液枪头110的出口端112周期运动的前半周期与后半周期内，所述吐液枪头110的出口端112的速度大小相同，方向相反。在吐液枪头110的出口端112的一个运动周期内包含两次方向相反的瞬时加速运动。[0143]在本实施例中，吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下的运动轨迹是直线段，吐液枪头110的出口端112从直线段的一个端点做瞬时加速运动，从直线段的另一个端

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点做反方向的瞬时加速运动。两次瞬时加速运动的的加速度大小均为a1。在其他的实施例中，吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下的运动轨迹是圆弧段或者多边形。进一步，步骤S203中，吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下周期运动的频率介于0.1赫兹至200赫兹之间，在工程上容易实现。[0144]如图4及图5所示，在本发明一个具体的实施例中，流体驱动机构120控制第一液体以恒定的流速排出吐液枪头110的出口端112。运动控制机构130控制吐液枪头110的输出端做运动轨迹为直线、速度呈方波变化的周期运动。当吐液枪头110的出口端112的速度方向发生改变时，吐液枪头110的出口端112的瞬时加速度达到最大值。附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195也在吐液枪头110的出口端112的瞬时加速度达到最大值时脱离吐液枪头110的出口端112而形成微液滴199。由于第一液体是以恒定流速排出吐液枪头110的出口端112，当液滴195从吐液枪头110的出口端112脱落时，新的液滴195进入生成状态。当吐液枪头110的出口端112再次反向加速时，新生成的液滴195也从吐液枪头110的出口端112掉落形成新的微液滴199。[0145]本实施例中，吐液枪头110的出口端112的一个运动周期内可生成两个微液滴199，且方波在工程上较易实现。在其他的实施例中，吐液枪头110的出口端112的一个运动周期内生成一个微液滴199。可选的，在实施例中吐液枪头110的出口端112在第二液体699中沿任意方向做轨迹为直线的方波运动，包括：在与吐液枪头110的延伸方向垂直的平面内做轨迹为直线的方波运动、在与吐液枪头110的延伸方向成任意角度的平面内做轨迹为直线的方波运动、沿吐液枪头110的延伸方向做轨迹为直线的方波运动等。在本发明的其他实施例中，吐液枪头110的出口端112的运动轨迹为圆弧段或多边形时，吐液枪头110的出口端112在第二液体699中沿任意方向做轨迹为直线的方波运动，包括：在与吐液枪头110的延伸方向垂直的平面内做轨迹为直线的方波运动、在与吐液枪头110的延伸方向成任意角度的平面内做轨迹为直线的方波运动、沿吐液枪头110的延伸方向做轨迹为直线的方波运动等。[0146]在本发明另一实施例中，在运动控制机构130的带动下，吐液枪头110的出口端112在第二液体液面下做速度大小呈周期变化的运动，在速度大小变化的前半周期与后半周期内，吐液枪头110的出口端112的速度大小均单调变化。单调变化指，在速度大小变化的前半周期或后半周期内，吐液枪头110的出口端112的在后时刻的速度值总是大于等于或者小于等于在前时刻的速度值。例如，在速度大小变化的前半周期内，吐液枪头110的出口端112的速度大小持续增加或部分段持续增加而部分段不变。相应的，在速度大小变化的后半周期内，吐液枪头110的出口端112的速度大小持续减小或部分段持续减小而部分段不变。第一液体从吐液枪头110的出口端112排出后形成附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195。液滴195在吐液枪头110的出口端112运动速度达到一定大小时脱离吐液枪头110的出口端112形成微液滴199。如图6所示，微液滴199在脱离吐液枪头110的出口端112之前的所受到的作用力分别为重力G、第二液体699的浮力f1、第二液体699的粘滞阻力f2以及吐液枪头110的出口端112与液滴195之间的最大附着力f3。微液滴199在脱离吐液枪头110的出口端112之前的质量为m、速度为v、加速度为a2。液滴195在第二液体699的运动过程中受粘滞力f2、重力G、浮力f1及附着力f3的共同作用，即

液滴195脱离吐液枪

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头110的出口端112(即生成一个微液滴199)的条件为

吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3与吐液枪头110的表

面自由能、液滴195的表面张力以及吐液枪头110的几何尺寸有关。将附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195简化为球状。由斯托克斯(Stokes)公式可知，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2＝6πηrv，其中η为第二液体699的粘滞系数，r为液滴195的半径，v为液滴195的运动速度。在微液滴199生成的过程中，一般液滴195的直径范围在皮升至

[0147]

微升的数量级，而第二液体699的粘滞系数一般比较大。故，一般有且

因此，吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做变速周期运动过程中，

液滴195脱离吐液枪头110的出口端112(即生成一个微液滴199)的条件近似为

基于此，本发明提供一种微液滴生成方法，包括以下步骤：[0149]S211，提供具有出口端112的吐液枪头110，吐液枪头110内储存有第一液体；提供储存有第二液体699的微液滴容器60，微液滴容器60具有开口；第一液体与第二液体699为任意互不相溶的两种液体或具有界面反应的两种液体；[0150]S212，吐液枪头110的出口端112由微液滴容器60的开口插入第二液体699的液面下；

[0151]S213，吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做速度大小呈周期变化的运动，在速度大小变化的前半周期与后半周期内，吐液枪头110的出口端112的速度大小均单调变化，同时第一液体由吐液枪头110的出口端112匀速排出，排出吐液枪头110的出口端112的第一液体形成附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195，液滴195在吐液枪头110的出口端112的运动过程中脱离吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下形成微液滴199。

[0152]上述微液滴生成方法，吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做速度大小呈周期变化的运动，在速度大小变化的前半周期与后半周期内，吐液枪头110的出口端112的速度大小均单调变化。运动过程中，第二液体699对液滴195的粘滞力f2随着吐液枪头110的出口端112速度大小的周期变化也呈现出周期变化。当吐液枪头110的出口端112与液滴195之间的最大附着力f3小于第二液体699对液滴195的粘滞力f2时，液滴195不能与吐液枪头110的出口端112同步运动，进而附着在所述吐液枪头110的出口端112的液滴195脱离所述吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下形成微液滴199。本发明所提供的微液滴生成方法，所述吐液枪头110的出口端112在第二液体699的液面下做变速周期运动以产生微液滴199，减小了所述吐液枪头110的出口端112运动时对第二液体699造成的扰动，保证了微液滴199生成过程的稳定性。[0153]在本实施例中，在步骤S213中，第一液体由吐液枪头110的出口端112连续排出。进一步，在步骤S213中，第一液体由吐液枪头110的出口端112以恒定的流速排出，意即在相等的时间间隔内，排出吐液枪头110的出口端112的第一液体体积总是相等的。第一液体由吐液枪头110的出口端112以恒定的流速排出，有利于通过控制吐液枪头110的出口端112的周期性运动实现生成体积大小一致的微液滴199。

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影响液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2的因素中，液滴195的

运动速度v比较容易控制。在脱离吐液枪头110的出口端112而形成微液滴199之前，液滴195与吐液枪头110的出口端112保持同步运动。因此，液滴195的运动速度v可以通过控制吐液枪头110的出口端112的运动速度实现精确控制。控制第一液体以均匀的流速排出吐液枪头110的出口端112，液滴195半径的大小r在固定的时间间隔内也呈现出周期性的变化。影响液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2的因素中，第二液体699的粘滞系数η会在使用过程中在一定范围内变化，但第二液体699的粘滞系数η的变化范围很小。[0155]在不更换吐液枪头110及第一液体的情况下，吐液枪头110的表面自由能、吐液枪头110的几何尺寸及液滴195的表面张力作为影响吐液枪头110的出口端112与液滴195之间最大附着力f3的两个因素是确定的。因此，在不更换吐液枪头110及第一液体的情况下，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3是固定的。当使用多个吐液枪头110同时或者顺次生成微液滴199时，吐液枪头110的表面自由能及吐液枪头110的几何尺寸作为影响吐液枪头110的出口端112与液滴195之间最大附着力f3的两个因素是变化的。但批量加工能够控制吐液枪头110的表面自由能及吐液枪头110的几何尺寸在一定的区间内变化。液滴195的表面张力作为影响吐液枪头110的出口端112与液滴195之间最大附着力f3的另一个因素也只是在很小的范围内变化。吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3只在很小的区间内波动。[0156]因此，只需控制液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2大于吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3的区间值即可。由于在同一批次生成微液滴199的过程中，液滴195半径的大小r应是固定的。一旦实验参数确定，液滴195半径的大小r也就随之确定。吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下的运动速度是变化的。当吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下的运动速度满足v＞f3/6πηr时，液滴195从吐液枪头110的出口端112脱离形成微液滴199。

[0157]吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做速度大小周期变化的运动。控制第一液体以均匀的流速从吐液枪头110的出口端112排出，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195体积也是均匀增大的。将第一个微液滴199从吐液枪头110的出口端112掉落时，微液滴199的半径称为临界半径，微液滴199的速度成为临界速度。调整吐液枪头110的出口端112的运动周期及第一液体排出吐液枪头110的出口端112的流速，以使经过相同的时间间隔(吐液枪头110的出口端112运动周期的倍数)后，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195同时达到临界半径及临界速度，新的微液滴199形成。由于第一液体是以均匀的流速排出吐液枪头110的出口端112，所生成的微液滴199的体积大小相同。[0158]作为一种可实现的形式，在步骤S213中，在一个速度大小变化周期内，吐液枪头110的出口端112的速度大小以中间时刻点为中点呈中心对称。进一步，在步骤S213中，吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下的加速度、速度及运动轨迹均呈周期性变化。更进一步，在步骤S213中，吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下的速度大小呈余弦曲线变化。

[0159]可选的，在步骤S213中，吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下的运动轨迹包括直线段、圆弧段、多边形等多种轨迹中的一种或多种的组合。在步骤S213中，吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下周期运动的频率介于0.1赫兹与200赫兹之间，在

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工程上容易实现。

[0160]以吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做轨迹为圆弧、速度呈余弦变化的周期运动为例，此时吐液枪头110的出口端112实际上做摆动运动，运动位移可以用正弦曲线表示，如图7中曲线a所示。在流体控制机构的驱动下，第一液体以均匀的流速从吐液枪头110的出口端112排出。假设液滴195不脱离吐液枪头110的出口端112。通过计算，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f粘随时间变化如图7中曲线b所示。第一液体以均匀的流速从吐液枪头110的出口端112排出的初始阶段，随着液滴195体积的增大，液滴195的半径r也明显增大。随着液滴195半径r的不断增大，液滴195体积的匀速增大只能引起液滴195半径r的缓慢增大。因此，吐液枪头110的出口端112的前几个摆动周期内，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2的最大值迅速增加，而后逐渐趋于缓慢增加。如图7所示，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2也呈现出与吐液枪头110的出口端112的周期运动相似的周期性，即液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2随吐液枪头110的出口端112的速度变化而变化。在实际工况中，当液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2增大并大于吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3时，液滴195从吐液枪头110的出口端112脱落形成微液滴199。[0161]在本发明一实施例中，如图8所示，控制吐液枪头110的出口端112做轨迹为圆弧、位移呈正弦变化的摆动。在不更换吐液枪头110及第一液体的情况下，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3是固定的。随着附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195半径r不断增大，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2也不断增大。液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2大于吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3的瞬间，液滴195从吐液枪头110的出口端112脱落形成微液滴199，图8中为液滴Ⅰ。进入下一轮微液滴199的生成循环中。[0162]在本实施例中，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3＝1.8×10-4N，吐液枪头110的出口端112的摆动频率是50赫兹。在吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的摆动运动的第二个周期末尾生成第一个微液滴199，图8中为液滴I。在生成第二个微液滴199的初始阶段，虽然吐液枪头110的出口端112的运动速度有所减小，但由于附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195半径r增加较快，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2并没有立刻下降反而呈现出小范围的增加。此后，液滴195半径r缓慢增加，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2主要随吐液枪头110的出口端112的运动速度变化而变化。

[0163]当控制第一液体以均匀流速排出吐液枪头110的出口端112时，吐液枪头110的出口端112在生成上一个微液滴199后的两个运动周期的时刻又生成与上一个微液滴199等体积的新的液滴195，图8中为液滴II。且此时吐液枪头110的出口端112的运动速度也与两个运动周期之前相同。与上一个微液滴199等体积的新的液滴195从吐液枪头110的出口端112脱落。第一液体的匀速排出及吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的摆动运动共同保证了生成微液滴199的体积大小均一性。[0164]在本发明一实施例中，如图9所示，控制吐液枪头110的出口端112做轨迹为圆弧、位移呈正弦变化的摆动。在不更换吐液枪头110及第一液体的情况下，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3是固定的。随着附着在吐液枪头110的出口端112的

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液滴195半径r不断增大，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2也不断增大。液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2大于吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3的瞬间，液滴195从吐液枪头110的出口端112脱落形成微液滴199。进入下一轮微液滴199的生成循环中。[0165]在本实施例中，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3＝1.5×10-4N，吐液枪头110的出口端112的摆动频率是50赫兹。在吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的摆动运动的第一个周期末尾生成第一个微液滴199，图9中为液滴I。在生成第二个微液滴199的初始阶段，虽然吐液枪头110的出口端112的运动速度有所减小，但由于附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195半径r增加较快，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2并没有立刻下降反而呈现出小范围的增加。此后，液滴195半径r缓慢增加，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2主要随吐液枪头110的出口端112的运动速度变化而变化。

[0166]当控制第一液体以均匀流速排出吐液枪头110的出口端112时，吐液枪头110的出口端112在生成上一个微液滴199后的一个运动周期的时刻又生成与上一个微液滴199等体积的新的液滴195，且此时吐液枪头110的出口端112的运动速度也与一个运动周期之前相同。与上一个微液滴199等体积的新的液滴195从吐液枪头110的出口端112脱落，图9中为液滴II。如此循环，生成液滴III、液滴IV等。第一液体的匀速排出及吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的摆动运动共同保证了生成微液滴199的体积大小均一性。[0167]在本发明一实施例中，如图10及图11所示，控制吐液枪头110的出口端112做轨迹为圆弧、位移呈正弦变化的摆动。在不更换吐液枪头110及第一液体的情况下，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3是固定的。随着附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195半径r不断增大，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2也不断增大。液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2大于吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3的瞬间，液滴195从吐液枪头110的出口端112脱落形成微液滴199，图10中为液滴I。进入下一轮微液滴199的生成循环中。[0168]在本实施例中，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3＝1.0×10-4N，吐液枪头110的出口端112的摆动频率是50赫兹。在吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的摆动运动的前半周期的加速阶段生成第一个微液滴199，图10中为液滴I。在生成第二个微液滴199的初始阶段，当吐液枪头110的出口端112的运动速度有所减小，但由于附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195半径r增加较快，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2并没有立刻下降反而呈现出小范围的增加。此后，液滴195半径r缓慢增加，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2主要随吐液枪头110的出口端112的运动速度变化而变化。

[0169]控制第一液体以均匀流速排出吐液枪头110的出口端112。吐液枪头110的出口端112在做位移呈正弦变化的摆动运动的后半周期加速阶段生成第二个微液滴199，图10中为液滴II。此后进入稳定生成微液滴199的阶段。吐液枪头110的出口端112生成第二个微液滴199后的半个运动周期的时刻又生成与第二个微液滴199等体积的新的液滴195，且此时吐液枪头110的出口端112的运动速度也与半个运动周期之前相同。与第二个微液滴199等体积的新的液滴195从吐液枪头110的出口端112脱落，如此循环，生成图10中所示的液滴III、

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液滴IV、液滴V等。第一液体的匀速排出及吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的摆动运动共同保证了生成微液滴199的体积大小均一性。[0170]由上述可知，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195脱离吐液枪头10的出口端112(即生成一个微液滴199)的条件近似为：

在控制第一液体以均匀流速排出吐

液枪头110的出口端112的情况下，所生成的微液滴199的体积大小均一的条件是：微液滴199等时间间隔的从吐液枪头110的出口端112脱落。

[0171]影响吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3的因素包括：吐液枪头110的表面自由能、几何尺寸及第一液体的表面张力。在不更换吐液枪头110及第一液体的情况下，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3是固定的。影响液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2的因素包括：第二液体699的粘滞系数η、液滴195的半径r及液滴195的运动速度v。第一液体匀速排出吐液枪头110的出口端112时，液滴195的半径r由微液滴199生成的间隔时间决定。液滴195在脱离吐液枪头110的出口端112之前与吐液枪头110的出口端112同步运动，可通过运动控制机构130实现精确控制吐液枪头110的出口端112的运动速度。第二液体699的粘滞系数η在液滴195的生成过程中会在一定范围内变化，但第二液体699的粘滞系数η的变化范围很小。如图12所示，曲线a表示吐液枪头110的出口端112的位移变化，曲线b和曲线c为当第二液体699的粘滞系数η在很小的范围内变化时微液滴199的生成过程曲线。当第二液体699的粘滞系数η在很小的范围内变化时，只会在很小范围内改变微液滴199的生成时刻。而不会改变微液滴199的生成时间间隔。如图12所示，曲线b和曲线c所表示的微液滴199的生成时间间隔均为半个周期t/2，保证了所生成微液滴199的体积大小均一性。[0172]如图13所示，在更换吐液枪头110时，或温度变化等引起第一液体的表面张力发生变化时，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3难以精确控制，因此如果生成的微液滴199体积对f3在一定范围内变化不敏感，那么对生成均一尺寸的微液滴199具有重要意义。图13中，曲线a表示吐液枪头110的出口端112的位移变化，曲线b和曲线c为当更换吐液枪头110的情况下微液滴199的生成过程曲线。更换吐液枪头110后，吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3在一定范围内波动会导致液滴195脱落时吐液枪头110的出口端112对应不同的速度。但是当微液滴199的生成达到稳定状态后，液滴195脱落时吐液枪头110的出口端112的速度在每个摆动周期内都是固定的，如图13所示，曲线b和曲线c所表示的微液滴199的生成时间间隔均为半个周期t/2。因此能够保证微液滴199生成的间隔时间是固定的。当第一液体排出吐液枪头110的出口端112的流速固定时，生成的微液滴199的体积是均一的。同时调整第一液体排出吐液枪头110的出口端112的流速及吐液枪头110的出口端112在第二液体699内的摆动频率，即可同时控制均一体积微液滴199的体积大小及生成速率。

[0173]上述实施例中吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的周期运动时，对附着力的最大值f3及粘滞阻力f2的变化具有一定的容忍性，即附着力的最大值f3或粘滞阻力f2在一定范围内变化时，仍然能够生成体积大小均一的微液滴199。当吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的周期运动时，保证生成体积大小均一的微液滴199的前提下，能够容忍的附着力的最大值f3的变化范围称为平台期。平台期的存在对于吐液枪头110的加工

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及微液滴199生成温度的控制具有重要的意义。平台期的存在允许在一定程度内降低吐液枪头110的加工精度要求，即使同批加工的吐液枪头110之间的表面自由能之间存在差异，也能够生成体积大小均一的微液滴199。同理，平台期的存在也允许在一定程度内降低微液滴199生成过程的温度控制要求。

[0174]平台期的存在允许在一定程度内降低吐液枪头110的加工精度要求或微液滴199生成过程的温度控制要求，进一步降低了微液滴199生成过程中的耗材成本及控制成本。上述实施例中吐液枪头110的出口端112的每个运动周期内生成两个微液滴199，容易理解的是，只要吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的周期运动，当吐液枪头110的出口端112的每一个运动周期内生成一个微液滴199或者每两个运动周期内生成一个微液滴199时，仍然对附着力的最大值f3及粘滞阻力f2的变化具有一定的容忍性，也都存在平台期。[0175]由于微液滴199的生成几乎不受微液滴199的重力及惯性力的影响。因此生成微液滴199时，吐液枪头110的出口端112在第二液体699内可沿任意方向做位移呈正弦变化的周期运动。吐液枪头110的出口端112的运动轨迹是弧线、直线或者其他形状的轨迹。[0176]如图14中的(1)所示，在本发明一实施例中，吐液枪头110倾斜插入第二液体699内，吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下摆动生成微液滴199。作为一种可实现的方式，如图14中的(2)所示，吐液枪头110的出口端112在第二液体699内做轨迹为水平直线、位移呈正弦变化的周期运动以生成微液滴199。作为另一种可实现的方式，如图14中的(3)所示，吐液枪头110的出口端112在第二液体699做轨迹为竖直直线、位移呈正弦变化的周期运动以生成微液滴199。[0177]如图15所示，在本发明另一实施例中，在步骤S213中，速度大小变化的一个周期内，吐液枪头110的出口端112在前半周期与后半周期均是匀变速运动。进一步，在步骤S213中，吐液枪头110的出口端112在前半周期与后半周期的加速度大小相等。控制第一液体以均匀流速排出吐液枪头110的出口端112。随着第一液体的连续排出，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195在运动过程中受到的粘滞阻力f2也不断增大。当粘滞阻力f2大于液滴195与吐液枪头110之间附着力的最大值f3时，液滴195从吐液枪头110脱离形成微液滴199。随后进入下一个微液滴199的生成过程中。控制吐液枪头110的出口端112的运动频率及运动速度与第一液体的流速相适配，以保证生成微液滴199的体积均一性。[0178]传统的吐液枪头一般呈直管状。上述直管状的吐液枪头沿自身的延伸方向靠近出口端的一端快速运动时，会打破已经生成的微液滴。为了保持生成的微液滴的完整性，须要降低吐液枪头的振动频率，从而导致微液滴的生成速率降低。[0179]基于此，有必要针对传统的吐液枪头不能兼顾所生成微液滴的完整性及微液滴的生成速率的问题，提供一种能兼顾所生成微液滴的完整性及微液滴的生成速率的吐液枪头。

[0180]本发明一实施例，提供一种用于生成微液滴199的吐液枪头110，其包括具有中空腔体的针梗113及设置于针梗113一端的出口端112。吐液枪头110的出口端112端面的法线与针梗113的延伸方向之间的夹角小于等于90°。在吐液枪头110沿管道主体的延伸方向振动时，微液滴199从吐液枪头110的出口端112掉落后在第二液体699粘滞力及吐液枪头110的出口端112端面的挤压作用下远离出口端112的运动轨迹，避免了微液滴199被出口端112打破，保持了已生成微液滴199的完整性，同时允许吐液枪头110沿管道主体的延伸方向快

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速振动以快速生成微液滴199。[0181]如图16所示，作为一种可实现的方式，吐液枪头110呈直管状，吐液枪头110的出口端112为斜切结构。将吐液枪头110的出口端112进行斜切，兼顾所生成微液滴199的完整性及微液滴199的生成效率的同时，具有结构简单、易于实现、制造成本低、批量加工精度高的特点。进一步，吐液枪头110的出口端112端面的法线与针梗113的延伸方向之间的夹角介于15°-75°之间，可根据实际工况设计吐液枪头110的出口端112端面的法线与针梗113的延伸方向之间的夹角。吐液枪头110的出口端112端面的法线与针梗113的延伸方向之间的夹角不宜过大或过小，以免影响微液滴199的生成或打破微液滴199。更进一步的，吐液枪头110的出口端112端面的法线与针梗113的延伸方向之间的夹角介于30°-60°之间。具体的，吐液枪头110的出口端112端面的法线与针梗113的延伸方向之间的夹角为45°。45°角不仅能够保证微液滴199的顺利生成，还能够有效的将已生成的微液滴199挤离开出口端112的运动轨迹，避免吐液枪头110的出口端112打破已生成的微液滴199。[0182]如图17所示，作为另一种可实现的方式，针梗113靠近吐液枪头110的出口端112的部分包括弯折结构。将吐液枪头110的出口端112进行弯折，兼顾所生成微液滴199的完整性及微液滴199的生成效率的同时，具有结构简单、易于实现、制造成本低、批量加工精度高的特点。进一步，吐液枪头110的出口端112端面的法线与针梗113的延伸方向之间的夹角介于15°-75°之间，可根据实际工况设计吐液枪头110的出口端112端面的法线与针梗113的延伸方向之间的夹角。吐液枪头110的出口端112端面的法线与针梗113的延伸方向之间的夹角不宜过大或过小，以免影响微液滴199的生成或打破微液滴199。更进一步的，吐液枪头110的出口端112端面的法线与针梗113的延伸方向之间的夹角介于30°-60°之间。具体的，吐液枪头110的出口端112端面的法线与针梗113的延伸方向之间的夹角为45°。45°角不仅能够保证微液滴199的顺利生成，还能够有效的将已生成的微液滴199挤离开出口端112的运动轨迹，避免吐液枪头110的出口端112打破已生成的微液滴199。[0183]可选的，针梗113靠近吐液枪头110的出口端112的弯折结构具有折线段、圆弧段、光滑曲线段、直线段等中的一种或者组合。如图17所示，在本实施例中。针梗113靠近吐液枪头110的出口端112的部分具有过渡圆弧段，具体是圆弧段与直线段的组合。在加工过程中将直管状的吐液枪头110进行设定角度的圆弧弯折即可，加工方便。[0184]如图18及图19所示，本发明一实施例提供的吐液枪头110还包括针栓114，针栓114具有沿针栓114的延伸方向贯通针栓114的储液槽115。储液槽115的一端与针梗113远离吐液枪头110的出口端112的一端连通，针栓114远离针梗113的一端是吐液枪头110的入口端111。针栓114与针梗113之间固定连接。用于生成微液滴199的第一液体可以提前储存在针栓114内，能够实现连续、批量的生成微液滴199。进一步，针栓114远离针梗113的一端内表面开设有卡槽116。卡槽116能够实现与流体驱动机构120的可拆卸连接。便于吐液枪头110的更换。

[0185]本发明还一种微液滴199生成装置，用于在第二液体699液面下生成微液滴199。微液滴199生成装置包括流体驱动机构120、运动控制机构130及上述方案任一项所述的吐液枪头110。吐液枪头110的内部储存有第一液体，吐液枪头110具有出口端112及入口端111。流体驱动机构120与吐液枪头110的入口端111连接，用于将储存在吐液枪头110内部的第一液体从吐液枪头110的出口端112排出。运动控制机构130用于控制吐液枪头110的出口端

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112在第二液体699的液面下产生设定轨迹或设定速度或设定加速度的运动，以使排出吐液枪头110的出口端112的第一液体克服表面张力及附着力在第二液体699内形成微液滴199。[0186]本发明提供的吐液枪头110在第二液体699液面下运动的过程中生成微液滴199。作为一种可实现的方式，吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做速度大小呈方波变化的运动，加速度大小为a1。第一液体从吐液枪头110的出口端112排出后形成附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195。液滴195在吐液枪头110的出口端112瞬时加速的瞬间脱离吐液枪头110的出口端112形成微液滴199。如图3所示，微液滴199在脱离吐液枪头110的出口端112之前的所受到的作用力分别为重力G、第二液体699的浮力f1、第二液体699的粘滞阻力f2以及吐液枪头110的出口端112与液滴195之间的最大附着力f3。微液滴199在脱离吐液枪头110的出口端112之前的质量为m、加速度大小为a2。根据牛顿第二运动定律，易得出

吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3与吐液枪头110的表面自由能、液滴195的表面张力以及吐液枪头110的几何尺寸有关。吐液枪头110的出口端112做瞬时加速运动时，吐液枪头110的出口端112对液滴195附着力的方向与加速度的方向相同。将附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195简化为球状。由斯托克斯(Stokes)公式可知，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2＝6πηrv，其中η为第二液体699的粘滞系数，r为液滴195的半径，v为液滴195的运动速度。在吐液枪头110的出口端112做瞬时加速之前液滴195的速度为零，因此液滴195在吐液枪头110的出口端112瞬时加速的瞬间在第二液体699中受到的粘滞阻力f2为零或极小。在微液滴199生成的过程中，一般液滴195的直径范围在皮升至微升的数量级，且液滴195的重力G和第二液体699的浮力f1方向相反，因此液滴195的重力G与第二液体699的浮力f1的矢量和约为零。即存在

由牛顿第二运动定律可知，吐液枪头110的出口端112做瞬时加速

运动时，液滴195在第二液体699中能达到的最大加速度为a2≈f3/m，其中m为液滴195的质量。液滴195脱离吐液枪头110的出口端112(即生成一个微液滴199)的条件近似为：a2≈(f3/m)＜a1。

[0188]在运动控制机构130的带动下，能够精确控制吐液枪头110的出口端112瞬时加速度的大小。只要控制吐液枪头110的出口端112每次瞬时加速度的值均较大，吐液枪头110的出口端112做瞬时加速运动能够有效的生成液滴195。可选的，在吐液枪头110的出口端112的一个运动周期内，形成一个或两个或多个微液滴199。[0189]如图20所示，在本发明一实施例中，吐液枪头110的出口端112端面的法线与管道主体的延伸方向之间的夹角为45°，吐液枪头110的出口端112呈斜切结构。第二液体699的液面朝上，吐液枪头110竖直布置。吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做轨迹为竖直线段、速度大小呈方波变化的运动。在吐液枪头110的出口端112的一个运动周期内生成一个微液滴199。吐液枪头110内储存有第一液体。流体驱动机构120控制吐液枪头110在吐液枪头110的每个运动周期内从出口端112排出等体积的第一液体。当附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195到达设定体积大小时，吐液枪头110的出口端112由上极限位置以大小为a1的加速度向下瞬时加速，同时附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195脱离吐液枪头110的出口端112形成微液滴199。在第二液体699粘滞力及吐液枪头110的出口端

[0187]

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112端面的挤压作用下，微液滴199远离出口端112的运动轨迹而靠近吐液枪头110的侧壁。吐液枪头110的出口端112继续向下运动，与此同时第一液体仍然排出吐液枪头110的出口端112形成附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195。当吐液枪头110的出口端112运动至下极限位置时，吐液枪头110的出口端112由下极限位置向上运动。在吐液枪头110的出口端112由下极限位置向上运动的过程中第一液体仍然排出吐液枪头110的出口端112，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195体积增大。当吐液枪头110的出口端112运动至上极限位置时，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195体积大小与上一次脱落的微液滴199的体积大小相等。吐液枪头110的出口端112再次由上极限位置以大小为a1的加速度向下瞬时加速形成新的微液滴199，如此循环。[0190]如图21所示，在本发明一实施例中，吐液枪头110的出口端112端面的法线与管道主体的延伸方向之间的夹角为45°，吐液枪头110的出口端112呈斜切结构。第二液体699的液面朝上，吐液枪头110竖直布置。吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做轨迹为竖直线段、速度大小呈方波变化的运动。在吐液枪头110的出口端112的一个运动周期内生成两个微液滴199。吐液枪头110内储存有第一液体。流体驱动机构120控制第一液体以均匀流速从出口端112排出。当附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195到达设定体积大小时，吐液枪头110的出口端112由上极限位置以大小为a1的加速度向下瞬时加速，同时附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195脱离吐液枪头110的出口端112形成微液滴199。在第二液体699粘滞力及吐液枪头110的出口端112端面的挤压作用下，微液滴199远离出口端112的运动轨迹而靠近吐液枪头110的侧壁。吐液枪头110的出口端112继续向下运动。与此同时第一液体仍然排出吐液枪头110的出口端112形成附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195体积增大。[0191]当吐液枪头110的出口端112运动至下极限位置时，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195体积大小与上一次脱落的微液滴199的体积大小相等。吐液枪头110的出口端112由下极限位置以大小为a1的加速度向上瞬时加速，附着在出口端112的液滴195脱离出口端112形成新的微液滴199。吐液枪头110的出口端112处于下极限位置时生成的微液滴199在出口端112的附着力的作用下只向上运动一小段距离，便开始在第二液体699中逐渐降落。在吐液枪头110的出口端112由下极限位置向上运动的过程中第一液体仍然排出吐液枪头110的出口端112，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195体积增大。当吐液枪头110的出口端112运动至上极限位置时，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195体积大小与上一次脱落的微液滴199的体积大小相等。吐液枪头110的出口端112再次由上极限位置以大小为a1的加速度向下瞬时加速形成新的微液滴199，如此循环。当吐液枪头110的出口端112再次由上极限位置向下运动时，若在出口端112正下方的轨迹范围内仍然存在微液滴199，则由附着在出口端112的液滴195撞击已生成的微液滴199，已生成的微液滴199沿出口端112端面的法线运动以远离出口端112的运动轨迹。

[0192]本发明提供的吐液枪头110在第二液体699液面下运动的过程中生成微液滴199。作为另一种可实现的方式，吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做位移呈正弦变化的运动。第一液体从吐液枪头110的出口端112排出后形成附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195。液滴195在吐液枪头110的出口端112运动速度达到一定大小时脱离吐液枪头110的出口端112形成微液滴199。如图6所示，微液滴199在脱离吐液枪头110的出口端

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112之前的所受到的作用力分别为重力G、第二液体699的浮力f1、第二液体699的粘滞阻力f2以及吐液枪头110的出口端112与液滴195之间的最大附着力f3。微液滴199在脱离吐液枪头110的出口端112之前的质量为m、速度为v、加速度为a2。液滴195在第二液体699的运动过程中受粘滞力f2、重力G、浮力f1及附着力f3的共同作用，即

液滴

195脱离吐液枪头110的出口端112(即生成一个微液滴199)的条件为

吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3与吐液枪头110的表面自由能、液滴195的表面张力以及吐液枪头110的几何尺寸有关。将附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195简化为球状。由斯托克斯(Stokes)公式可知，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2＝6πηrv，其中η为第二液体699的粘滞系数，r为液滴195的半径，v为液滴195的运动速度。在微液滴199生成的过程中，一般液滴195的直径范围在皮升至微升的数量级，而第二液体699的粘滞系数一般比较大。故，一般有

且

[0193]

因此，吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做变速周期运动过程中，

液滴195脱离吐液枪头110的出口端112(即生成一个微液滴199)的条件近似为

可

选的，在吐液枪头110的出口端112的一个运动周期内，形成一个或两个或多个微液滴199。[0194]如图22所示，在本发明一实施例中，吐液枪头110的出口端112端面的法线与管道主体的延伸方向之间的夹角为45°，针梗113靠近吐液枪头110的出口端112的部分是弯折结构。第二液体699的液面朝上，吐液枪头110竖直布置。吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做轨迹为竖直线段、位移呈正弦变化的运动。在吐液枪头110的出口端112的一个运动周期内生成一个微液滴199。吐液枪头110内储存有第一液体。流体驱动机构120控制吐液枪头110在吐液枪头110的每个运动周期内从出口端112排出等体积的第一液体。在吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的直线运动的加速下降阶段生成第一个微液滴199。在生成第二个微液滴199的初始阶段，虽然吐液枪头110的出口端112存在向下减速阶段，但由于附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195半径r增加较快，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2并没有立刻下降反而呈现出小范围的增加。此后，液滴195半径r缓慢增加，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2主要随吐液枪头110的出口端112的运动速度变化而变化。吐液枪头110的出口端112下降至极限位置后开始上升，与此同时，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195的体积不断增大。[0195]当控制第一液体以均匀流速排出吐液枪头110的出口端112时，吐液枪头110的出口端112在生成上一个微液滴199后的一个运动周期的时刻又生成与上一个微液滴199等体积的新的液滴195，且此时吐液枪头110的出口端112的运动速度也与一个运动周期之前相同。与上一个微液滴199等体积的新的液滴195从吐液枪头110的出口端112脱落，如此循环。第一液体的匀速排出及吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的摆动运动共同保证了生成微液滴199的体积大小均一性。当吐液枪头110的出口端112再次由上极限位置向下运动时，若在出口端112正下方的轨迹范围内仍然存在微液滴199，则由附着在出口端112的液滴195撞击已生成的微液滴199，已生成的微液滴199沿出口端112端面的法线运动以远离

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出口端112的运动轨迹。[0196]如图23所示，在本发明一实施例中，吐液枪头110的出口端112端面的法线与管道主体的延伸方向之间的夹角为45°，针梗113靠近吐液枪头110的出口端112的部分是弯折结构。第二液体699的液面朝上，吐液枪头110竖直布置。吐液枪头110的出口端112在第二液体699液面下做轨迹为竖直线段、位移呈正弦变化的运动。在吐液枪头110的出口端112的一个运动周期内生成两个微液滴199。吐液枪头110内储存有第一液体。流体驱动机构120控制第一液体以均匀流速从出口端112排出。随着附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195半径r不断增大，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2也不断增大。当吐液枪头110的出口端112处于向下加速阶段时，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2大于吐液枪头110的出口端112与液滴195之间附着力的最大值f3，液滴195从吐液枪头110的出口端112脱落形成微液滴199。在第二液体699粘滞力及吐液枪头110的出口端112端面的挤压作用下，微液滴199远离出口端112的运动轨迹而靠近吐液枪头110的侧壁。[0197]吐液枪头110的出口端112继续向下运动，吐液枪头110的出口端112下降至极限位置后开始上升。与此同时第一液体仍然排出吐液枪头110的出口端112形成附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195体积增大。在生成第二个微液滴199的初始阶段，当吐液枪头110的出口端112的运动速度有所减小，但由于附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195半径r增加较快，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2并没有立刻下降反而呈现出小范围的增加。此后，液滴195半径r缓慢增加，液滴195在第二液体699中运动时所受到的粘滞阻力f2主要随吐液枪头110的出口端112的运动速度变化而变化。

[0198]半个周期的时间间隔后，吐液枪头110的出口端112处于向上加速阶段。附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195体积大小与上一次脱落的微液滴199的体积大小相等，同时吐液枪头110的出口端112的速度大小也与半个周期前相同，附着在出口端112的液滴195脱离出口端112形成新的微液滴199。吐液枪头110的出口端112处于向上加速阶段时生成的微液滴199在出口端112的附着力的作用下只向上运动一小段距离，便开始在第二液体699中逐渐降落。与此同时第一液体仍然排出吐液枪头110的出口端112形成附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195，附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195体积增大。半个周期的时间间隔后，吐液枪头110的出口端112处于向下加速阶段。附着在吐液枪头110的出口端112的液滴195体积大小与上一次脱落的微液滴199的体积大小相等，同时吐液枪头110的出口端112的速度大小也与半个周期前相同，附着在出口端112的液滴195脱离出口端112形成新的微液滴199，如此循环。控制第一液体以均匀流速排出吐液枪头110的出口端112。吐液枪头110的出口端112在做轨迹为竖直线段、位移呈正弦变化的运动的后半周期加速阶段生成第二个微液滴199后，进入稳定生成微液滴199的阶段。第一液体的匀速排出及吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的摆动运动共同保证了生成微液滴199的体积大小均一性。当吐液枪头110的出口端112再次由上极限位置向下运动时，若在出口端112正下方的轨迹范围内仍然存在微液滴199，则由附着在出口端112的液滴195撞击已生成的微液滴199，已生成的微液滴199沿出口端112端面的法线运动以远离出口端112的运动轨迹。[0199]吐液枪头110的截面尺寸一般是微米级别的，传统的表面处理方法多用于尺寸较大的零件，不能完全适用于尺寸较小的吐液枪头110。

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基于此，有必要针对传统的表面处理方法多用于尺寸较大的零件，不能完全适用

于尺寸较小的吐液枪头110的问题，提供一种适用于微米尺寸级别吐液枪头110的吐液枪头110表面处理方法。[0201]如图24所示，本发明一实施例提供一种吐液枪头110表面处理方法，用于对吐液枪头110进行表面处理，包括以下步骤：[0202]S260，对所述吐液枪头110进行硅烷化处理；[0203]S270，使用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理所述吐液枪头110；[0204]S280，烘干所述吐液枪头110。[0205]上述吐液枪头110表面处理方法，硅烷化处理降低吐液枪头110的表面自由能并将吐液枪头110的表面自由能控制在一定区间内，降低了吐液枪头110的表面特性对微液滴199生成过程的影响。[0206]如图25所示，在本发明一实施例中，在步骤S260前还包括步骤S240，预处理所述吐液枪头110。所述步骤S240中，所述预处理包括对所述吐液枪头110进行脱脂、去污或清洗等操作中的一种或几种。对吐液枪头110进行脱脂、去污及清洗能够有效去除在前序加工的过程中附着在吐液枪头110表面的污染物或干扰物。进一步，所述步骤S240中，使用超声波振荡对吐液枪头110表面进行辅助脱脂、辅助去污或辅助清洗。在超声波环境中对吐液枪头110进行脱脂、去污及清洗，将化学手段与机械手段配合使用，保证了吐液枪头110表面预处理的效果。具体的，所述步骤S240中，吐液枪头110是不锈钢材质，使用不锈钢清洗剂清洗所述吐液枪头110。不锈钢清洗剂对不锈钢材质的吐液枪头110具有更高的清洁效果。在其他的实施例中，对吐液枪头110表面的预处理还可以是其他能够实现吐液枪头110表面清洁的方法。在本发明其他的实施例中，吐液枪头110为石英毛细管、玻璃管、双纤毛细管等中的一种。

[0207]在本发明一实施例中，步骤S240之后且在所述步骤S260之前还包括步骤S250电解抛光所述吐液枪头。电解抛光降低较小尺寸的吐液枪头110的表面粗糙度，以使吐液枪头110的表面质量达到硅烷化的要求。电解抛光对于吐液枪头110的表面质量至关重要，是不锈钢材质的吐液枪头110表面质量达标的关键。在本发明一实施例中，不锈钢材质的吐液枪头110做阳极，在电解液中使用不溶性铜等作为阴极。两级同时浸入到电解槽中，通直流电而选择性的溶解做阳极的吐液枪头110，进而达到对吐液枪头110的表面进行抛光的目的。在本实施例中，对吐液枪头110进行电解抛光时的工艺参数如下表：[0208]电解抛光工艺参数表

[0209]

通电电压12V通电时间30s脉冲频率60HZ电解温度50℃通电电流＜1A/cm2电解液50％-60％磷酸[0210]电解抛光工艺中，使用的吐液枪头110的内径是60μm，外径为150μm。电解抛光结束后，放在金相显微镜下放大50倍观测，无明显划痕。[0211]通过所述步骤S260，可以在吐液枪头110表面形成无定型硅膜，优选为通过化学气相沉积的方法在吐液枪头110表面形成无定型硅膜。无定型硅膜的厚度优选为100埃至1000埃。

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如图25所示，在本发明一实施例中，所述步骤S260包括：

[0213]S261，使用去离子水清洗或浸泡所述吐液枪头110；[0214]S262，使用硅烷化试剂处理所述吐液枪头110；[0215]S263，使用去离子水清洗或浸泡所述吐液枪头110。

[0216]在硅烷化之前使用去离子水清洗或浸泡电解后的吐液枪头110，以去除吐液枪头110表面的污渍及静电。硅烷化处理降低吐液枪头110的表面自由能并将吐液枪头110的表面自由能控制在一定区间内，降低了吐液枪头110的表面特性对微液滴199生成过程的影响。在硅烷化之后使用去离子水清洗或浸泡硅烷化后的吐液枪头110，以去除吐液枪头110表面的污渍及静电。所述步骤S262中，优选为使用硅烷化试剂，通过化学气相沉积的方法在吐液枪头110表面形成无定型硅膜。硅烷化试剂优选为四氢化硅气体，更优选包括四氢化硅和作为掺杂剂的氢化磷的混合气体。通过在吐液枪头110表面形成一层无定型硅处理膜，以降低吐液枪头110的表面自由能。

[0217]本实施例中不锈钢表面硅烷化处理的具体步骤如下：将电解后不锈钢材质的吐液枪头110放入化学气相沉积室，清除吐液枪头110表面水汽，将化学气相沉积室抽至真空；将四氢化硅与氢化磷混合气体通入，气相沉积气压控制范围在0.1Pa-500Pa；控制气相沉积温度在180℃-500℃，进行化学气相沉积；沉积时间0.4h-8h；沉积完成后，通入氮气，降至室温。具体的，混合气体中所述四氢化硅的体积百分比为95.0％-99.9％，混合气体中所述氢化磷的体积百分比为0.1％-5.0％。[0218]如图25所示，所述步骤S270包括：[0219]S271，使用体积分数为0.5％-1.5％的焦碳酸二乙酯水溶液对所述吐液枪头110浸泡10min-20min；[0220]S272，对所述吐液枪头110进行高压灭菌。

[0221]使用体积分数为1％的DEPC水溶液浸泡吐液枪头110以保证吐液枪头110的表面无核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)及脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)等，为后续使用吐液枪头110的操作减少干扰。对所述吐液枪头110进行高压灭菌能够有效去除残留在吐液枪头110表面的DPEC水溶液，同时去除DPEC水溶液未除净的RNase及DNase等。[0222]使用体积分数为1％的DEPC水溶液浸泡所述吐液枪头110的时间可视具体工况而定。进一步，所述步骤S271中，使用体积分数为1％的DEPC水溶液浸泡所述吐液枪头110，时间为15min。经测试，15min足以将吐液枪头110表面的RNase及DNase去除干净。更进一步的，所述步骤S280中，使用氮气净化炉进一步净化吐液枪头110，对吐液枪头110进行净化、干燥及烘烤。烘干所述吐液枪头110时使用氮气做保护气体。使用氮气做保护气体，能够有效避免环境中的化学性质相对活跃的气体与吐液枪头110的表面之间发生化学反应，实现对吐液枪头110的有效保护。

[0223]在本发明一个具体的实施例中，电解抛光工艺中，使用的吐液枪头110的内径是60μm，外径为150μm。将电解后的吐液枪头110在去离子水中浸泡5min。然后将吐液枪头110放入化学气相沉积室内、抽真空后通入四氢化硅与氢化磷混合气体。控制气相沉积气压在300±20Pa，控制气相沉积温度在350±20℃。混合气体中所述四氢化硅的体积百分比为97.0％，混合气体中所述氢化磷的体积百分比为3.0％。沉积时间2h，沉积完成后，通入氮气，降至室温。使用去离子水清洗硅烷化后的吐液枪头110。使用1％的DEPC水溶液对整个吐

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液枪头110浸泡15min以及对吐液枪头110进行高压灭菌。最后对吐液枪头110放入氮气净化炉进行表面清洁。

[0224]使用本发明实施例中提供的吐液枪头110表面处理方法批量处理18根相同尺寸的吐液枪头110，然后使用18根吐液枪头110分别进行液滴195悬挂实验。使用流体控制机构将第一液体从吐液枪头110的出口端112以1.0nL/s的流速排出。从上一个微液滴199掉落开始计时，每根吐液枪头110计算100个微液滴199的掉落时间。18个吐液枪头110分别对应的100个液滴195掉落的平均时间数据如下表：[0225]液滴掉落时间统计表

[0226]

[0227]

18个吐液枪头110分别对应的微液滴199平均掉落时间的相对变化范围能够直接

反映18个吐液枪头110之间的表面自由能的相对变化范围。由上述实验数据可得出，使用本发明的实施例提供的吐液枪头110表面处理方法批量处理后的吐液枪头110的表面自由能的标准差为1.33％。足以满足各类生成微液滴199的体积均一性要求。[0229]在本发明一实施例中，吐液枪头110的一端为出口端112，所述吐液枪头表面处理方法用于对吐液枪头110的出口端112及外侧壁进行表面处理。同时对吐液枪头110的出口端112及外侧壁进行表面处理，在微液滴199的生成过程中，吐液枪头110的出口端及外侧壁接触已生成的微液滴199后，均一的表面能够有效的推开微液滴199，避免打破微液滴199。[0230]使用吐液枪头注射/喷射法时，吐液枪头的出口端在油相组合物的液面下生成微液滴。传统的油相组合物在使用过程中，粘度等物理性质变化比较大，所生成微液滴的体积大小均一性较差。[0231]基于此，有必要针对吐液枪头注射/喷射法中使用传统的油相组合物，所生成的微液滴体积大小均一性较差的问题，提供一种能够保证微液滴体积大小均一性的油相组合物及其处理方法。

[0232]本发明提供一种微液滴生成用油相组合物，即上述的第二液体699，包括以下组

[0228]

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分：

矿物油，油相组合物中矿物油的体积百分比为88％-98.5％；

[0234]表面活性剂，表面活性剂包括含链状烷基的硅氧链非离子型表面活性剂。

[0235]上述包括矿物油及含链状烷基的硅氧链非离子型表面活性剂的微液滴生成用油相组合物的密度小于1g/ml，能够允许大部分类型的第一液体脱离吐液枪头110的出口端112形成微液滴199后在第二液体699中下降。含链状烷基的硅氧链非离子型表面活性剂能够防止众多微液滴199之间相互融合。[0236]在本发明一实施例中，油相组合物中含链状烷基的硅氧链非离子型表面活性剂的体积百分比为1.5％-12％。进一步，含链状烷基的硅氧链非离子型表面活性剂包括

和

中的一种或两种。在一实施例中，表面活性剂还包括链

状烷烃酯，油相组合物中链状烷烃酯与油相组合物的质量体积比为0.015g/mL-0.05g/mL。进一步的，链状烷烃酯包括二聚羟基硬脂酸酯(PEG-30)、硬脂酸甘油、聚乙二醇(30)二聚羟基硬脂酸酯(P135)等中的一种或多种。具体的，链状烷烃酯为聚乙二醇(30)二聚羟基硬脂酸酯(P135)。在本实施例中，油相组合物中含链状烷基的硅氧链非离子型表面活性剂的体积百分比为1.5％-5.0％。在上述方案中，含链状烷基的硅氧链非离子型表面活性剂为在矿物油中，气体有一定量的溶解度。而且是和气体及矿物油的温度有关。例如，在室温下，空气会溶解在矿物油中，并且是不可见的。矿物油中溶解气体会影响矿物油的粘度、体积模量、热传导、边界润滑等物理性能，形成发泡和空泡现象。如果矿物油中的气体含量超过饱和，可见的气泡就会形成并悬浮在矿物油中，矿物油就会变得很模糊。这被称为夹带气体。气泡慢慢地上升到矿物油表面。在油膜中，气体的气泡会导致油膜的连续性，从而降低油膜的防止其他相接触的能力。例如在PCR反应过程中，温度会升高到95℃。矿物油中的气体溶解度降低，矿物油中的气体含量高于饱和值，这时就会有气泡产生。气泡会上升到矿物油表面，最终破裂。但在这个过程中气泡会影响荧光信号的采集。此外，若气泡产生时与微液滴199相互作用，会影响微液滴199的稳定性，促进微液滴199之间的融合反应。[0238]本发明还提供一种油相组合物的处理方法，用于处理上述方案任一项所述的油相组合物。油相组合物的处理方法包括加热油相组合物，同时将油相组合物置于负压及超声波振动的环境中。在负压环境中，使溶解在油相组合物中的空气及其他气体溢出，最大程度的降低空气及其他气体在油相组合物中的溶解量。超声波能够促进溶解在油相组合物中的气体的溢出。当微液滴199内包括水相时，生成微液滴199后，在后续对微液滴199进行操作时，可能会有水分溶解在油相组合物中。使微液滴199大小发生改变，会影响微液滴199的位置排列，进而影响到对微液滴199的实时检测。进一步，在所述油相组合物的处理方法还包括使所述油相组合物达到水饱和的步骤。具体的，所述使油相组合物达到水饱和的步骤包括：在加热油相组合物前，在油相组合物中加入蒸馏水。油相组合物的加热过程结束后，油相组合物在25℃-35℃环境下自然冷却。将蒸馏水加入油相组合物中同时加热，使油相组合物达到水饱和。在室温下去掉不能溶解的水。在生成微液滴199之前油相组合物已经处于水饱和状态，最大程度降低了水相的微液滴199中的水分进入油相组合物的量。更进一步，使用氮气保护冷却后的油相组合物。氮气在以矿物油为主的油相组合物中溶解度很低。使用氮气做保护气体，能够防止在储存油相组合物的过程中环境中的空气或其他气体因溶解在

[0237][0233]

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油相组合物中而降低油相组合物的品质。作为一种可实现的方式，当储存油相组合物的器皿内有剩余空间时，将剩余空间内填充满氮气。[0239]方案一：实验探索在不同组分的油相组合物(第二液体699)中所生成微液滴199的体积大小均一性。使用上述吐液枪头110的出口端112在油相组合物(第二液体699)内做周期性瞬时加速运动的方法，使吐液枪头110内的第一液体脱离吐液枪头110的出口端112在油相组合物(第二液体699)内形成微液滴199。方案一中，第一液体为水相，油相组合物(第二液体699)的组分如下表：

[0240]

[0241][0242]

如图26及图27所示的实验结果，图26中虚线框内的微液滴199的体积大小均一性

较好，分别对应实施例1、实施例2、实施例3及实施例4所示的油相组合物(第二液体699)的

的体积百分数增大至

组分。如图28所示，当油相组合物(第二液体699)中699)中

15％及16％时，所生成微液滴199的体积大小均一性较差。易得出，当油相组合物(第二液体

的体积百分比为1.5％-12％时，所生成微液滴199的体积大小均一性

较好。方案二：实验探索在不同组分的油相组合物(第二液体699)中所生成微液滴199的热稳定性。微液滴199的生成方法与实施例1-6相同。使含有微液滴199的多组油相组合物(第二液体699)分别经历50次高低温循环。高低温循环过程包括：以6℃/s的温升速率升至95℃并维持10s，然后以6℃/s的温降速率降至65℃并维持10s。方案二中所使用的油相组合物(第二液体699)的组分如下表：

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[0243]

[0244]

[0245]

如图29及图30所示的实验数据，图29中虚线框内的微液滴199的体积大小均一性

的体积百分比为1.5％-12％、P135的

较好。当油相组合物(第二液体699)中

含量小于5％时，如图29及图30所示，所生成微液滴199的体积大小均一性均较好。但当P135

的含量大于5％时，如图29及图31所示，所生成微液滴199的体积呈现出大小不一的特点。图29中实线内的微液滴199的热稳定性较好。当油相组合物(第二液体699)中P135的含量介于1.5％-5.0％、

的体积百分比为1.5％-5.0％时，如图32所示，微液滴199的热

的体积百分比为超过5.0％稳定性较好。当油相组合物(第二液体699)中时，如图33所示，微液滴199的热稳定性较差。

[0246]由上述两个方案中的22个实施例的实验数据可以得出，油相组合物(第二液体699)中以矿物油为主要成分、

的体积百分比为1.5％-5.0％、P135的含量为

1.5％-5.0％时，第一液体在油相组合物(第二液体699)中所生成的微液滴199的体积大小均一性较好且微液滴199的热稳定性也较好。

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的潜在替代成分。

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方案三：实验探索

全部或者部分由

与

同属于含链状烷基的硅氧链非离子型表面活性剂，使用方案一的实验条

件，

[0248]

代替。方案三中油相组合物(第二液体

699)的组分如下表：

[0249]

如图34所示，使用上表中实施例23至实施例28所示不同组分的油相组合物(第二

液体699)进行微液滴199生成实验，所生成的微液滴199均具有较好的体积均一性。[0250]方案四：实验探索P135的潜在替代成分。聚乙二醇(30)二聚羟基硬脂酸酯(P135)与二聚羟基硬脂酸酯(PEG-30)及硬脂酸甘油均属于链状烷烃酯。使用方案二的实验条件，P135全部或者部分由二聚羟基硬脂酸酯(PEG-30)及硬脂酸甘油代替。方案四中油相组合物(第二液体699)的组分如下表：

[0251]

[0252]

如图35及图36所示，使用上表中实施例29至实施例32所示不同组分的油相组合物

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(第二液体699)进行微液滴199生成及热稳定性实验，所生成的微液滴199均具有较好的体积均一性及较好的热稳定性。[0253]生成微液滴的过程中，吐液枪头的出口端处于运动状态，排出液体的流速不稳定、不可控。所生成的微液滴体积大小呈现随机性。[0254]基于此，有必要针对吐液枪头在运动时因排出液体的流速不稳定、不可控导致的微液滴体积大小呈现出随机性的问题，提供一种能够保证吐液枪头按照设定流速排出液体的流体驱动机构。

[0255]在微液滴199的生成过程中，第一液体以设定的流速排出吐液枪头110的出口端112。吐液枪头110的出口端112做包含瞬时加速的周期运动时，不仅能够有效的生成微液滴199，且便于对所生成微液滴199的大小进行控制。吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的周期运动时，不能能够有效的生成微液滴199，且所生成微液滴199具有良好的体积大小均一性。在上述两种生成微液滴199的过程中，第一液体在流体驱动机构120的驱动下以设定的流速排出吐液枪头110的出口端112。[0256]如图37及图38所示，本发明提供一种流体驱动机构120，用于微液滴生成系统中，包括变容积组件121及动力组件122。变容积组件121包括注射筒1211及推杆1212。推杆1212与注射筒1211的内壁滑动配合，注射筒1211内能够储存驱动液体1214。注射筒1211具有进出液口1213，进出液口1213用于连通储存有第一液体190的吐液枪头110的入口端111。动力组件122与推杆1212传动连接，用于驱动推杆1212沿注射筒1211的延伸方向滑动。在微液滴199的生成过程中，动力组件122驱动推杆1212挤压储存在注射筒1211内驱动液体1214，驱动液体1214挤压储存在吐液枪头110内的第一液体190，进而将第一液体190从吐液枪头110的出口端112排出。本发明提供的流体驱动机构120，利用液体(驱动液体1214)的不可压缩性保证了吐液枪头110的出口端112在高频率振动时仍能按照设定的流速将第一液体190从吐液枪头110的出口端112排出。本发明提供的流体驱动机构120能够精确控制所生成微液滴199体积大小。本发明所提供的流体驱动机构120并不限于上述实施方式，比如，还可以采用蠕动泵、压力驱动泵、气压驱动泵或电渗驱动泵等。[0257]作为一种可实现的方式，注射筒1211的进出液口1213与吐液枪头110的入口端111之间通过细管123连通。注射筒1211内及细管123内储存有驱动液体1214。动力组件122与变容积组件121的推杆1212传动连接，动力组件122用于推动变容积组件121的推杆1212在注射筒1211内滑动。微液滴199的生成过程中，动力组件122推动变容积组件121的推杆1212，推杆1212挤压储存在注射筒1211及细管123内的驱动液体1214，驱动液体1214挤压储存在吐液枪头110内的第一液体190，进而将第一液体190从吐液枪头110的出口端112排出。使用细管123将注射筒1211的进出液口1213与吐液枪头110的入口端111连接，一方面细管123的内径较小，便于通过控制推杆1212的行程实现对排出液体体积的精确控制；另一方面，使用细管123能够灵活布置注射筒1211和吐液枪头110之间的位置及距离，便于在注射筒1211和吐液枪头110之间布置其他的必要设备。[0258]在本发明一实施例中，动力组件122推动推杆1212在注射筒1211内匀速滑动，意即驱动液体1214在推杆1212的推动下以均匀的流速从变容积组件121的进出液口1213排出，通过细管123以均匀的流速进入吐液枪头110。储存在吐液枪头110内的第一液体190在驱动液体1214的推动下，以均匀的流速排出吐液枪头110的出口端112。通过使用驱动液体1214

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做传动介质以及控制推杆1212以均匀的流速排出驱动液体1214，本实施例提供的流体驱动机构120不仅能在吐液枪头110处于静止状态时以均匀的流速将第一液体190由吐液枪头110的出口端112排出。即使吐液枪头110处于快速振动状态下，本实施例提供的流体驱动机构120仍能保证第一液体190从吐液枪头110的出口端112以均匀的流速排出。本实施例提供的流体驱动机构120大大提高了所生成微液滴199的体积大小均一性。[0259]动力组件122的作用是带动推杆1212在注射筒1211内沿远离进出液口1213的方向或者靠近进出液口1213的方向滑动。可选的，动力组件122可以是气缸、液压缸等直接输出直线运动的组件，也可以是将圆周运动转化为直线运动的组件，如电机与同步带轮的组合、电机与丝杆1222及滑块1223的组合等。本发明并不限制动力组件122的具体结构。如图38所示，在本发明一实施例中，动力组件122包括驱动电机1221、丝杆1222及滑块1223。驱动电机1221的输出轴与丝杆1222的一端传动连接，滑块1223具有内螺纹，滑块1223与丝杆1222表面的外螺纹配合连接。滑块1223的外缘与推杆1212远离注射筒1211的一端固定连接。滑块1223与丝杆1222配合将驱动电机1221输出的旋转运动转化为滑块1223沿丝杆1222轴向的直线运动，从而带动变容积组件121的推杆1212在注射筒1211内滑动。进一步，本实施例中使用的驱动电机1221为伺服电机。伺服电机具有精确反馈及控制输出角位移的特点。[0260]如图39所示，在本发明一实施例中，流体驱动机构120还包括三通换向阀124和储液罐125。三通换向阀124具有第一接口、第二接口及第三接口。吐液枪头110的入口端111、变容积组件121的进出液口1213以及储液罐125分别与三通换向阀124的第一接口、第二接口及第三接口连通。三通换向阀124至少可以控制流体驱动机构120实现以下两种模式：一、使变容积组件121的进出液口1213与吐液枪头110的入口端111相连通，在动力组件122的带动下，变容积组件121向吐液枪头110提供液体驱动力，用于将吐液枪头110内的第一液体190从吐液枪头110的出口端112排出，或者将第一液体190从吐液枪头110的出口端112抽吸进入吐液枪头110内。二、使变容积组件121的进出液口1213与储液罐125相连通，在动力组件122的带动下，变容积组件121将储液罐125中的驱动液体1214抽吸进入变容积组件121的注射筒1211内，或者是将变容积组件121内的驱动液推入储液罐125内。[0261]如图39所示，本发明一实施例还提供一种流体驱动方法，采用上述流体驱动机构，包括以下步骤：(1)三通换向阀124使变容积组件121的进出液口1213与储液罐125连通。在动力组件122的带动下，推杆1212在注射筒1211内向远离进出液口1213的一端滑动改变注射筒1211的容积，以将储液罐125内的驱动液体1214吸入注射筒1211内。(2)三通换向阀124使变容积组件121的进出液口1213与吐液枪头110的入口端111连通。在动力组件122的带动下，推杆1212在注射筒1211内向靠近进出液口1213的一端滑动改变注射筒1211的容积，以排出注射筒1211内、细管123内以及吐液枪头110内的气体。(3)将吐液枪头110的出口端112进入第一液体190中，并维持三通换向阀124使变容积组件121的进出液口1213与吐液枪头110的入口端111连通。在动力组件122的带动下，推杆1212在注射筒1211内向远离进出液口1213的一端滑动改变注射筒1211的容积，以将第一液体190吸进吐液枪头110内。(4)维持三通换向阀124使变容积组件121的进出液口1213与吐液枪头110的入口端111连通。在动力组件122的带动下，推杆1212在注射筒1211内向靠近进出液口1213的一端匀速滑动改变注射筒1211的容积，以将储存在吐液枪头110内的第一液体190以均匀的流速排出吐液枪头110的出口端112。

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为了便于在上述第二步骤中顺利的将注射筒1211内的气体排出，如图38所示，安

装时注射筒1211的进出液口1213朝上，推杆1212沿竖直方向在注射筒1211内滑动。[0263]为了提高微液滴199的生成效率，作为一种可实现的方式，吐液枪头110的数量是多个，多个吐液枪头110并排间隔设置或者以其他的形式排布。每个吐液枪头110均通过单独的细管123与三通换向阀124的第一接口连通。变容积组件121的数量是一个，变容积组件121的进出液口1213与三通换向阀124的第二接口连通。三通换向阀124的第三接口与储液罐125连通。在动力组件122的驱动下，推杆1212在注射筒1211内沿靠近进出液口1213的方向匀速滑动，同时将驱动液体1214挤压至多个吐液枪头110内。由于多个细管123之间是并联关系，每个细管123内的驱动液体1214的流量相同，保证了多个吐液枪头110内的第一液体190以相同、恒定的流速排出吐液枪头110的出口端112。进而保证了所生成微液滴199的体积大小均一性。

[0264]为了提高微液滴199的生成效率，作为另一种可实现的方式，吐液枪头110及变容积组件121的数量均是多个。多个吐液枪头110并排间隔设置或者以其他的形式排布。每个吐液枪头110均通过单独的细管123与三通换向阀124的第一接口连通。每个变容积组件121的进出液口1213也通过单独的细管123与三通换向阀124的第二接口连通。三通换向阀124的第三接口与储液罐125连通。多个变容积组件121并排间隔设置或者以其他的形式排布。多个变容积组件121的推杆1212远离注射筒1211的一端相对固定，由动力组件122同步推动。在动力组件122的驱动下，多个推杆1212在各自的注射筒1211内沿靠近进出液口1213的方向匀速滑动，同时将驱动液体1214挤压至多个吐液枪头110内。由于多个细管123之间是并联关系，每个细管123内的驱动液体1214的流量相同，保证了多个吐液枪头110内的第一液体190以相同、恒定的流速排出吐液枪头110的出口端112。进而保证了所生成微液滴199的体积大小均一性。

[0265]为了提高微液滴199的生成效率，作为第三种可实现的方式，如图40所示，吐液枪头110、变容积组件121及三通换向阀124的数量相同且均是多个。每个吐液枪头110的入口端111通过单独的细管123分别与一个三通换向阀124的第一接口连通。每个变容积组件121的进出液口1213通过单独的细管123分别与一个三通换向阀124的第二接口连通。每个三通换向阀124的第三接口分别与储液罐125连通。可选的，储液罐125可以是一个或者多个。每个吐液枪头110内的第一液体190可以相同也可以不同。多个变容积组件121并排间隔设置或者以其他的形式排布。多个变容积组件121的推杆1212远离注射筒1211的一端相对固定，由动力组件122同步推动。在动力组件122的驱动下，多个推杆1212在各自的注射筒1211内沿靠近进出液口1213的方向匀速滑动。能够同时生成多种不同种类的微液滴199。[0266]为了提高微液滴199的生成效率，作为第四种可实现的方式，吐液枪头110、变容积组件121及三通换向阀124的数量相同且均是多个。每个吐液枪头110的入口端111通过单独的细管123分别与一个三通换向阀124的第一接口连通。每个变容积组件121的进出液口1213通过单独的细管123分别与一个三通换向阀124的第二接口连通。每个三通换向阀124的第三接口分别与储液罐125连通。可选的，储液罐125可以是一个或者多个。每个吐液枪头110内的第一液体190可以相同也可以不同。多个变容积组件121并排间隔设置或者以其他的形式排布。每个变容积组件121分别对应单独的动力组件122。在动力组件122的驱动下，多个推杆1212在各自的注射筒1211内沿靠近进出液口1213的方向匀速滑动。不仅能够同时

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生成多种不同种类的微液滴199，在保证每个吐液枪头110所生成微液滴199的体积大小均一的提前下，还能够分别控制每种液滴195的体积大小。便于对多个吐液枪头110的微液滴199生成状态进行独立控制。

[0267]传统的运动控制机构在使用过程中，无法精确控制吐液枪头的出口端与油相组合物之间的相对运动，所生成微液滴的体积大小均一性较差。[0268]基于此，有必要针对使用吐液枪头注射/喷射法生成微液滴时，由于传统的运动控制机构无法精确控制吐液枪头的出口端与油相组合物之间的相对运动，所生成的微液滴体积大小均一性较差的问题，提供一种能够精确控制吐液枪头的出口端与油相组合物之间相对运动的运动控制机构。

[0269]在微液滴199的生成过程中，吐液枪头110的出口端112做包含瞬时加速的周期运动，不仅能够有效的生成微液滴199，且便于对所生成微液滴199的大小进行控制。吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化的周期运动，不能能够有效的生成微液滴199，且所生成微液滴199具有良好的体积大小均一性。吐液枪头110的出口端112在运动控制机构130的驱动下做包含瞬时加速的周期运动或者位移呈正弦变化的周期运动。[0270]如图41所示，本发明提供一种运动控制机构130，包括支撑架131、连接件132以及驱动元件。连接件132用于与吐液枪头110连接。驱动元件固定于支撑架131，驱动元件与连接件132传动连接。在驱动元件的驱动下，吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。本发明所提供的运动控制机构130，通过带动吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动以生成微液滴199，具有微液滴199生成效率高、提及均一性高的优点。本发明中的运动控制机构130还可以采用其他旋转驱动装置，例如摆动气缸、旋转电磁铁137等。[0271]在本发明一实施例中，驱动元件包括振动电机133，优选的，振动电机133的类型是振镜电机，振镜电机的输出轴与连接件132传动连接。振镜电机可以提供稳定且高速的往复摆动及往复直线动作，且摆幅和频率可以按照需求设定，极大提高了本发明运动控制机构130的适用范围。可选的，旋转电机还可以使音圈电机或者压电电机。进一步，振动电机133采用具有闭环控制振动角度或位置的电机，由闭环控制振动角度或位置的电机驱动吐液枪头110的输出端进行振动，从而精密的控制吐液枪头110的摆动轨迹，从而进一步减少环境和系统带来的扰动。

[0272]以下结合图42阐述闭环控制振动角度或位置的电机在本发明中的应用。闭环控制振动角度或位置的电机包括红外位置传感器、控制电路和信号处理电路等部件。在本实施例中，在运动控制机构130的旋转轴上安装红外位置传感器，通过红外位置传感器把其所获得的位置信号反馈到控制电路中，控制电路依据PID自动化控制原理分别对反馈的位置信号做了比例、积分、微分运算处理，并且结合位置前馈和速度环、电流环等的信号处理电路，实现了电机运动时的绝对位置精确控制。采用闭环控制振动角度或位置的电机可以避免其它振动电机133受到复杂的负载环境变化而引起振动位置的改变，其有利于工程上精确控制液滴195体积和生成速度。[0273]在本发明一实施例中，连接件132包括接头1321。接头1321与振动电机133的输出轴传动连接。接头1321呈中空管状，接头1321的一端用于与吐液枪头110连接，接头1321的另一端用于与吐液枪头110的流体控制机构连接。吐液枪头110内储存有用于生成微液滴

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199的第一液体190，流体控制机构的作用是在微液滴199的生成过程中将吐液枪头110内的第一液体190按照设定的流速排出。在流体控制机构的控制下，储存在吐液枪头110内的第一液体190以恒定的流速排出，或者流速呈现出规律性变化，或者其他类别设定的流速。在本实施例中，吐液枪头110内的第一液体190在流体控制机构的控制下以恒定的流速从吐液枪头110的出口端112排出。具体的，流体控制机构的细管123与接头1321远离吐液枪头110的一端连接。接头1321能够同时起到连通吐液枪头110和流体控制机构以及带动吐液枪头110运动的作用。作为一种可实现的方式，接头1321与吐液枪头110连接后，接头1321与吐液枪头110同轴。

[0274]为了便于安装和拆卸吐液枪头110，接头1321靠近吐液枪头110的一端外缘呈倒圆台状，吐液枪头110套设于接头1321呈倒圆台状的一端。接头1321靠近吐液枪头110的一端外缘呈倒圆台状能够减小吐液枪头110安装和拆卸的阻力，同时便于牢固的安装吐液枪头110。进一步，连接件132包括连接轴1322，连接轴1322转动设置于支撑架131，连接轴1322与振动电机133传动连接，接头1321的数量是多个，多个接头1321间隔固定设置于连接轴1322。在一个连接轴1322上间隔安装多个接头1321，多个接头1321能够同时安装多个吐液枪头110，大大提高了微液滴199的生成效率。[0275]可选的，连接轴1322转动设置于支撑架131包括连接轴1322的两端与支撑架131转动连接以及连接轴1322的其他位置与支撑架131转动连接。在本实施例中，连接轴1322的两端转动设置于支撑架131，连接轴1322的一端与振动电机133传动连接，多个接头1321固定设置于连接轴1322的两端之间。连接轴1322的两端转动设置于支撑件，有利于增加整个转轴的转动稳定性。作为一种了实现的方式，连接轴1322的两端通过转动轴承转动设置于支撑架131。在其他的实施例中，也可以在满足转动及传动的条件下，将连接轴1322的其他位置转动设置于支撑架131。

[0276]接头1321固定于连接轴1322时，接头1321的轴向与连接轴1322的轴向之间的夹角能够改变吐液枪头110的出口端112的运动轨迹及运动速度。作为一种可实现的方式，接头1321的轴向与连接轴1322的轴向相互垂直。接头1321的轴向与连接轴1322的轴向保持相互垂直，有利于吐液枪头110充分利用连接轴1322的转动实现自身的振动。进一步，多个接头1321等间距间隔设置在连接轴1322的两端之间。等间距间隔设置的吐液枪头110在第二液体699液面下振动过程中，均匀的扰动第二液体699，以保证各个吐液枪头110生成微液滴199的环境及条件相同。

[0277]本发明一实施例中，驱动元件包括压电陶瓷135和弹性件136，压电陶瓷135通电产生第一方向的变形时驱动连接件132的接头1321向第一方向运动，与连接件132连接的弹性件136产生弹性变形。压电陶瓷135通电产生与第一方向相反的变形时，弹性件136的弹性变形恢复同时带动连接件132的接头1321向与第一方向相反的方向运动。如此反复，连接件132带动吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的运动。如图43所示，具体的，通过压电方式实现吐液枪头110的出口端112做轨迹为圆弧、位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。接头1321通过轴承转动设置于支撑架131，吐液枪头110套设在接头1321的一端，吐液枪头110能够以轴承的轴心为中点做轨迹为圆弧的运动。接头1321与支撑架131转动连接的位置具有对称的延伸板134，延伸板134的延伸方向与接头1321的延伸方向垂直。驱动元件包括压电陶瓷135和弹性件136，压电陶瓷135和弹性件136配合驱

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动连接件132。压电陶瓷135与弹性件136通过驱动延伸板134进而实现吐液枪头110的出口端112的快速振动。压电的方式具有结构简单、驱动性能稳定的优点。[0278]在本发明一实施中，驱动元件包括电磁铁137、磁性件138和弹性件136，弹性件136的一端固定设置于支撑架131，连接件132固定设置于弹性件136的另一端，磁性件138与连接件132的接头1321固定连接。电磁铁137通电对磁性件138产生第一方向的力时，磁性件138及连接件132的接头1321向第一方向运动，同时弹性件136产生弹性变形。电磁铁137断电时，弹性件136带动连接件132的接头1321及磁性件138向与第一方向相反的方向运动。控制电磁铁137的通断电，磁性件138通过连接件132带动吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的运动。[0279]具体的，如图44所示，通过电磁的方式实现吐液枪头110的出口端112做轨迹为圆弧、位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。在本实施例中，吐液枪头110的出口端112的运动轨迹接*面圆弧的水平段。弹性件136的一端固定在支撑架131上，弹性件136的另一端与接头1321固定连接。吐液枪头110套设于接头1321的一端。驱动元件包括电磁铁137和磁性件138，磁性件138与连接件132固定连接，电磁铁137通过磁性件138驱动连接件132。电磁铁137固定设置于支撑架131，能够被电磁铁137吸引的磁性件138固定设置于接头1321并与电磁铁137保持在工作距离范围内。位置传感器能够检测磁性件138的运动位置，通过计算可得出吐液枪头110的出口端112的位置。电磁铁137通电时，吸引磁性件138并带动吐液枪头110向靠近电磁铁137的方向运动，同时弹性件136因发生弹性变形而蓄能。当吐液枪头110的出口端112靠近电磁铁137运动到第一设定位置时，电磁铁137断电。吐液枪头110在弹性件136的恢复力的作用下远离电磁铁137。当吐液枪头110的出口端112远离电磁铁137运动到第二设定位置时，电磁铁137通电。电磁铁137吸引磁性件138并带动吐液枪头110向靠近电磁铁137的方向运动，同时弹性件136因发生弹性变形而蓄能，如此循环。可根据具体工况调整电磁铁137的工作参数和弹性件136的弹性模量，以实现吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。作为一种可实现的方式，弹性件136包括弹性钢片及其他能够满足弹性要求的弹性件136。[0280]如图45所示，在本发明一实施中，通过电磁的方式实现吐液枪头110的出口端112做轨迹为圆弧、位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。在本实施例中，吐液枪头110的出口端112的运动轨迹接*面圆弧的竖直段。弹性件136的一端固定在支撑架131上，弹性件136的另一端与接头1321固定连接。吐液枪头110套设于接头1321的一端。电磁铁137固定设置于支撑架131，能够被电磁铁137吸引的磁性件138固定设置于接头1321并与电磁铁137保持在工作距离范围内。位置传感器能够检测磁性件138的运动位置，通过计算可得出吐液枪头110的出口端112的位置。电磁铁137通电时，吸引磁性件138并带动吐液枪头110向靠近电磁铁137的方向运动，同时弹性件136因发生弹性变形而蓄能。当吐液枪头110的出口端112靠近电磁铁137运动到第一设定位置时，电磁铁137断电。吐液枪头110在弹性件136的恢复力的作用下远离电磁铁137。当吐液枪头110的出口端112远离电磁铁137运动到第二设定位置时，电磁铁137通电。电磁铁137吸引磁性件138并带动吐液枪头110向靠近电磁铁137的方向运动，同时弹性件136因发生弹性变形而蓄能，如此循环。可根据具体工况调整电磁铁137的工作参数和弹性件136的弹性模量，以实现吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。作为一种可实现的方式，弹性件136包括弹性钢片及其他

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能够满足弹性要求的弹性件136。[0281]在本发明一实施例中，驱动元件包括电磁铁137和磁性件138，磁性件137与连接件132的接头1321固定连接，电磁铁137产生变化的磁场，磁性件138在变化的磁场中运动。磁性件137通过连接件132带动吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的运动。

[0282]进一步，如图46所示，使用电磁铁137实现吐液枪头110的出口端112做轨迹为圆弧、位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。接头1321通过轴承转动设置于支撑架131，吐液枪头110套设在接头1321的一端。电磁铁137固定设置于支撑架131，能够被电磁铁137吸引的磁性件138固定设置于接头1321并与电磁铁137保持在工作距离范围内。位置传感器能够检测接头1321的转动角度，通过计算可得出吐液枪头110的出口端112的位置。电磁铁137通电时，吸引磁性件138并带动吐液枪头110向靠近电磁铁137的方向运动，当吐液枪头110的出口端112靠近电磁铁137运动到第一设定位置时，电磁铁137转换通电方向。吐液枪头110在电磁铁137的反向作用力的作用下远离电磁铁137。当吐液枪头110的出口端112远离电磁铁137运动到第二设定位置时，电磁铁137再次转换通电方向。电磁铁137吸引磁性件138并带动吐液枪头110向靠近电磁铁137的方向运动，如此循环。可根据具体工况调整电磁铁137的工作参数，以实现吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。

[0283]上述实施例给出了振动电机133输出转动、吐液枪头110的出口端112做轨迹为圆弧、位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。在其他的实施例中，吐液枪头110的出口端112还可做轨迹为直线、位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。[0284]如图47所示，在本发明一实施例中，使用电磁铁137实现吐液枪头110的出口端112做轨迹为直线、位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。在本实施例中，吐液枪头110的出口端112在水平面内做轨迹为直线的振动。接头1321通过直线轴承滑动设置于支撑架131，吐液枪头110套设在接头1321的一端。电磁铁137固定设置于支撑架131，能够被电磁铁137吸引的磁性件138固定设置于接头1321并与电磁铁137保持在工作距离范围内。位置传感器能够检测接头1321的滑动位置，通过计算可得出吐液枪头110的出口端112的位置。电磁铁137通电时，吸引磁性件138并带动吐液枪头110向靠近电磁铁137的方向滑动，当吐液枪头110的出口端112靠近电磁铁137运动到第一设定位置时，电磁铁137转换通电方向。吐液枪头110在电磁铁137的反向作用力的作用下远离电磁铁137滑动。当吐液枪头110的出口端112远离电磁铁137运动到第二设定位置时，电磁铁137再次转换通电方向。电磁铁137吸引磁性件138并带动吐液枪头110向靠近电磁铁137的方向滑动，如此循环。可根据具体工况调整电磁铁137的工作参数，以实现吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。[0285]如图48所示，在本发明一实施例中，使用电磁铁137实现吐液枪头110的出口端112做轨迹为直线、位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。在本实施例中，吐液枪头110的出口端112在竖直面内做轨迹为直线的振动。接头1321通过直线轴承滑动设置于支撑架131，吐液枪头110套设在接头1321的一端。电磁铁137固定设置于支撑架131，能够被电磁铁137吸引的磁性件138固定设置于接头1321并与电磁铁137保持在工作距离范围内。位置传感器能够检测接头1321的滑动位置，通过计算可得出吐液枪头110的出口端112的位置。电

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磁铁137通电时，吸引磁性件138并带动吐液枪头110向靠近电磁铁137的方向滑动，当吐液枪头110的出口端112靠近电磁铁137运动到第一设定位置时，电磁铁137转换通电方向。吐液枪头110在电磁铁137的反向作用力的作用下远离电磁铁137滑动。当吐液枪头110的出口端112远离电磁铁137运动到第二设定位置时，电磁铁137再次转换通电方向。电磁铁137吸引磁性件138并带动吐液枪头110向靠近电磁铁137的方向滑动，如此循环。可根据具体工况调整电磁铁137的工作参数，以实现吐液枪头110的出口端112做位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。

[0286]振镜电机能够输出往复直线运动，在本发明其他的实施例中，通过振镜电机驱动吐液枪头110的出口端112做轨迹为直线、位移呈正弦变化或者速度呈方波变化的振动。[0287]本发明提供的微液滴生成装置及生成方法在医学临床检验、纳米材料制备、食品及环境检测、生化分析等应用领域都有广泛应用。在一个具体的应用环境中，本发明提供的微液滴199的生成装置及生成方法应用在聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)中。

[0288]以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。[0289]在一个实施例中，所述微液滴199为待测核酸扩增反应液，通过所述微液滴生成装置10将所述待测核酸扩增反应液微滴化，形成多个微液滴，用以通过所述数字PCR检测仪1进行检测。将所述待测核酸扩增反应液通过一体式数字PCR检测仪1的微液滴生成装置10，通过微滴化处理转化为多个微液滴199，使得待测样本中的检测片段从大量的复杂背景中分离出来，并放置于微液滴容器60中，等待检测。通过微液滴生成装置10可以生成多个大小均一的微液滴199。每个所述微液滴199大小在微米级，并且每个所述微液滴199可以视作一个独立的反应器，相当于生化反应中常用的试管。所述多个微液滴199放置于微液滴容器60中，便于检测观察。同时，通过所述微液滴生成装置10也可以生成多个体积不同的微液滴，用以进行医学临床检测。所述多个微液滴199体积小、数量多，具有许多常规试管没有的优势。通过所述微液滴生成装置10可以生成大量微液滴199，使得所述数字PCR检测仪1具有通量高、耗材成本低和背景噪声低的优点，具有很好的工业化前景。[0290]在一个实施例中，所述温控装置20包括柔性电路板220、与所述柔性电路板220间隔设置的加热基板240、以及多个半导体电偶对230。所述加热基板240包括相对设置的第一表面241和第二表面242。所述多个半导体电偶对230设置于所述柔性电路板220与所述第一表面241之间，所述多个半导体电偶对230相互串联、并联或者混合连接。[0291]所述柔性电路板220(Flexible Printed Circuit，FPC)是以聚酰亚胺或聚酯薄膜为基材制成的具有高度可靠性，绝佳的可挠性印刷电路板。所述柔性电路板220具有配线密度高、重量轻、厚度薄、弯折性好的优点。所述柔性电路板220重量轻、厚度薄，可以有效节省产品体积。

[0292]温度改变时，物体由于外在约束以及内部各部分之间的相互约束，使其不能完全自由胀缩而产生的应力。热应力又称变温应力。热应力与零外载相平衡，是由热变形受约束引起的自平衡应力，在温度高处发生压缩，温度低处发生拉伸形变。在一定条件下控制应力使之合理分布，就可以提高零件的机械性能和使用寿命，变害为利。

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通过所述柔性电路板220替换传统半导体致冷器中的一个基板，使得所述半导体

致冷器导热性能更好。所述柔性电路板220在升降温过程中以自身的变形消除热应力，进而延长了所述半导体致冷器的使用寿命。

[0294]当所述多个微液滴在不同温度范围内进行核酸扩增时，可以实现迅速在几秒时间内进行切换。所述温控装置20可以实现瞬时升温降温，进而升温降温的过程缩短了，从而实现了高低温的循环，将所述数字PCR检测仪1的检测时间缩短了，提高了检测效率。[0295]在一个实施例中，所述温控装置20还包括第二控制器210与温度传感器260。所述第二控制器210与所述柔性电路板220电连接，用于控制电流大小。所述温度传感器260设置于所述加热基板240表面，所述温度传感器260与所述第二控制器210电连接，用于检测所述加热基板240的温度并将该温度发送给所述第二控制器210。[0296]聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。PCR检测技术用来诊断遗传性疾患、检测临床标本中病原体的核酸、对法医标本作遗传学鉴定，以及分析激活癌基因中的突变情况等方面获得了广泛的应用。PCR反应条件为温度、时间和循环次数。基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定。并且，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

[0297]现有技术中的PCR扩增仪实现变温是由半导体制冷片和导热模块完成的，通过在导热模块中的测温探头采集温度后，通过PID控温方式直接控温，导热模块温度达到目标温度后，保持不变。待测样品溶液的升温有滞后性，随着待测样品溶液的温度接近目标温度内外温差越来越小，升温越来越慢。现有的温控装置，升降温速率慢，每一次升温或降温都需要几十秒至数分钟，做几十个PCR循环需要1～2个小时左右。因此，这种升降温速率会导致完成核酸扩增所需的时间延长，核酸扩增效率低，并且使用寿命低。[0298]基于此，有必要针对现有的温控装置升降温速率慢，导致完成核酸扩增所需时间长的问题，提供一种升降温速率快、使用寿命高的温控装置。[0299]如图50-51所示，本发明还提供一种温控装置20，其包括柔性电路板220、与所述柔性电路板220间隔设置的加热基板240以及多个半导体电偶对230。所述加热基板240包括相对设置的第一表面241和第二表面242。所述多个半导体电偶对230设置于所述柔性电路板220与所述第一表面241之间，所述多个半导体电偶对230相互串联、并联或者混合连接。[0300]所述温控装置20通常应用于高低温循环环境中，温度需要快速升降，所以对所述温控装置20要求极高。为了满足所述温控装置20的应用需求，所述温控装置20采用所述柔性电路板220。所述柔性电路板220具有配线密度高、重量轻、厚度薄、弯折性好的特点。所述柔性电路板220在升降温过程中以自身的变形消除热应力。通过所述柔性电路板220可以降低升降温过程中存在的热应力，从而延长了所述温控装置20的使用寿命。同时，通过所述柔性电路板220，解决了温度分布不均匀的问题。当所述多个微液滴在不同温度范围内进行核酸扩增时，通过所述柔性电路板220、加热基板240以及多个半导体电偶对230可以实现迅速在几秒时间内进行切换。所述温控装置20可以实现瞬时升温降温，进而升温降温的过程缩短了，从而实现了高低温的循环，将所述数字PCR检测仪1的检测时间缩短了，提高了检测效率。

[0301]所述柔性电路板220(Flexible Printed Circuit，FPC)可以是以聚酰亚胺或聚酯

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薄膜为基材制成的一种具有高度可靠性，绝佳的可挠性印刷电路板。所述柔性电路板具有配线密度高、重量轻、厚度薄、弯折性好的特点。所述柔性电路板重量轻、厚度薄，可以有效节省产品体积。其中，所述半导体致冷器(Thermo Electric Cooler，TEC)是利用半导体材料的珀尔帖效应制成的。所谓珀尔帖效应，是指当直流电流通过两种半导体材料组成的电偶时，其一端吸热，一端放热的现象。通过所述柔性电路板220替换传统半导体致冷器中的一个基板，使得所述半导体致冷器导热性能更好。[0302]当温度改变时，物体由于外在约束以及内部各部分之间的相互约束，使其不能完全自由胀缩而产生的应力。热应力又称变温应力。热应力与零外载相平衡，是由热变形受约束引起的自平衡应力，在温度高处发生压缩，温度低处发生拉伸形变。在一定条件下控制应力使之合理分布，就可以提高零件的机械性能和使用寿命，变害为利。[0303]在一个实施例中，所述加热基板240可以为超导铝基板电路。[0304]铝基板是一种具有良好散热功能的金属基覆铜板，一般单面板由三层结构所组成，分别是电路层(铜箔)、绝缘层和金属基层。所述超导铝基板电路是线路板的材料是铝合金，能够导热快。铝基板能够将热阻降至最低，使铝基板具有极好的热传导性能，与厚膜陶瓷电路相比，它的机械性能又极为优良。[0305]如图52所述，在一个实施例中，所述半导体电偶对230包括一个P型电偶231和一个与所述P型电偶231间隔设置的N型电偶232。

[0306]所述P型电偶231与所述N型电偶232焊接在所述柔性电路板220和所述基板240之间。所述半导体电偶对230包括一些由所述P型电偶231和所述N型电偶232形成的一对电偶，多对所述半导体电偶对230之间通过电极连在一起，并且夹在所述柔性电路板220与所述第一表面241之间。当有电流流过时，会产生″热″侧和″冷″侧。是致冷还是加热，以及致冷、加热的速率，由通过它的电流方向和大小来决定。一对所述半导体电偶对230产生的热电效应很小，所以在实际中都将上百对所述半导体电偶对230串联在一起，这样产生的热电效应就会增大。

[0307]在一个实施例中，所述第一表面241包括多个间隔设置的第一电极片243，一个所述第一电极片243与一个所述半导体电偶对230对应，所述半导体电偶对230中的所述P型电偶231与所述N型电偶232通过所所述第一电极片243串联。[0308]在一个实施例中，所述柔性电路板220包括多个间隔设置并相互串联的第二电极片221，相邻的两个所述半导体电偶对230通过一个所述第二电极片221串联。

[0309]当所述P型电偶231和所述N型电偶232联结成的所述半导体电偶对230中有电流通过时，两端之间就会产生热量转移，热量就会从一端转移到另一端，从而产生温差形成冷热端。但是所述P型电偶231和所述N型电偶232自身存在电阻当电流经过所述P型电偶231和所述N型电偶232时就会产生热量，从而会影响热传递。而且所述柔性电路板220与所述加热基板240之间的热量也会通过空气和所述P型电偶231和所述N型电偶232材料自身进行逆向热传递。当冷热端达到一定温差，这两种热传递的量相等时，就会达到一个平衡点，正逆向热传递相互抵消。此时冷热端的温度就不会继续发生变化。为了达到更低的温度，可以采取散热等方式降低热端的温度来实现。[0310]在一个实施例中，所述温控装置20还包括导热增强层250，设置于所述第二表面242。

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所述导热增强层250具有十分良好的强度、柔韧、导电、导热、光学特性。所述导热

增强层250直接与所述微液滴容器60接触，可以使得所述多个微液滴受热均匀，从而通过对温度的控制实现核酸扩增。所述导热增强层250可以为石墨导热层或者硅脂导热层，加快导热，增加了所述加热基板240的所述第二表面242的温度均匀性，进而保证靠近所述微液滴容器60的表面温度均匀，从而使得所述多个微液滴受热均匀。进而完成核酸扩增，提高了检测效率，节省了时间。

[0312]在一个实施例中，所述导热增强层250的材料中包括石墨烯。所述石墨烯是一种平面薄膜具有非常好的热传导性能，横向可以实现均匀导热。[0313]在一个实施例中，所述温控装置20还包括第二控制器210，与所述柔性电路板220电连接，用于控制电流大小。[0314]在一个实施例中，所述温控装置20进一步包括温度传感器260，设置于所述第二表面242，并与所述第二控制器210电连接，用于检测所述第二表面242的温度并将该温度发送给所述第二控制器210。

[0315]所述温度传感器260设置于所述导热增强层250的所述第二表面242，用以检测所述第二表面242的实时温度，进而将温度信息反馈给所述第二控制器210，从而实现对所述多个微液滴加热温度的控制。所述温度传感器260用于通过检测金属的电阻变化来测量所述微液滴容器60的温度，用以实时检测所述多个微液滴进行核酸扩增过程中的温度变化，从而将温度信息反馈给所述第二控制器210，进而控制所述控制电路进行温度的调控，实现温度控制，更好进行核酸扩增。[0316]在一个实施例中，所述第二控制器210包括温度控制单元212以及控制电路214。所述温度控制单元212与所述温度传感器260连接，用以实时检测所述第二表面242的温度。所述控制电路214与所述柔性电路板220连接，用以调控所述多个半导体电偶对230的温度变化。

[0317]所述温度控制单元212与所述控制电路214设置于一块电路板上。所述温度控制单元212与所述控制电路214的关系为内部算法的逻辑运算关系，可以采用Packet Identifier闭环控制算法，亦即PID闭环控制算法。所述温度控制单元212检测到的温度是核酸扩增的温度反馈，作为内部算法的输入，所述控制电路214计算后的结果作为内部算法的输出，从而形成闭环关系。电路部分的温度反馈实际上是一个采样电路。采集的就是铂电阻上的电信号，转换为温度值传递给控制电路的输入端。所述温度传感器260与所述温度控制单元212通过标准的铂电阻三线制连接。[0318]在一个实施例中，所述柔性电路板220设置有第一电极222以及第二电极223。所述多个第二电极片221串联后与所述第一电极222和所述第二电极223串联。所述第一电极222与所述第二电极223分别与所述控制电路连接。

[0319]所述控制电路214与所述柔性电路板220之间的连接为两根线，分别连接所述第一电极222以及所述第二电极223。[0320]在一个实施例中，所述温控装置20还包括散热装置270，所述散热装置270包括基板271以及与所述基板271连接的散热片272。所述柔性电路板220设置于所述基板271的表面。

[0321]由于所述散热片272设置于所述基板271表面，在没有减少所述基板271面积的情

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况下，更增加了热交换面积，延长凉风作用于所述基板271表面的时间，形成的多股散热风道，也有利于加快热交换，把更多的热量从所述基板271表面上带走，从而达到更加理想的散热效果。

[0322]在一个实施例中，所述温控装置还包括风扇273设置于所述散热片273周围。[0323]通过所述风扇273可以协助所述散热装置270进行散热。其中，所述风扇273设置于所述散热片273的周围，可以设置多个，从而可以达到更好的散热效果，进而使得所述温控装置20升温降温更加快速。[0324]在一个实施例中，对所述温控装置20通以交流电，并通过所述第二控制器210对电流大小调节来控制所述温控装置20是致冷还是加热，以及致冷、加热的速率。同时，通过所述温度传感器260用以检测所述微液滴容器60的实时加热温度，进而将温度信息反馈给所述温度控制单元212。所述温度控制单元212将温度变化情况反馈给所述控制电路214，从而控制所述多个微液滴的温度。通过所述温控装置20可以使得所述多个微液滴进行核酸扩增。基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸的三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸，在适合的温度范围内对核酸进行扩增。同时，在核酸扩增过程中，所述微液滴容器60底部与所述温控装置20紧密帖合，两者之间不会有间隙，提高了所述数字PCR检测仪1的准确性。[0325]在一个实施例中，通过所述温控装置20进行核算扩增的的操作方法如下：[0326]首先，将所述微液滴容器60放置于所述温控装置20的所述导热增强层250。然后，将所述多个微液滴进行升温加热，将温度加热至95℃，并加热10min。将所述多个微液加热至95℃，并加热10min，用以将所述多个微液滴中的酶进行热启动。[0327]其次，所述多个微液滴完成酶热启动之后，对所述多个微液滴进行变性30s；[0328]再次，所述多个微液变性之后，降温至55℃，并退火延伸45s，对所述多个微微液进行拍照，并进行45次循环；[0329]最后，循环45次之后，降温至4℃，对所述多个微液进行长时间保存。[0330]请参见图53，所述温控装置20一般情况下测试温控性能主要有两个指标，分别在瞬时状态和稳定状态下观测所述温控装置20的升降温度变化情况。通过对所述多个微液滴加热过程的监控，所述温控装置20对所述多个微液滴进行温度升降时，升降温速率最大可以达到13.34448℃/s。，控制精度为0.02722℃。并且，有时所述温控装置20升温到稳态的时候测量的速率最快可以到18.953894℃/s。因此，所述温控装置20的瞬态响应好，通过所述温控装置20可以实现瞬时升温降温，节省了时间，提高了检测效率。[0331]请参见图54，当所述温控装置20处于稳定状态时，也就是在达到稳定后温度浮动的情况。当所述温控装置20处于稳定状态时，温度变化比较平稳，温度浮动较小。因此，所述温控装置20可以达到快速的升温降温循环，且稳定后温服浮动较小，节省了数字PCR检测溶液样本的时间，提高了工作效率。通过这种升降温速率会缩短完成核酸扩增所需的时间，提高了核酸扩增效率，并且提高了数字PCR检测系统的准确性。[0332]在一个实施例中，所述荧光信号检测装置30包括激发光源340、荧光探测组件330以及第三控制器310。所述激发光源340设置于所述微液滴容器60检测区域上方，并与所述微液滴容器60检测区域呈倾斜角度进行照射，形成斜射光路。所述荧光探测组件330设置于

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所述微液滴容器60检测区域正上方，用以采集所述多个微液滴的荧光图像。所述第三控制器310分别与所述激发光源340和所述荧光探测组件330连接，用以控制所述激发光源340与所述荧光探测组件330。所述荧光信号检测装置可以对微液滴进行多个荧光通道成像以及进行明场暗场成像。其中多个荧光通道成像用于微液滴反应信号的探测，明场暗场成像用于检测形成微液滴的尺寸信息以及在反应过程中监测液滴的状态。[0333]在一个实施例中，所述第三控制器310可以控制所述激发光源340移动，而此时所述荧光探测组件330与所述微液滴容器60的不移动。也就是说，此时通过所述激发光源340移动对所述多个微液滴进行荧光检测。或者，所述第三控制器310可以控制所述荧光探测组件330移动，而此时所述微液滴容器60与所述激发光源340不移动，对所述多个微液滴进行荧光检测。又或者，所述第三控制器310可以控制所述微液滴容器60移动，所述荧光探测组件330与所述激发光源340不移动，对所述多个微液滴进行荧光检测。通过所述第三控制器310可以调节所述激发光源340、所述荧光探测组件330以及所述微液滴容器60的位置移动，进而可以产生相对运动，从而使得检测区的所述微液滴容器60与所述荧光探测组件330对准，进行拍照，完成整个荧光检测的过程。

[0334]通过所述激发光源340发射的光路倾斜照射于所述多个微液滴，使得所述微液滴容器60中含有荧光物质的微液滴产生荧光。通过所述荧光探测组件330对所述含有荧光物质的微液滴进行荧光信息采集，并将所述含有荧光物质的微液滴进行荧光信息以荧光图像的形式传输至所述定量分析装置40，用以进行定量分析。

[0335]从所述微液滴容器60上方采取倾斜角度照射在所述微液滴容器60上。采用所述荧光信号检测装置30实现对所述多个微液滴进行周期性的二维扫描，并实时进行拍照。斜射光路可有效降低激发光散射背景，提高荧光检测的灵敏度。所述微液滴容器60内的所述多个微液滴的内部荧光被激发，通过所述荧光探测组件330采集所述多个微液滴的荧光图像。[0336]所述激发光源340给所述多个微液滴提供蒸发、原子化或激发的能量。所述激发光源340具有光谱带宽窄、频谱纯度高、波长稳定性好、效率高、寿命长、可靠性好、光束质量好等特点，从而保证了检测结果的准确性与稳定性。[0337]在一个实施例中，所述激发光源340包括：多个不同颜色的LED光源341、二向色镜344、复眼透镜345以及聚焦透镜346。每个所述LED光源341前端依次设有准直镜342和第一滤光片343。所述二向色镜344倾斜设置于所述第一滤光片343前端，用以将每个所述LED光源341发出的光折射成一条光路。所述复眼透镜345用以提高经折射后的所述光路的均匀性。所述聚焦透镜346设置于所述复眼透镜345的前端，用以聚焦成像。[0338]所述多个不同颜色的LED光源341作为激发光源340，可以产生不同颜色的荧光，用以增大检测通道，实现不容种类的微液滴的检测。每个所述LED光源341的前端依次设有所述准直镜342和所述第一滤光片343。所述准直镜342可以用在光束传递系统中，以维持激光谐振腔和聚焦光学元件之间的光束的准直性。并且，所述LED光源341通过所述第一滤光片343可以将所需波段的光分离出来作为激发光。利用所述二向色镜344、所述复眼透镜345以及所述聚焦透镜346等光学镜片，将激发光变成平行或是汇聚的光束，照射到芯片上含有多个液滴的区域，形成激发区。并将激发光激发所述微液滴容器60中的所述多个微液滴。[0339]在一个实施例中，所述激发光源340与所述荧光探测组件330是一体的或者是分体的。

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将所述荧光信号检测装置30可以倾斜的角度照射到所述微液滴容器60时，所述荧

光信号检测装置30对所述多个微液滴进行周期性的二维扫描，并实时进行拍照。通过将所述荧光信号检测装置30以倾斜的角度照射到所述微液滴容器60时，可有效降低激发光散射背景，提高荧光检测的灵敏度。所述微液滴容器60内的所述多个微液滴的内部荧光被激发，通过所述第二滤光片333被上方的所述物镜332收集，进入所述相机331，所述相机331采集所述多个微液滴的荧光图像。

[0341]通过所述聚焦透镜346的光路倾斜照射于所述多个微液滴，使得所述微液滴容器60中含有荧光物质的微液滴产生荧光。通过所述荧光探测组件330对所述含有荧光物质的微液滴进行荧光信息采集，并将所述含有荧光物质的微液滴进行荧光信息以荧光图像的形式传输至所述定量分析装置40，用以进行定量分析。[0342]在一个实施例中，所述第三控制器310可以同步开启所述多个不同颜色的LED光源341和所述相机331。

[0343]所述第一滤光片343用来选取所需辐射波段的光学器件。所述第一滤光片343是塑料或玻璃片再加入特种染料做成的，红色滤光片只能让红光通过，如此类推。玻璃片的透射率原本与空气差不多，所有有色光都可以通过，所以是透明的，但是染了染料后，分子结构变化，折射率也发生变化，对某些色光的通过就有变化了。比如一束白光通过蓝色滤光片，射出的是一束蓝光，而绿光、红光极少，大多数被滤光片吸收了。所述二向色镜344倾斜设置于所述第一滤光片343前端，用以将每个所述LED光源341发出的光折射成一条光路。所述复眼透镜345，用以提高经折射后的所述光路的均匀性。所述聚焦透镜346设置于所述复眼透镜345的前端，用以聚焦成像。所述聚焦透镜346属于梯度折射率透镜。具有端面聚焦和成像的特性，以及其具有圆柱状的外形特点，因而可以应用于多种不同的微型光学系统中。

[0344]通过所述第三控制器310可以控制所述多个不同颜色的LED光源341之间的切换，从而构成不同的荧光检测通道。所述多个不同颜色的LED光源341可以轮流工作，不需要单独设置转轮。

[0345]所述准直镜342分为反射式准直镜和透射式准直镜。反射式准直镜和透射式准直镜被用在光束传递系统中，以维持激光谐振腔和聚焦光学元件之间的光束的准直性。反射式准直镜一般使用的是铜制全反镜，而透射式准直镜则使用硒化锌透镜。[0346]在一个实施例中，所述荧光探测组件330包括物镜332、相机331以及第二滤光片333，所述物镜332设置于所述相机331与所述第二滤光片333之间。[0347]所述第二滤光片333采用多带通滤光片。所述多带通滤光片同时可以通过多个波段的光，每一个波段对应一种染料。在生物医学荧光检验分析系统中分离和选择物质的激发光与发射荧光的特征波段光谱。分子在吸收带吸收激发光谱，然后在发射带发射长波的辐射光谱，即形成了荧光光谱。

[0348]所述多个微液滴的荧光图像的生成主要是通过所述相机331完成。所述相机331能够把光学影像转化为数字信号。所述相机331中排列有许多整齐的电容，能感应光线，并将影像转变成数字信号。经由外部电路的控制，每个小电容能将其所带的电荷转给它相邻的电容。采用所述相机331完成对所述多个微液滴的荧光采集，能够提供直观可视化的荧光图像，提高了荧光检测的速度，使得检测结果更加准确。

[0349]通过所述荧光信号检测装置30可以使得所述多个微液滴荧光成像，一次拍摄一定

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数量的所述多个微液滴的荧光图像，然后利用图像处理技术，将图像中的液滴荧光进行自动识别，从而得到液滴的荧光信息。

[0350]通过所述荧光信号检测装置30可以使得所述多个微液滴荧光成像，一次拍摄一定数量的所述多个微液滴的荧光图像，然后利用图像处理技术，将图像中的液滴荧光进行自动识别，从而得到液滴的荧光信息。

[0351]从所述微液滴容器60上方采取倾斜角度照射在所述微液滴容器60上。采用所述荧光信号检测装置30实现对所述多个微液滴进行周期性的二维扫描，并实时进行拍照。斜射光路可有效降低激发光散射背景，提高荧光检测的灵敏度。所述微液滴容器60内的所述多个微液滴的内部荧光被激发，通过所述第二滤光片333被上方的所述物镜332收集，进入所述相机331，所述相机331采集所述多个微液滴的荧光图片。[0352]所述激发光源340给所述多个微液滴提供蒸发、原子化或激发的能量。所述激发光源340具有光谱带宽窄、频谱纯度高、波长稳定性好、效率高、寿命长、可靠性好、光束质量好等特点，从而保证了检测结果的准确性与稳定性。[0353]在一个实施例中，为了防止连续照射造成的荧光漂白，采用计算机来同步所述LED光源341的开启与所述相机331的采集。非采集状态下所述LED光源341保持关闭状态。

[0354]通过所述第三控制器310可以控制所述多个不同颜色的LED光源341之间的切换，从而构成不同的荧光检测通道。所述多个不同颜色的LED光源341可以轮流工作，不需要单独设置转轮。每个所述LED光源341前端依次设有准直镜342和第一滤光片343。[0355]所述准直镜342分为反射式准直镜和透射式准直镜。反射式准直镜和透射式准直镜被用在光束传递系统中，以维持激光谐振腔和聚焦光学元件之间的光束的准直性。反射式准直镜一般使用的是铜制全反镜，而透射式准直镜则使用硒化锌透镜。[0356]所述第一滤光片343用来选取所需辐射波段的光学器件。滤光片是塑料或玻璃片再加入特种染料做成的，红色滤光片只能让红光通过，如此类推。滤光片产品主要按光谱波段、光谱特性、膜层材料、应用特点等方式分类。

[0357]所述二向色镜344倾斜设置于所述第一滤光片343前端，用以将每个所述LED光源341发出的光折射成一条光路。所述二向色镜344的原理是在其内放置一无色方解石(冰洲石)，以将光线分解成两垂直振荡的光，而透过二向色镜分别观察这两光线的颜色。[0358]所述复眼透镜345，用以提高经折射后的所述光路的均匀性。所述复眼透镜345是由一系列小透镜组合形成，将双排复眼透镜阵列应用于照明系统可以获得高的光能利用率和大面积的均匀照明。复眼透镜在微显示器及投影显示领域有广阔的应用前景。利用双排复眼透镜阵列可以实现均匀照明，提高了多个不同颜色的所述LED光源的均匀性和照明亮度，并且可以有效的计算自身与所观察物体的方位，距离，可以获取更加精确的荧光图片。所述复眼透镜阵列要实现均匀照明需两列复眼透镜阵列平行排列，第一列复眼透镜阵列中的各个小单元透镜的焦点与第二列的复眼透镜阵列中对应的小单元透镜的中心重合，两列复眼透镜的光轴互相平行，在第二列复眼透镜后放置聚光镜，聚光镜的焦平面放照明屏就形成了均匀照明系统。

[0359]所述复眼透镜阵列实现均匀照明的原理是：与光轴平行的光束通过第一块透镜后聚焦在第二块透镜的中心处，第一排复眼透镜交光源形成多个光源像进行照明，第二排复眼透镜的每个小透镜将第一排复眼透镜对就的小透镜重叠成像于照明面上。由于第一排复

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眼透镜将光源的整个宽光束分为多个细光束照明，且每个细光束范围内的垂泪不均匀性由于处于对称位置细光束的相互叠加，使细光束的垂泪不均匀性获得补偿，从而使整个孔径内的光能量得到有效均匀的利用。从第二排复眼透镜的出射的光斑通过聚光镜聚焦在照明屏上，这样，照明屏上光斑的每一点均受到光源所有点发出的光线照射，同时，光源上每一点发出的光束又都交会重叠到照明光斑上的同一视场范围内，所以得到一个均匀的方形光斑。

[0360]所述聚焦透镜346设置于所述复眼透镜345的前端，用以聚焦成像。所述聚焦透镜346属于梯度折射率透镜。具有端面聚焦和成象的特性，以及其具有圆柱状的外形特点，因而可以应用于多种不同的微型光学系统中。[0361]在一个实施例中，所述荧光探测组件330包括物镜332、相机331以及第二滤光片333，所述物镜332设置于所述相机331与所述第二滤光片333之间。

[0362]通过所述第三控制器310可以控制所述多个不同颜色的LED光源341之间的切换。所述第三控制器310可以同步开启所述多个不同颜色的LED光源341和所述相机331。所述多个微液滴的荧光图像的生成主要是通过所述相机331完成。所述相机331能够把光学影像转化为数字信号。所述相机331中排列有许多整齐的电容，能感应光线，并将影像转变成数字信号。经由外部电路的控制，每个小电容能将其所带的电荷转给它相邻的电容。采用所述相机331完成对所述多个微液滴的荧光采集，能够提供直观可视化的荧光图像，提高了荧光检测的速度，使得检测结果更加准确。

[0363]所述第二滤光片333采用多带通滤光片。所述多带通滤光片同时可以通过多个波段的光，每一个波段对应一种染料。在生物医学荧光检验分析系统中分离和选择物质的激发光与发射荧光的特征波段光谱。分子在吸收带吸收激发光谱，然后在发射带发射长波的辐射光谱，即形成了荧光光谱。[0364]请参见图49，在一个实施例中，所述激发光源340包括5个不同颜色的LED光源341、5个所述准直镜342、5个所述第一滤光片343、4个所述二向色镜344、1个所述复眼透镜345以及1个聚焦透镜346。所述5个不同颜色的LED光源341可以生成不同颜色的光，照射至所述多个微液滴。通过对所述5个不同颜色的LED光源341进行选择，可以获得不同荧光颜色的照射，所述5个不同颜色的LED光源341可以轮流工作。每个LED光源发射的光路正前方依次设置有所述准直镜、所述第一滤光片343以及二向色镜344。所述准直镜342与所述第一滤光片343与光路呈垂直角度设置(90°角度设置)。所述二向色镜344与光路角度呈0°～45°设置。通过所述二向色镜344形成的一条光路，所述光路正前方依次设置有所述复眼透镜345以及所述聚焦透镜346。所述复眼透镜345与所述聚焦透镜346与光路呈垂直角度设置(90°角度设置)。

[0365]通过所述聚焦透镜346的光路倾斜照射于所述多个微液滴，使得所述微液滴容器中含有荧光物质的微液滴产生荧光。通过所述荧光探测组件330对所述含有荧光物质的微液滴进行荧光信息采集，并将所述含有荧光物质的微液滴进行荧光信息以荧光图像的形式传输至计算机，用以进行定量分析。[0366]在一个实施例中，所述激发光源340中所述LED光源341、所述准直镜342、所述第一滤光片343、所述二向色镜344、所述复眼透镜345以及所述聚焦透镜346的个数不受限制。[0367]所述激发光源340倾斜照射至所述微液滴容器60，用以照射所述多个微液滴。通过

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所述激发光源340形成的斜射光路可以有效降低激发光散射背景。同时，降低所述微液滴容器60的所述微液滴容器60侧壁的高度，有利于排除激发光从侧面照射时造成的的阴影，使得所述相机331能够获取所有微液滴的荧光信息，提高了所述荧光检测装置30的的灵敏度。[0368]在一个实施例中，所述定量分析装置40为计算机。通过所述荧光信号检测装置30可以获得所述多个微液滴的荧光信息照片。所述计算机设置有分析软件，如matlab、microsoft office、origin以及Microsoft Office visual.c++等分析软件，用以实现对获得的所述多个微液滴的荧光信息进行定量分析。[0369]在一个实施例中，所述控制器50分别与所述第一控制器170、所述第二控制器210以及所述第三控制器310连接，用以控制所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、荧光信号检测装置30以及定量分析装置40工作。

[0370]所述微液滴生成装置10将所述待测核酸扩增反应液进行微滴化，形成多个微液滴。然后，通过所述温控装置20对所述多个微液滴进行加热的过程中，采用所述荧光信号检测装置30实时拍测所述多个微液滴的荧光变化图像。通过所述定量分析装置40对所述多个微液滴的荧光变化图像进行分析，获取所述多个微液滴的Ct值，并通过Ct值与起始拷贝数的关系对初始核酸的浓度进行定量分析。

[0371]所述数字PCR检测仪1将所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、所述荧光信号检测装置30以及所述定量分析装置40集成化，使得所述操作人员可以通过一体式数字PCR检测机1实现自动化操作，提高了所述数字PCR检测仪1的工作效率。

[0372]所述微液滴生成装置10将所述待测核酸扩增反应液进行微滴化，形成多个微液滴。然后，通过所述温控装置20对所述多个微液滴进行核酸扩增。同时，采用所述荧光信号检测装置30实时拍测所述多个微液滴的荧光变化图片。通过所述多个微液滴的荧光变化图片，获取所述多个微液滴的荧光变化曲线。根据所述荧光变化曲线，可以获取所述多个微液滴的Ct值，并通过Ct值与起始拷贝数的关系对初始DNA的浓度进行定量分析。其中，Ct值是指每个微液滴的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。[0373]所述微液滴生成装置20生成的为均一大小微液滴，通过温控装置30对所述多个微液滴进行核酸扩增反应，并采集产物信号，如荧光、紫外吸收、浊度等信号。利用所述多个扩增与非扩增微液滴在组成上的差异，对获得目标序列扩增的液滴数量进行分析，最终实现对核酸分子的定量分析。通过实时监测所述多个微液滴的荧光变化图片，测序结果具有直接性，可以解决所述多个微液滴中的假阳性和假阴性的问题。[0374]所述数字PCR检测仪将所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、所述荧光信号检测装置30以及所述定量分析装置40集成化，使得所述操作人员可以通过一体式数字PCR检测机1实现自动化操作，提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。

[0375]数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术。数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。[0376]目前液滴式PCR检测方法是将样本分散成油包水的反应单元，之后对每个反应单元进行实时或终点荧光分析。从理论上讲，反应腔的数量决定了仪器的动态范围以及在给定浓度下的检测精度。目前液滴式PCR检测方法的反应单元结构一般是微腔或微坑结构，属

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于一次性消耗品，进行一次检测需要将其丢弃，防止交叉污染。但是，在实际检测过程中，从微液滴发生卡转移至PCR反应板，从PCR反应板到液滴分析仪的过程中都会有所损失，对所述微液滴的个数仍然存在限制。所以，目前的微液滴反应单元如果进行大量的微液滴检测，对所述微液滴的个数仍然存在限制，并且耗材成本较高。[0377]请参见图55-60，本发明实施例提供一种微液滴容器60，其包括底面611、围绕所述底面611设置的第一环形侧面621以及环形面641。所述第一环形侧面621与所述底面611相连，并包围形成一个具有开口631的收纳空间630，所述第一环形侧面621垂直于所述底面611。所述环形面641环绕所述开口631设置，并与所述第一环形侧面621相连，所述环形面641与所述底面611平行。

[0378]所述环形面641与所述底面611平行，用以确保所述微液滴容器60中的液体表面为水平面。通过设置于所述环形面641，可以使得所述微液滴容器60的液面呈现出平面状态，避免了所述微液滴容器60的整体液面为弧形。因此，通过所述微液滴容器60不会影响所述容器底板靠近边沿部位的微液滴的观测，便于所述相机331进行拍照成像，提高了所述多个微液滴的检测效率。

[0379]在一个实施例中，所述微液滴容器60进一步包括容器底板610、围绕所述容器底板610设置的第一环形侧板620以及环形板640。所述容器底板610的表面为所述底面611。所述第一环形侧板620的内表面为所述第一环形侧面621，所述第一环形侧板620与所述容器底板610固定连接，并与所述容器底板610共同包围形成所述收纳空间630。所述环形板640的表面为所述环形面641。所述环形板640与所述第一环形侧板620远离所述容器底板610的一端固定连接，且所述环形板640与所述容器底板610平行。

[0380]在通过所述微液滴生成装置10制备所述多个微液滴时，先将所述第二液体699(油相组合物)放置于所述微液滴容器60中。当所述第二液体699的液面与所述环形面641水平面相同时，停止加入所述第二液体699。此时，所述第二液体699的液面与所述环形面641的表面在同一水平面上，可以保证所述微液滴容器60中的所述第二液体699的油面为平面，方便保证容器底面上方的油液的顶面是水平面，便于成像，提高了所述微液滴容器60的利用率，用以容纳更多大量的微液滴。[0381]在一个实施例中，所述环形板640的内周与所述第一环形侧板620远离所述容器底板610的一端连接。所述微液滴容器60还包括第二环形侧板650。所述第二环形侧板650环绕所述环形板640设置并与所述环形板640固定连接，所述第二环形侧板650的半径大于所述环形板640的内径。

[0382]通过所述环形板640、所述第一环形侧板620、所述容器底板610以及所述第二环形侧板650可以分别与所述所述环形面641、所述第一环形侧面621与所述底面611相互配合，形成所述收纳空间630。在所述收纳空间630内，用以容纳所述第二液体699(油相组合物)。所述第二液体699的液面与所述环形面641的表面在同一水平面上，可以保证所述微液滴容器60中的所述第二液体699的油面为平面，方便保证容器底面上方的油液的顶面是水平面，避免了所述微液滴容器的整体液面为弧形，液面呈现凹形液面的问题。从而通过所述荧光信号检测装置30对所述多个微液滴进行荧光检测时，更加的便于成像，提高了所述微液滴容器60的利用率，用以容纳更多大量的微液滴。[0383]在一个实施例中，所述环形板640的外周与所述第一环形侧板620远离所述容器底

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板610的一端连接。

[0384]在一个实施例中，所述第一环形侧板620的外周固定连接于所述第一环形侧面621。通过将所述环形板640与所述第一环形侧板620的连接，可以使得所述微液滴容器60形成一个水平台。当在所述微液滴容器60中加入所述第二液体699时，可以使得所述第二液体699的液面与所述环形面641的表面在同一水平面上，从而可以保证所述微液滴容器60中的所述第二液体699的油面为平面，方便保证容器底面上方的油液的顶面是水平面，避免了所述微液滴容器的整体液面为弧形，液面呈现凹形液面的问题。从而通过所述荧光信号检测装置30对所述多个微液滴进行荧光检测时，更加的便于成像，提高了所述微液滴容器60的利用率，用以容纳更多大量的微液滴。[0385]在一个实施例中，所述微液滴容器60还包括第三环形侧板660。所述第三环形侧板660的一端固定连接于所述底面611。所述第三环形侧板660的另一端固定连接于所述第一环形侧板620的内周。所述第三环形侧板660与所述容器底板610共同包围形成所述收纳空间630。

[0386]在一个实施例中，所述第三环形侧板660与所述容器底板610垂直。通过所述微液滴容器60中所述第三环形侧板660的设置，可以使得所述第二液体699的液面与所述环形面641的表面在同一水平面上，从而使得所述微液滴容器60中的液面为平面，表面了传统情况下的凹液面的产生，便于成像，提高了所述微液滴容器60的利用率。[0387]在一个实施例中，所述微液滴容器60还包括多个环形凸条613，间隔设置于所述底面611，每个所述环形凸条613与所述底面611包围形成一个微液滴收纳槽614。所述微液滴收纳槽614用来收纳生成的所述多个微液滴，并且所述多个微液滴并通过微液滴平铺方法平铺于所述底面611，形成单层微液滴，用于拍照观察。同时，多个所述微液滴收纳槽614之间的间距可以根据所述微液滴生成装置10的排针之间的距离进行设置，从而可以使得一次性在多个所述微液滴收纳槽614内形成多个微液滴，提高了所述微液滴容器60的容纳量，也可以用来检测不同种类的核酸。[0388]在一个实施例中，多个所述环形凸条613的高度为0.1mm-1mm。通过对所述所述环形凸条613高度的设置，可以有利于排除激发光从侧面照射时造成的的阴影，使得所述相机能够获取所有微液滴的荧光信息，提高了所述荧光检测装置的的灵敏度。[0389]在一个实施例中，所述微液滴收纳槽614内壁表面设置有疏油层。[0390]通过在所述容器底板610表面做疏油处理，使得所述底板610与所述微液滴之间的粘黏性降低，表面张力降低，进而摩擦力降低，容易滑落，所述微液滴会自动扩散，防止了所述多个微液滴聚集在一起。同时，可以使得所述多个微液滴在进行平铺时更加快速，有利于所述多个微液滴平铺于所述微液滴容器底板610。当所述容器底板的表面张力小于所述第二液体(油类)699的表面张力时，所述微液滴与所述底板的阻力变小，所述微液滴会自动向所述微液滴反应单元底部扩散，实现平铺。[0391]所述疏油膜也叫疏油层，是一种复合涂层材料，是一种功能性材料涂层，往往具有疏油功能。所述疏油层一般以纳米二氧化硅为原材料(SiO)，采用喷涂工艺，在表面形成涂层，具备良好的透光性和疏水疏油性。所述多个微液滴与所述反应单元接触时，其接触角可以达到90度，可实现自动滚落而不留痕迹，从而可以实现所述多个微液滴平铺于所述微液滴容器底部610。

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在一个实施例中，一种微液滴生成试剂盒包括以上实施例中提到的所述微液滴容

器60、密封盖670以及油相组合物，所述油相组合物放置于所述收纳空间630中，所述密封盖670设置于所述开口631，用以将所述收纳空间630密封。[0393]在一个实施例中，每个反应单元612包括每个所述环形凸条613，以及每个所述环形凸条613与所述底面611包围形成一个微液滴收纳槽614。[0394]所述容器底板610设置有多个反应单元612，每个反应单元612可以放置多个微液滴，从而可以使得所述微液滴容器60可以容纳大批量的微液滴，使得真正检测到的液滴数目会远远超过20000个，不存在对所述微液滴的个数的限制。同时，如果进行大量的微液滴检测，会需要耗费更多的时间。[0395]在一个实施例中，多个所述反应单元612形状为矩形。所述微液滴容器60为方形或长方形。由于，目前为止绝大多数的胶片和数码感光元件CCD/CMOS都是方形的，所以将所述微液滴容器60形状设计为方形，可以提高所述微液滴容器的空间利用率，并且有利于方便形成的荧光图像的拼接，从而实现实时追踪。[0396]在一个实施例中，多个所述反应单元612等间距排列于所述容器底板610。多个所述反应单元612的间距与所述微液滴生成装置10的排针之间的距离相同，以便于同时在多个所述反应单元612内形成大量的微液滴，提高了微液滴生成的速度，节省了时间。同时，也可以通过所述微液滴生成装置10在所述多个所述反应单元612内生成多个体积不同的微液滴。

[0397]在一个实施例中，多个所述环形凸条613的高度为0.1mm-1mm。通过对所述所述环形凸条613高度的设置，可以有利于排除激发光从侧面照射时造成的的阴影，使得所述相机能够获取所有微液滴的荧光信息，提高了所述荧光检测装置的的灵敏度。

[0398]传统的数字PCR检测系统的每个独立反应单元一般放置有一个微液滴。并且，在实际检测过程中，真正检测到的液滴数目不会达到20000个，对所述微液滴的个数仍然存在限制。所以采用所述微液滴容器60可以解决以上问题，不会对所述微液滴个数产生限制。[0399]因此，通过所述容器底板610上的多个所述反应单元612可以容纳大量的微液滴，增大了所述微液滴容器60的收纳量，可以实现大于20000微液滴的检测，并且可以对不同类型的核酸进行检测。通过所述反应单元边框，可以避免使得所述多个微液滴散落至相邻的反应单元612内。

[0400]在一个实施例中，所述微液滴容器60的横截面为矩形。所述微液滴容器60为方形或长方形。所述微液滴容器60形状与相机镜头的形状一致，提高了所述微液滴容器的空间利用率，并且有利于方便形成的荧光图像的拼接，从而实现实时追踪。[0401]在一个实施例中，所述环形面641为一个方形框。[0402]通过在所述容器底板610表面做疏油处理，使得所述底板610与所述微液滴之间的粘黏性降低，表面张力降低，进而摩擦力降低，容易滑落，所述微液滴会自动扩散，防止了所述多个微液滴聚集在一起。同时，可以使得所述多个微液滴在进行平铺时更加快速，有利于所述多个微液滴平铺于所述微液滴容器底板610。当所述容器底板的表面张力小于所述第二液体(油类)的表面张力时，所述微液滴与所述底板的阻力变小，所述微液滴会自动向所述微液滴反应单元底部扩散，实现平铺。[0403]所述疏油膜也叫疏油层，是一种复合涂层材料，是一种功能性材料涂层，往往具有

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疏油功能。所述疏油层一般以纳米二氧化硅为原材料(SiO)，采用喷涂工艺，在表面形成涂层，具备良好的透光性和疏水疏油性。所述多个微液滴与所述反应单元接触时，其接触角可以达到90度，可实现自动滚落而不留痕迹，从而可以实现所述多个微液滴平铺于所述微液滴容器底部610。

[0404]在一个实施例中，所述第一环形侧板620或所述第二环形侧板650的高度为5mm-15mm。通过所述第一环形侧板620或所述第二环形侧板650高度的的设置，可以使得所述微液滴生成装置10在制备所述多个微液滴的过程中，避免所述多个微液滴甩出。并且可以有利于排除激发光从侧面照射时造成的的阴影，使得所述相机331能够获取所有微液滴的荧光信息，提高了所述荧光检测装置30的的灵敏度。[0405]在一个实施例中，所述容器底板610的材质为玻璃、石英或不锈钢等。[0406]在一个实施例中，所述容器底板610的材质为玻璃，价格便宜，耗材成本低。[0407]如果进行大量的微液滴检测，所述微液滴容器60采用玻璃材质，价格便宜，耗材成本低，进行一次检测可以将其丢弃，防止了交叉污染，节省了检测时间，提高了所述数字PCR检测仪1的检测效率。

[0408]在一个实施例中，所述环形凸条613与所述微液滴容器底板610的材料相同。利用工艺技术可以使得所述微液滴容器底板610形成多个所述反应单元612。多个所述反应单元612以阵列形式设置于所述微液滴容器底板610，形成多个核酸扩增单元。[0409]在一个实施例中，所述容器底板610的形状尺寸大小与24孔板和96孔板外形尺寸一致，使得所述微液滴容器60方便应用于其他型号的仪器，更具有实用性与兼容性。[0410]在一个实施例中，所述第一环形侧板620或所述第二环形侧板650的材质为耐高低温、耐油、无荧光的黑色硅橡胶。所述黑色硅橡胶具有无味无毒、不怕高温以及抵御严寒的特点。并且，所述黑色硅橡胶有良好的电绝缘性、耐氧抗老化性、耐光抗老化性、防霉性以及化学稳定性等优点，受到了现代医学领域的重视。[0411]通过所述微液滴容器60，采用玻璃或不锈钢材质，可以降低检测成本。同时，通过所述容器底板610上的多个所述反应单元612可以容纳大量的微液滴，增大了所述微液滴容器的收纳量，可以实现大于20000微液滴的检测，并且可以对不同类型的核酸进行检测，经济实惠。

[0412]所述激发光源340倾斜照射至所述微液滴容器60，用以照射所述多个微液滴。通过所述激发光源340形成的斜射光路可以有效降低激发光散射背景。同时，降低所述微液滴容器60的所述第一环形侧板620或所述第二环形侧板650的高度，有利于排除激发光从侧面照射时造成的的阴影，使得所述相机331能够获取所有微液滴的荧光信息，提高了所述荧光检测装置30的的灵敏度。

[0413]在一个实施例中，所述微液滴生成装置10将所述待测核酸扩增反应液进行微滴化，形成多个微液滴。其中，所述微液滴生成装置10生成的为均一大小的微液滴。然后，通过所述温控装置20对所述多个微液滴进行核酸扩增。同时，采用所述荧光信号检测装置30实时拍测所述多个微液滴的荧光变化图像。通过所述多个微液滴的荧光变化图像，获取所述多个微液滴的荧光变化曲线。根据所述荧光变化曲线，可以获取所述多个微液滴的Ct值，并通过Ct值与起始拷贝数的关系对初始核酸的浓度进行定量分析。[0414]其中，Ct值中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个所述微液滴内的

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荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在实时荧光PCR中，Ct值是指每个所述微液滴内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。也就是说Ct值的含义是：每个微液滴的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。[0415]PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一核酸模板不同时间扩增或同一时间不同微液滴容器内扩增，得到的Ct值是恒定的。当所述微液滴对应的荧光曲线为扩增曲线时，此时表明所述微液滴中含有目标基因成分。当所述微液滴对应的荧光曲线为一条直线时，此时表明所述微液滴中不含目标基因成分。从获取的实时荧光曲线，可以获得Ct值，每个微液滴的Ct值在获取时，对所述实时荧光曲线进行求导，所述实时荧光曲线的斜率固定的荧光曲线的起始循环次数即为所需要的Ct值。

[0416]所述微液滴生成装置10生成的为均一大小微液滴，通过温控装置20对所述多个微液滴进行核酸扩增反应，并采集产物信号，如荧光、紫外吸收、浊度等信号。所述数字PCR检测仪1将所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、所述荧光信号检测装置30以及所述定量分析装置40集成化，使得所述操作人员可以通过一体式数字PCR检测机1实现自动化操作，提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。[0417]所述数字PCR检测仪1的检测过程主要包括5个环节：制备待测核酸扩增反应液、待测核酸扩增反应液微滴化、核酸扩增、荧光信息的采集以及定量分析。[0418]请参见图61，在一个实施例中，一种数字PCR检测仪的分析方法，包括以下步骤：[0419]S10，制备待测核酸扩增反应液；[0420]S20，将所述待测核酸扩增反应液微滴化，形成多个微液滴；[0421]S30，将所述多个微液滴进行核酸扩增，并实时获取所述多个微液滴的荧光信息；[0422]S40，根据所述多个微液滴的荧光信息，对所述多个微液滴进行定量分析。[0423]在一个实施例中，所述步骤S10包括：[0424]制备需要检测的核酸扩增反应液。所述核酸扩增反应液中包含待检测的核酸模板、反应缓冲水溶液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、聚合酶和产物标记物质等。[0425]其中，核酸扩增反应液，可以是以脱氧核糖核酸(DNA)为模板的核酸扩增反应液(可称为DNA扩增反应液)，也可以是以核糖核酸(RNA)为模板的逆转录核酸扩增反应液(可称为RNA反转录反应液)，还可以是其它核酸扩增反应液，如环介导等温扩增(LAMP)反应液。其中，所述DNA扩增反应液的特点是含有DNA扩增所需要的dNTP、缓冲液、无机盐离子、聚合酶、引物、待检测的DNA模板以及荧光染料或荧光探针等。反应液中的荧光染料或荧光探针能指示核酸扩增，可以是SYBR Green等与DNA结合的荧光染料，也可以是同时含有荧光基团和淬灭基团的寡糖核苷酸探针，如TaqMan荧光探针等。[0426]在一个实施例中，准备专供数字PCR使用的成套试剂和溶液，用来减少或避免外源DNA对模板DNA样本的潜在污染。所使用的所有仪器和耗材应该进行高温灭菌，高温干燥处理。所述待检测核酸扩增反应液成分包括：待扩增的模板DNA、用来扩增模板的特异性寡核苷酸引物、耐热DNA聚合酶、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸底物、二价金属阳离子Mg2+、Taqman探针或荧光染料及PCR缓冲液等。[0427]在一个实施例中，制备所述待测核酸扩增反应液时，采用Taqman探针对所述待测核酸扩增反应液进行标记。

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Taqman探针原理：核酸扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探

针。所述荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。核酸扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

[0429]在一个实施例中，制备所述待测核酸扩增反应液时，采用SYBR荧光染料对所述待测核酸扩增反应液进行标记。[0430]SYBR荧光染料原理：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。然而，不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。[0431]在一个实施例中，所述步骤S20将所述待测核酸扩增反应液微滴化，用以形成多个微液滴包括两种微液滴生成方法：瞬时加速的微液滴生成方法以及变速周期的微液滴生成方法。

[0432]通过所述微液滴生成装置10将所述待测核酸扩增反应液进行微滴化处理，可以获取大批量的微液滴，用于所述数字PCR检测仪1的检测。其中，所述驱动液体1214为一种与所述待测核酸扩增反应液互不相容且互不影响的液体。所述第一液体190为所述待测核酸扩增反应液，所述第二液体699为油相混合物。

[0433]将制备好的核酸扩增反应液通过所述微液滴生成装置，可以制备出大批量的微液滴。在制备所述多个微液滴的过程中，将所述多个微液滴放置于所述微液滴容器内，用以方便对所述多个微液滴进行检测。[0434]在一个实施例中，通过所述微液滴生成装置10在所述第二液体中生成大量的微液滴，可以保持所述多个微液滴之间不融合。[0435]聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。PCR检测技术用来诊断遗传性疾患、检测临床标本中病原体的核酸、对法医标本作遗传学鉴定，以及分析激活癌基因中的突变情况等方面获得了广泛的应用。

[0436]数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术。数字PCR中通过所述微液滴生成装置在所述微液滴容器中生成多个微液滴，并将落至所述微液滴容器的底部，不规则的堆积在一起。通过微液滴生成装置制备的多个微液滴在向下沉降过程当中，集中集合在微液滴容器的中间部位，聚集在一起，不利于观察。基于此，有必要针对集中聚集在微液滴容器底部的问题，提供一种微液滴平铺方法。[0437]在一个实施例中，所述步骤S30包括：[0438]S310：将所述多个微液滴平铺于所述微液滴容器中；[0439]S320：将平铺后的所述多个微液滴进行核酸扩增；[0440]S330：在所述多个微液滴进行核酸扩增时，实时对所述多个微液滴进行拍照检测。[0441]请参见图62，在一个实施例中，所述步骤S310包括一种微液滴平铺方法。所述微液滴平铺方法包括：[0442]S311，提供一微液滴容器60，所述微液滴容器60具有开口631，且所述微液滴容器

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60内盛有第二液体699；[0443]S312，提供第一液体190，所述第一液体190的密度大于所述第二液体699并与所述第二液体699不互溶，并将所述第一液体190生成多个微液滴层叠堆积于所述微液滴容器底板610；

[0444]S313，对所述多个微液滴进行高低温循环，直至所述多个微液滴平铺于所述容器底板610。

[0445]在所述微液滴容器60中生成多个微液滴，并将落至所述微液滴容器60的所述容器底板610，不规则的堆积在一起。当大量的微液滴降落至所述容器底板610时，会在所述容器底板610形成多层的微液滴。并且通过微液滴生成装置制备的多个微液滴在向下沉降过程当中，集中集合在微液滴容器的中间部位，聚集在一起，不利于观察。[0446]在一个实施例中，所述第二液体699为油相组合物。[0447]在一个实施例中，所述油相组合物的组分包括矿物油以及表面活性剂。所述油相组合物中矿物油的体积百分比为88％-98.5％。所述表面活性剂包括含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂，所述油相组合物中含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂的体积百分比为1.5％-12％。[0448]在一个实施例中，所述第一液体为待测核酸扩增反应液。[0449]在一个实施例中，所述步骤S312包括：[0450]S3122，提供具有出口端112的吐液枪头110，所述吐液枪头110内储存有第一液体190；

[0451]S3124，将所述吐液枪头110的出口端112插入所述第二液体699的液面下，并做速度大小呈周期变化的运动，在速度大小变化的前半周期与后半周期内，所述吐液枪头的出口端的速度大小均单调变化；[0452]S3126，根据所述吐液枪头110的出口端112的周期变化的运动，所述第一液体190由所述吐液枪头110的出口端112排出，在所述第二液体699液面下形成多个微液滴，并堆积于所述微液滴容器底板610。[0453]在一个实施例中，所述步骤S3124中，所述吐液枪头110的出口端112在所述第二液体699的液面下的速度大小呈余弦曲线变化。[0454]在一个实施例中，所述步骤S3124中的所述吐液枪头的110出口端112在第二液体699液面下的周期变化的运动轨迹包括直线段、圆弧段、多边形等多种轨迹中的一种或多种的组合。

[0455]在一个实施例中，所述步骤S312包括：[0456]S3121，提供具有出口端112的吐液枪头110，所述吐液枪头110内储存有第一液体190；

[0457]S3123，将所述吐液枪头110的出口端112插入所述第二液体699的液面下，瞬时加速运动；

[0458]S3125，根据所述吐液枪头110的出口端112的瞬时加速运动，所述第一液体190由所述吐液枪头110的出口112端排出，在所述第二液体699液面下形成多个微液滴，并层叠堆积于所述微液滴容器底板610。[0459]在一个实施例中，所述步骤S3123中，所述吐液枪头110的出口端112的瞬时加速的

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周期运动的前半周期与后半周期内，所述吐液枪头110的出口端112的速度大小相同，方向相反。

[0460]在一个实施例中，所述步骤S3123中的瞬时加速的周期运动的运动轨迹包括直线段、圆弧段、多边形等多种轨迹中的一种或多种的组合。[0461]在一个实施例中，所述步骤S313包括：[0462]S3131：将所述多个微液滴升温；[0463]S3133：将所述多个微液滴降温；[0464]S3135：将所述多个微液滴进行高低温循环多次，直至所述多个微液滴平铺于所述微液滴容器底板。

[0465]在一个实施例中，在通过所述微液滴生成装置10制备所述多个微液滴时，先将所述第二液体699放置于所述微液滴容器60中。当所述第二液体699的液面与所述环形面641相同时，停止加入所述第二液体699。此时，所述第二液体699的液面与所述环形面641的表面在同一水平面上，可以保证所述微液滴容器60中的所述第二液699体的油面为平面，方便保证容器底面上方的油液的顶面是水平面，便于成像。

[0466]在所述第二液体699中通过所述微液滴生成装置10将待测核酸扩增反应液微滴化，形成大量微液滴。所述多个微液滴降落至所述微液滴容器底板610的多个所述反应单元612内。所述环形面641所述容器底板610平行，用以确保所述微液滴容器中的第二液体699为水平面。在每个反应单元612可以放置多个微液滴，从而可以使得所述微液滴容器60可以容纳超过20000个的微液滴。[0467]在一个实施例中，在所述步骤S3125中根据所述吐液枪头110的出口端112的瞬时加速运动的运动轨迹，所述多个微液滴平铺于所述微液滴容器底板610。

[0468]通过所述吐液枪头110的出口端112的瞬时加速运动的运动轨迹可以使得所述多个微液滴在滴落至所述微液滴容器60中时，可以相互错开，使得所述多个微液滴在滴落至所述微液滴容器60中时，彼此之间没有相互堆积。从而使得所述多个微液滴平铺于所述微液滴容器60中，方便进行拍照观测。[0469]在一个实施例中，所述微液滴容器底板610涂覆有疏油层。[0470]所述疏油层也叫疏油涂层，是一种复合涂层材料，是一种功能性材料涂层，往往具有疏油功能。所述疏油层一般以纳米二氧化硅为原材料(SiO)，采用喷涂工艺，在屏幕表面形成涂层，具备良好的透光性和疏水疏油性。[0471]在一个实施例中，用于以上实施例中的微液滴平铺方法，所述温控装置20包括柔性电路板220、与所述柔性电路板220间隔设置的加热基板240以及设置于所述柔性电路板220与所述加热基板240之间的多个半导体电偶对230。[0472]通过所述温控装置20进行高低温循环，利用热胀冷缩的原理，进行平铺。当物体温度升高时，分子的动能增加，分子的平均自由程增加，所以表现为热胀。同理，当物体温降低时，分子的动能减小，分子的平均自由程减少，所以表现为冷缩。随着温度的变化，当温度升高时，样本液滴的粘稠度变低、体积收缩。同时，温度越高粘度越低，当温度在60℃左右时，样本液滴形状最软，此时形状大概呈现为六边形，然而在其他的温度情况下，样本液滴形状的可变性较差，不容易实现在液滴容器中平铺。[0473]请参见图63，将多个微液滴滴落至微液滴容器60中，所述多个微液滴堆积在所述

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微液滴容器底板610，亦即所述多个微液滴在所述微液滴容器底板610上形成多层微液滴。在荧光信号检测过程中，对所述多个微液滴进行拍照时，造成多层之间的相互影响，影响所述多个微液滴的拍照检测。因此，将容纳有所述多个微液滴的所述微液滴容器60进行高低温循环。将所述多个微液滴进行高低温循环多次，直至所述多个微液滴平铺于所述微液滴容器底板610，使得大批量的所述微液滴平铺于所述反应单元612内，便于海量液滴大规模平行观测。

[0474]在一个实施例中，通过所述温控装置20进行高低温循环的步骤如下：[0475]首先，将所述多个微液滴进行升温加热至90℃～95℃，并加热5min～10min；[0476]然后，将所述多个微液滴降温至40℃～60℃，并退火延伸30s～60s；[0477]最后，依次循环多次，降温至0℃～10℃，对所述多个微液滴保存。[0478]在一个实施例中，通过所述温控装置20进行高低温循环的步骤还包括：[0479]首先，将所述多个微液滴进行升温加热，将温度加热至95℃，并加热10min；将所述多个微液加热至95℃，并加热10min，用以将所述多个微液滴中的酶进行热启动。[0480]然后，所述多个微液滴完成酶热启动之后，对所述多个微液滴进行变性30s；[0481]其次，所述多个微液变性之后，降温至55℃，并退火延伸45s，对所述多个微微液进行拍照，并进行45次循环；[0482]最后，循环45次之后，降温至4℃，对所述多个微液进行长时间保存。

[0483]所述待测核酸扩增反应液通过所述微液滴生成装置10生成多个微液滴，用以进行检测。通过所述微液滴生成装置10制备的所述多个微液滴在向下沉降过程当中，集中集合在所述微液滴容器60的中间部位，聚集在一起，不利于观察。所以，为了更加精确的获取所述多个微液滴的核酸扩增反应的相关信息，需要将所述多个微液滴平铺在所述微液滴容器中。通过将所述多个微液滴平铺在所述微液滴容器中，形成一层，从而避免了多层微液滴之间的相互影响，使得所述荧光信号检测装置30拍照检测，获取更加精确地荧光信息，以便于定量分析。

[0484]PCR反应条件为温度、时间和循环次数。[0485]温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

[0486]变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

[0487]退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50％的引物，

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55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。[0488]在允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30sec～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子；70℃60核苷酸/S/酶分子；55℃24核苷酸/S/酶分子；高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。[0489]所以，PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3min～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

[0490]在一个实施例中，所述步骤S320将所述多个微液滴进行核酸扩增的步骤如下：[0491]首先，将所述微液滴容器60放置于所述温控装置20的所述加热基板240上；[0492]然后，将所述多个微液滴进行升温加热，将温度加热至95℃，并加热10min；将所述多个微液加热至95℃，并加热10min，用以将所述多个微液滴中的酶进行热启动。[0493]其次，所述多个微液滴完成酶热启动之后，对所述多个微液滴进行变性30s；[0494]再次，所述多个微液变性之后，降温至55℃，并退火延伸45s，并进行45次循环；[0495]最后，循环45次之后，降温至4℃，对所述多个微液进行长时间保存。[0496]所述温控装置20采用所述柔性电路板220和所述导热增强层250，使所述微液滴容器60温度分布均匀，加快了所述半导体致冷器的导热性能。当所述多个微液滴在不同温度范围内进行核酸扩增时，设置于所述导热增强层250表面的的温度传感器260与所述第二控制器210连接，可以检测所述微液滴容器60的实时温度，进而将温度信息反馈给所述第二控制器210，从而实现对所述多个微液滴加热温度的控制。可以实现迅速在几秒时间内进行切换。所述温控装置20可以实现瞬时升温降温，进而升温降温的过程缩短了，从而实现了高低温的循环，将所述数字PCR检测仪1的检测时间缩短了，提高了检测效率。[0497]通过所述温控装置20可以使得所述多个微液滴进行核酸扩增。基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸的三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸，在适合的温度范围内对核酸进行扩增。同时，在核酸扩增过程中，所述微液滴容器底板610与所述温控装置20的所述导热增强层250紧密帖合，两者之间不会有间隙，加热均匀，提高了所述数字PCR检测仪1的准确性。[0498]在一个实施例中，在所述多个微液滴进行核酸扩增的过程中，通过所述荧光信号检测装置30对所述多个微液滴进行拍照检测。[0499]通过所述荧光信号检测装置30，对所述多个微液滴进行拍照。其中，所述激发光源340给所述多个微液滴提供蒸发、原子化或激发的能量，从所述微液滴容器60上方采取倾斜角度照射在所述微液滴容器60上。采用所述荧光信号检测装置30实现对所述多个微液滴进行周期性的二维扫描，并实时进行拍照。所述微液滴容器60内的所述多个微液滴的内部荧光被激发，通过所述第二滤光片333被上方的所述物镜332收集，进入所述相机331，所述相机331采集所述多个微液滴的荧光图像。所述第三控制器310可以同步开启所述多个不同颜色的LED光源341和所述相机331。

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通过所述荧光信号检测装置30可以使得所述多个微液滴荧光成像，一次拍摄一定

数量的所述多个微液滴的荧光图像，然后利用图像处理技术，将图像中的液滴荧光进行自动识别，从而得到液滴的荧光信息。[0501]在一个实施例中，通过所述荧光检测装置30拍照步骤，所述微液滴容器60中的每个微液滴可以获得45张荧光图片，用以进行定量分析。[0502]在一个实施例中，所述步骤S330在所述多个微液滴进行核酸扩增时，实时对所述多个微液滴进行拍照检测的步骤如下：[0503]首先，将所述多个微液滴进行升温加热，将温度加热至95℃，并加热10min；将所述多个微液加热至95℃，并加热10min，用以将所述多个微液滴中的酶进行热启动；[0504]然后，所述多个微液滴完成酶热启动之后，对所述多个微液滴进行变性30s；[0505]其次，所述多个微液变性之后，降温至55℃，并退火延伸45s，通过所述荧光检测装置对所述多个微微液进行拍照，并进行45次循环，获得45张所述多个微液滴的荧光图像；[0506]最后，循环45次之后，降温至4℃，对所述多个微液进行长时间保存。[0507]通过所述聚焦透镜346的光路倾斜照射于所述多个微液滴，使得所述微液滴容器60中含有荧光物质的微液滴产生荧光。通过所述荧光探测组件330对所述含有荧光物质的微液滴进行荧光信息采集，并将所述含有荧光物质的微液滴进行荧光信息以荧光图像的形式传输至计算机，用以进行定量分析。

[0508]采用所述荧光成像的检测方法一次拍摄一定数量的所述微液滴的荧光图像，然后利用图像处理技术，将图像中的液滴荧光进行自动识别，从而得到液滴的荧光信息。由于所述荧光成像的检测方法的成像范围大，因此，在检测的时候对所述微液滴所处的检测环境的要求较低。

[0509]数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。由于液滴式数字PCR只能进行终点检测，因此只能分辨液滴中是否含有目标DNA，而无法确定起始DNA的拷贝数。同时，传统的液滴式数字PCR都要求生成的液滴数量足够多，且样本浓度不是很大的情况下适用。

[0510]现有液滴数字PCR终点检测方式的限制，最终只采用了一个的数据对样本整体进行参数估计。样本整体的参数估计精度完全取决于阴性液滴数量统计的准确性。当DNA浓度较高时，液滴总量较少时都会造成数量减少，从而影响估计的准确性；在极端情况下，则无法实现定量检测。因此，现有液滴数字PCR终点检测方法有局限性，检测精度低。[0511]若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样本的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。

[0512]以数字PCR为代表的数字核酸扩增技术是新型的核酸模板定量技术，它将待测核酸模板样本分隔成为大量的微反应体系，且核酸模板在这些微体系中的分布符合泊松分布，即绝大多数微体系中只有一个或没有核酸模板，每一个微体系中都可以进行独立的核

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酸扩增反应，扩增结束以后，可以通过计算阳性微体系的数目而对起始核酸模板进行绝对定量。

[0513]由于传统的液滴式数字PCR只能进行终点检测，因此只能分辨液滴中是否含有目标DNA，而无法确定起始DNA的拷贝数。同时，传统的液滴式数字PCR都要求生成的液滴数量足够多，且样本浓度不是很大的情况下适用。

[0514]由于现有液滴数字PCR终点检测方式的限制，最终只采用了一个的数据对样本整体进行参数估计。样本整体的参数估计精度完全取决于阴性液滴数量统计的准确性。当DNA浓度较高时，液滴总量较少时都会造成数量减少，从而影响估计的准确性。极端情况下，则无法实现定量检测。

[0515]在一个实施例中，所述核酸待测样本为包含有DNA的待测样本。所述微液滴生成装置10生成的均一大小微液滴，通过温控装置20对所述多个微液滴进行核酸扩增反应，并采集产物信号，如荧光、紫外吸收、浊度等信号。利用所述多个扩增与非扩增微液滴在组成上的差异，对获得目标序列扩增的液滴数量进行分析，最终实现对核酸分子的定量分析。在对微液滴进行加热的过程中，实时拍测所述多个微液滴的荧光变化图片，获取多个微液滴的Ct值，并通过Ct值与起始拷贝数的关系对初始DNA的浓度进行定量分析。[0516]若含有目标DNA的微液滴扩增后，其荧光信号的强度达到一定水平，显示为阳性；若DNA含量为零的微液滴几乎检测不到荧光信号，视为阴性。[0517]假设：数字PCR中的微液滴含有的起始DNA拷贝数为x，根据数理统计理论，x＝k(k＝0，1，2，3.....)的概率分布函数P符合泊松概率模型，其中λ为微液滴中含有的平均分子拷贝数。

[0518][0519]

因此，通过所述泊松分布模型期望值μ与方差σ，可知期望值μ为λ，方差σ为λ。因

此，可知数字PCR中每个微液滴中包含目标DNA分子的拷贝数为λ，所以求得的λ值就能够实现核酸的定量检测。

[0520]假设所述待测核酸扩增反应液的总体积为V(每个微液滴的体积为v)，则所述待测核酸扩增反应液浓度c(copy/μL)为：

[0521]

所以，求得λ的值，就能实现DNA的定量检测。[0523]其中，实时荧光定量PCR无需内标是建立在Ct值的重现性与Ct值与起始DNA浓度的线性关系基础之上的。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一DNA模板不同时间扩增或同一时间不同微液滴容器内扩增，得到的Ct值是恒定的。[0524]当所述微液滴对应的荧光曲线为扩增曲线时，此时表明所述微液滴中含有目标基因成分。当所述微液滴对应的荧光曲线为一条直线时，此时表明所述微液滴中不含目标基因成分。

[0525]从获取的实时荧光曲线，可以获得Ct值，每个微液滴的Ct值在获取时，对所述实时

[0522]

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荧光曲线进行求导，所述实时荧光曲线的斜率固定的荧光曲线的起始循环次数即为所需要的Ct值。

[0526]在一个实施例中，通过微液滴生成装置10可以生成多个体积大小均一的微液滴。每个所述微液滴大小在微米级。在所述多个微液滴体积均一的情况下，根据所述多个微液滴的荧光信息，对所述多个微液滴进行定量分析。[0527]请参见图64，所述步骤S40包括一种数字PCR定量检测方法。所述数字PCR定量检测方法包括以下步骤：[0528]S4110，获取所有微液滴的多个实时荧光图像，根据所述多个实时荧光图像获得进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线；[0529]S4120，根据所述实时荧光曲线，获得所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值；[0530]S4130，根据所述Ct值与进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数的关系，获得所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数；[0531]S4140，根据所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数，获得所述核酸起始拷贝数的频数分布；[0532]S4150，根据所述核酸起始拷贝数的频数分布，计算泊松分布的参数λ。[0533]通过所述数字PCR定量检测方法解决了结果的假阳性和假阴性。测序平台的样本高通量性，可同时进行上百例样本的检测。同时能利用不同种类的荧光，进行多个位点的检测，加速检测的速度，降低了实验成本。采用数字PCR检测仪通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，大大简化操作步骤，有效节约了准备时间和检测时间，且结果判读直观可靠，具有可以稳定实施的特点，检测灵敏度及精确性都达到精准定量的要求，提高了检测的灵敏度和精确性。

[0534]所述数字PCR定量检测方法可以应用于临床疾病诊断、动物疾病检测、食品安全、科学研究以及应用行业等领域。例如：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断等。[0535]在一个实施例中，所述S4110包括：[0536]S4111，根据每个实时荧光图像，获得每个进行核酸扩增的微液滴的荧光强度值；[0537]S4113，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的荧光强度值，获得每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线；[0538]S4115，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的荧光曲线，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线。[0539]在一个实施例中，所述步骤采集所述多个微液滴的荧光图像，并进行图像追踪。在获取每个微液滴的实时荧光曲线时，需要对每张图像中的每个微液滴分别进行定位，获取每个微液滴的荧光强度。在所述数字PCR检测仪中，会在成像系统中标定，所述荧光图像的每一个像素对应的实际的比例是多少。根据所述荧光图像，提取出所述微液滴的直径对应的是多少个像素，从而得到直径对应多少个微米，也就可以获得所述微液滴的直径是多少根据之前。

[0540]在一个实施例中，对每个微液滴进行追踪时，还可以通过在每个温度循环过程中拍摄的照片，进行NCAST图像差分及聚类运算，识别到每个微液滴的位置，进而获取所述多

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个微液滴的荧光强度。

[0541]在一个实施例中，如果在一个温度循环过程中造成的微液滴移动距离不大于一个微液滴的直径，可以采用以下方法尽心微液滴追踪。其中，对每个微液滴进行追踪时，对每个微液滴进行图像追踪步骤如下：[0542]首先，识别每次温度循环过程中拍摄的照片，获得每个微液滴的圆心位置；[0543]然后，将当前识别的每个微液滴的圆心位置与前一次循环过程中的每个微液滴的圆心位置对比；[0544]最后，若当前识别的每个微液滴的圆心位置与前一次循环过程中的每个微液滴的圆心位置的圆心间距小于一个微液滴直径，则标记为同一个微液滴。[0545]在一个实施例中，根据每个温度循环过程中每个微液滴的荧光强度值，获取每个微液滴的荧光曲线。通过对每次温度循环过程中每个微液滴的各个部位的荧光强度值求和，作为每个微液滴的某一特定时刻的荧光强度值。[0546]在一个实施例中，为了防止相邻的每个微液滴的边缘部位的互相影响，每个微液滴的某一特定时刻的荧光强度值采用部分求和方式。通过每次温度循环过程中所述多个微液滴的荧光强度值，可以获得所述多个微液滴在全部循环过程中的变化情况，获取每个微液滴的荧光曲线。在一个实施例中，每个微液滴进行了45次循环，共获得45张荧光图片。通过对45张荧光图片中每个微液滴进行定位，并获取每个微液滴的45个荧光强度值，从而获取每个微液滴的荧光曲线。[0547]在一个实施例中，所述S4120包括：[0548]S4121，对每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线求导，获取所述每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线的斜率；[0549]S4123，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线的斜率，获取所述每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线的斜率中斜率固定不变的数值；[0550]S4125，根据所述斜率固定不变的数值，获取其对应的起始循环数，所述起始循环数为每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值；[0551]S4127，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值。

[0552]在一个实施例中，所述S4120还包括：[0553]S4122，根据每个进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线，获得每个进行核酸扩增的微液滴的荧光域值的缺损值；[0554]S4124，根据每个进行核酸扩增的微液滴的荧光域值的缺损值，获得其对应的循环数，所述循环数为每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值；[0555]S4126，根据所述每个进行核酸扩增的微液滴的Ct值，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值。[0556]其中，Ct值中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在实时荧光PCR中，Ct值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺损设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold＝10×SDcycle 3-15。

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在一个实施例中，PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值

的缺损设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold＝10×SDcycle 3-15。根据所述荧光域值的缺损值threshold，获取相对应的循环数，所述循环数为所述Ct值。[0558]在一个实施例中，所述S4130中所述每个微液滴的Ct值与所述每个微液滴的DNA起始拷贝数的对数存在线性关系。[0559]在一个实施例中，每个模板(DNA)的Ct值与该模板(DNA)的起始拷贝数的对数存在线性关系。所述线性关系表示为：

[0560][0561]

x0为初始模板(DNA)量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物

的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。[0563]lg(x0)＝lgN-Ct lg(1+Ex),Ex＜1[0564]其中x0为模板(DNA)的起始拷贝数。[0565]Ct值与起始DNA浓度的关系为：每个DNA模板的Ct值与DNA模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。[0566]在一个实施例中，所述S4140包括：[0567]S4141，根据所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数，获得所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数中的最大值和最小值；[0568]S4143，根据所述最大值与所述最小值，选取组距和组数，获得所述核酸起始拷贝数的频数分布。[0569]其中，频数是指落在不同区间中的数据个数。不同区间的频数之和等于这组数据的总数。

[0570]在一个实施例中，所述S4150中计算泊松分布的参数λ时，采用最大似然估计方法。[0571]其中，对于液滴式PCR，单个液滴中所包含的起始拷贝数满足Poisson分布。

[0572][0562]

其中λ为所述微液滴中平均包含的起始DNA拷贝数。每个液滴中包含的平均起始拷贝数用CPD(copies per droplet)来表示。[0574]在一个实施例中，根据Ct值能够分别获得起始具有k(k＝0,1,2,3…)个DNA起始拷贝数的液滴数量nk，采用最大似然估计方法，获得：

[0575][0576]

[0573]

其中，所述微液滴的DNA起始拷贝数对应的频数值为nk，亦即：k＝0个DNA起始拷贝数时，对应出现的所述微液滴个数为n0个；k＝1个DNA起始拷贝数时，对应出现的所述微液滴个数为n1个；k＝2个DNA起始拷贝数时，对应出现的所述微液滴个数为n2个；k＝3个DNA起

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始拷贝数时，对应出现的所述微液滴个数为n3个，依次类推。采用此方法无需保证阴性暗液滴的数量。另外使用完整的频数分布数据对整体进行最优参数估计的精度要比单独采用一个频点进行估计的精度和稳定性高得多。[0577]请参见图65，在一个实施例中，一种数字PCR定量检测方法，包括以下步骤：[0578]S4210，获取所有微液滴的多个实时荧光图像，根据所述多个实时荧光图像获得进行核酸扩增的微液滴的实时荧光曲线；[0579]S4220，根据所述实时荧光曲线，获得所有进行核酸扩增的微液滴的Ct值；[0580]S4230，根据所述Ct值与进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数的关系，获得所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数；[0581]S4240，根据所述所有进行核酸扩增的微液滴的核酸起始拷贝数，选取部分核酸起始拷贝数；

[0582]S4250，根据所述部分核酸起始拷贝数，获取所述部分核酸起始拷贝数得频数分布；

[0583]S4260，根据所述部分核酸起始拷贝数的频数分布，对泊松分布进行点估计，获取泊松分布的参数λ。[0584]其中，在一个实施例中，根据所有多个微液滴起始DNA浓度的不完全抽样，采用最小二乘法对泊松分布进行点估计。

[0585]根据所有多个微液滴起始DNA浓度的不完全抽样，还可以采用最大期望算法(Expectation Maximization Algorithm，EM)、蒙特卡罗(Markov chain Monte Carlo，MCMC)方法对泊松分布进行点估计。所述蒙特卡罗(Markov chain Monte Carlo，MCMC)方法为贝叶斯方法的一种。

[0586]在一个实施例中，所述S4260包括在一个区间[λλλ，使得所述部分核min,max]内搜索酸起始拷贝数的频数值误差平方和err最小。[0587]在一个实施例中，当所述起始DNA浓度较小时，含有大于4个拷贝的液滴数量很少(或者可以忽略)。Biorad系统在20000个液滴体系的情况下，一般建议样本DNA浓度不大于6CPD。在实际实验过程中，k>4时，Ct值的区分变小，很难根据Ct值区分一个液滴的起始拷贝数为4或者5，因此只使用x0，x1，x2，x3不完整抽样来对Poisson分布进行点估计。根据不完全抽样对Poisson进行点估计的算法有很多，介绍一种可操作性的算法——最小二乘法。[0588]在一个实施例中，给定一个区间[λλλ在[λλ计算误差min,max]，min,max]区间中搜索，的平方和，选择合适的λ使得误差平方和最小。

[0589]

其中，每个微液滴中含有的DNA起始拷贝数为随机变量x，部分微液滴的DNA起始拷贝数对应的频数值为nk，N为所述多个微液滴的总数。[0591]在一个实施例中，所述S4260中对泊松分布进行点估计的方法还包括矩估计法、顺序统计量法或最大似然法。[0592]其中，点估计的方法还包括：[0593]矩估计法：所述矩估计法是利用样本矩来估计总体中相应的参数。

[0590]

CN 110066857 A[0594]

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首先，推导涉及感兴趣的参数的总体矩(即所考虑的随机变量的幂的期望值)的方

程。然后，取出一个样本并从这个样本估计总体矩。接着使用样本矩取代(未知的)总体矩，解出感兴趣的参数。从而得到那些参数的估计。[0595]顺序统计量法：所述顺序统计量法是用样本中位数估计总体的数学期望的方法。顺序统计量估计法的优点是计算简便，且不易受个别异常数据的影响。如果一组样本值某一数据异常(如过于小或过于大)，则这个异常数据可能是总体的随机性造成的，也可能是受外来干扰造成的(如工作人员粗心，记录错误)。当原因属于后者，用样本平均值估计E(x)显然受到影响，但用样本中位数估计E(x)时，由于一个(甚至几个)异常的数据不易改变中位数的取值，所以估计值不易受到影响。[0596]最大似然法：最大似然法(Maximum Likelihood，ML)也称为最大概似估计，也叫极大似然估计，是一种具有理论性的点估计法。所述最大似然法的基本思想是当从模型总体随机抽取n组样本观测值后，最合理的参数估计量应该使得从模型中抽取该n组样本观测值的概率最大，而不是像最小二乘估计法旨在得到使得模型能最好地拟合样本数据的参数估计量。

[0597]在实际过程中，所述数字PCR定量检测方法，不依赖于标准曲线而能够高精度地测定所述多个微液滴的起始DNA浓度。在所述数字PCR检测仪1中，会在成像系统中标定，所述荧光图像的每一个像素对应的实际的比例是多少。根据所述荧光图像，提取出所述微液滴的直径对应的是多少个像素，从而得到直径对应多少个微米，也就可以获得所述微液滴的直径是多少。

[0598]通过数字PCR定量检测方法可以实现所述多个微液滴的动态跟踪，在所述多个微液滴进行温度循环过程中都可以找到每个微液滴对应的具体位置，可以实现核酸扩增的全部过程的监测。因此，通过所述数字PCR定量检测方法可以解决所述多个微液滴中存在假阳性的问题。同时，通过对所述多个微液滴荧光曲线进行处理，并进行不依赖于均匀性假设进行的统计修正，而取得真正的绝对定量。[0599]不仅摆脱了对标准曲线的依赖，排除了由标准曲线引起的定量结果不确定的问题，并且解决了液滴式数字PCR终点检测方式的限制，打破了只采用了一个p(x＝0)的数据对待测样本整体进行参数估计的局限性。采用所述实时荧光定量PCR检测方法，提高了数字PCR定量检测的准确性。

[0600]采用所述数字PCR定量检测方法无需保证阴性空液滴的数量。同时，采用多维度的频数分布数据对整体进行最优参数估计的精度要比单独采用一个p(x＝0)的数据进行估计的精度和稳定性高得多。

[0601]每一个荧光曲线代表一个有用信息的曲线的变化过程，参加了液滴样本信息，以实现实时监测；以设定算法消除相邻液滴之间的相互影响。[0602]所述数字PCR定量检测方法依赖抽象的数学模型，实现了重复性、高灵敏性，并且动态范围变大，可以利用少量液滴实现监测。用小量的数据覆盖更多的信息。同时，所述数字PCR定量检测方法避免了之前泊松分布概率模型的误差，实现绝对定量，更加直观。综合了所有数据，消除了随机误差。获取液滴样本荧光曲线，实时监测液滴样本的荧光亮度的变化，用以去除假阳性；消除相邻液滴之间的相互影响，为后续定量分析模型提供更精确的数据源。

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请参见图66，根据所述部分核酸起始拷贝数分别为0，1，2，3情况下获得的泊松分

布拟合。其中，横坐标为每个液滴中包含的平均起始拷贝数(copies per droplet，CPD)。纵坐标为每个液滴中包含的平均起始拷贝数的标准偏差(standard deviation，Std Dev，STD)。每个液滴中包含的平均起始拷贝数用CPD(copies per droplet)来表示。可知，采用所述部分核酸起始拷贝数获得的每个液滴中包含的平均起始拷贝数用CPD的标准偏差比其他算法获得的平均起始拷贝数用CPD的标准偏差小。因此，本算法获得的每个液滴中包含的平均起始拷贝数用CPD的值更加精确。对20000个液滴进行1000次仿真的结果表明。仅采用单点的估计方法只能覆盖有限的浓度范围，并且估计精度随着样品浓度的升高而急剧恶化。而采用不完全泊松分布拟合算法(N＝0，1，2，3)，随着样品浓度的增加，估计精度没有明显的恶化，并且能够将待测核酸扩增反应液的浓度扩大两倍。对于液滴数量较少的情况下，不完全泊松分布拟合算法(部分抽样泊松分布拟合算法)仍然具有很好的可靠性。[0604]通过仿真结果表明，采用一种数字PCR定量检测方法时，200个液滴的实验体系的精度就可以优于传统的单点估计算法(uCount algorithm)。在液滴数量相近的情况下，泊松拟合算法的稳定性，精度已经可用动态范围都要远优于传统单点估计算法。在实现相同测定精度的情况下，采用泊松拟合算法所需的液滴数量要比传统单点估计算法所需的液滴数量低两个数量级。因此，可以提高数字PCR检测仪1的检测精度，并且扩大了检测范围，可以以少数液滴检测多个不同种类的核酸，提高了数字PCR检测仪1的使用效率。[0605]在一个实施例中，如果所述微液滴生成装置10生成的所述多个均一微液滴的体积有特殊情况下，改变了所述微液滴的体积时，就会存在体积不均一的情况。同时，通过所述微液滴生成装置10也可以生成多个体积不同的微液滴，用以进行医学临床检测。[0606]无论是微孔式还是液滴式数字PCR技术，其反应单元的体积往往保持高度一致，可视为单一体积数字PCR技术。单一体积数字PCR的定量上限主要取决于反应单元的体积和数量，检测下限与样本总体积相关。单一体积数字PCR技术的分辨率和动态范围无法独立调节。同时，连续对待测样本进行稀释，虽然可以扩展其动态范围，但是无法提高检测灵敏度。并且连续稀释的方法增加了试剂的用量和交叉污染的风险，操作步骤繁琐。[0607]多重体积数字PCR(multivolume digital PCR，MVdPCR)，能够在规避连续稀释弊端的同时，使研究人员独立调节动态范围和分辨率，

[0608]多重体积数字PCR的微液滴容器中含有一系列不同体积的反应单元，小体积的反应单元可以对高浓度样本进行定量，大体积的反应单元利用足够的容积实现了高灵敏检测。多重体积数字PCR不需要大量的反应单元却能够达到单一体积数字PCR的动态范围，因此可以再所述微液滴容器中完成更多的样本分析，同时其试剂耗量有效降低。[0609]在所述数字PCR检测仪中，会在成像系统中标定，所述荧光图像的每一个像素对应的实际的比例是多少。根据所述荧光图像，提取出所述微液滴的直径对应的是多少个像素，从而得到直径对应多少个微米，也就可以获得所述微液滴的直径是多少。[0610]在一个实施例中，所述样本溶液为核酸扩增反应液，应用于数字PCR检测仪的定量分析方法中。

[0611]请参见图67，针对以上情况，提出一种不同体积数字PCR的定量分析方法包括：[0612]S4310：获取所有微液滴体积v1，v2，...vm，所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴核酸扩增后的阴性微

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液滴数目b1，b2，…，bm；[0613]S4320：根据所有微液滴核酸扩增后的相关参数v1、v2，...vm，n1，n2，…，nm，b1，b2，…，bm，构建关于核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)；[0614]S4330：根据联合二项分布函数f(c)，求使得所述联合二项分布函数f(c)取极值时c的值；

[0615]S4340：将所述联合二项分布函数f(c)转化为关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)，获得关于ln(c)的标准差以及置信区间；[0616]S4350：根据ln(c)的标准差以及置信区间，获取所述核酸扩增反应液浓度c的标准差以及置信区间。

[0617]在一个实施例中，所述S4310包括：[0618]S4311：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，获得多个不同体积v1，v2，...vm的微液滴，所述微液滴体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm；[0619]S4313：将所有微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所述所有微液滴的荧光图像；

[0620]S4315：根据所述所有微液滴的荧光图像，获取所述所有微液滴的体积为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm。[0621]在一个实施例中，所述S4310还包括：[0622]S4312：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，形成多个微液滴；[0623]S4314：将所述多个微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所有微液滴核酸扩增后的荧光图像；[0624]S4316：根据所述荧光图像，获取所述所有微液滴核酸扩增后的体积，所述体积分别为v1，v2，...vm，所述体积分别为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm。

[0625]在一个实施例中，所述S4320构建关于待测核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)为：

[0626]

假设，在单一体积数字PCR中，每个微液滴的体积为v，待测核酸扩增反应液的核酸

浓度为c，则每个微液滴含有的平均DNA数目为vc，假设每个微液滴含有的分子数为k，则可以通过泊松分布概率模型推导出k的概率分布P：

[0628][0629]

[0627]

对于k＝0即不含目标DNA分子的阴性微液滴，上式可改写为

[0630]p(k＝0)＝e-cv

[0631]在单一体积数字PCR分析中，可以通过微液滴总数n和阴性微液滴b估计出阴性微液滴的概率。[0632]因此，推导出

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对于特定的实验结果，阴性微液滴数目b和总数n是已知的。因此，构建二项方程

式：

[0635][0636]

根据单一体积数字PCR分析过程，假设每个微液滴的体积分别为v1、v2，...vm，每个

微液滴的体积分别对应的数目依次为n1，n2，…，nm。构建关于c的联合二项分布函数：

[0637][0638][0639]

在一个实施例中，所述S4330包括：

S4331：将所述联合二项分布函数f(c)求导，获取所述联合二项分布函数f(c)的导

数

[0640]

S4332：将所述联合二项分布函数f(c)的导数为0，获取所述联合二项分布函数f

(c)取极值时的核酸扩增反应液浓度c的值。[0641]通常函数导数为0时，函数值取极大或极小值。由于二项分布只有一个极大值，因此使函数的导函数为0时的解即为最可能的浓度值。通过使得所述联合二项分布函数f(c)取最大值时，获取相应的c的最大可能数。[0642]在一个实施例中，所述步骤S4340中所述关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)为：

[0643][0644][0645]

将ln(c)代替c，并令θ＝e-λ，Λ＝ln(c)，将所述二项分布函数f(c)转化为：

P函数关于ln(c)比c更具有对称性，因此ln(c)的标准差σ更具有统计学意义。通过强化浓度为正值的约束条件，在低浓度样本分析时有较好的准确度。为简化计算，在计算ln(c)相应的标准差σ时，需要替换相应变量，令[0647]在一个实施例中，所述S4340包括：[0648]S4341：将所述函数F(Λ)取对数，获取函数L(Λ)；[0649]S4342：对所述函数L(Λ)求一阶导数，并将函数L(Λ)的一阶导数为0；[0650]S4343：获取ln(c)相应的标准差σ。[0651]S4344：根据ln(c)相应的标准差σ，获取ln(c)的置信区间。[0652]将所述函数F(Λ)取对数，转化为：

[0653][0654]

[0646]

通过对所述函数F(Λ)取自然对数，可以使得相应的乘法关系变为独立的加法关系，使得对应的导函数更容易处理。[0655]对所述L(Λ)求一阶导数，获得：

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[0656]

令-vi代替ln(θ并用ti表示第i重体积中阳性微液滴的数量，bi＝ni-ti，将步骤4i)，

中的式子转化为：

[0657]

[0658]

[0659]将所述的式子为0，求解

[0660][0661][0662][0663][0664]

在一个实施例中，所述S4343中根据ln(c)的Fisher信息量I(Λ)获取标准差σ。

在一个实施例中，所述S4343中ln(c)的Fisher信息量I(Λ)为：

对于标准差σ，可以结合ln(c)的Fisher信息量I(X)获取，相应的Fisher信息量可

用下公式表示，其中E[]表示相应变量的期望值。

[0665][0666][0667][0668][0669]

在一个实施例中，所述ln(c)相应的标准差σ以及置信区间分别为：

CI＝ln(c)±Zσ。根据

的的公式，求解：

[0670]

[0671]将的式子带入到步骤6中，获得：

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[0673]将公式带入步骤8中的式子，可以获得：

[0674]

[0675]

从而可以从上式中可以获得ln(c)相应的标准差σ，以及置信区间：

[0676]

CI＝ln(c)±Zσ

[0678]其中，Z为标准正态分布的上临界值。[0679]从获得的ln(c)相应的标准差σ，以及置信区间可以得到待测核酸扩增反应液的核酸浓度为c。通过标准正态分布表可以获知相应的数值，从而可以获知ln(c)的的置信区间，进而可以获知待测核酸扩增反应液的核酸浓度为c，从而可以获知所述待测核酸扩增反应液中含有的DNA起始拷贝数目。[0680]其中，置信区间是指由样本统计量所构造的总体参数的估计区间。在统计学中，一个概率样本的置信区间(Confidence interval，CI)是对这个样本的某个总体参数的区间估计。置信区间展现的是这个参数的真实值有一定概率落在测量结果的周围的程度。置信区间给出的是被测量参数的测量值的可信程度，即前面所要求的\"一个概率\"。[0681]数字PCR的定量结果通常需要结合置信区间和置信水平表示。在数字PCR中，置信区间展现的是样本真实浓度以一定概率落在测量结果λ的周围区间的程度，这个概率被称为置信水平。置信区间的两端被称为置信极限。[0682]相比单一体积数字PCR，不同体积数字PCR可以利用少于200个微液滴实现5个数量级的检测动态范围，其性能可以和拥有12000个微液滴的单一体积数字PCR相媲美，节省了仪器的成本，耗材成本降低。同时，也可以对所述微液滴均一体积存在的特殊情况进行修正，使得所述数字PCR检测仪1检测精度提高。[0683]在一个实施例中，检测DNA为：人巨细胞病毒DNA。[0684]以待测样本DNA为模板，加入待测样本DNA对应的检测引物及其探针；[0685]所述实时荧光定量PCR检测方法采用的是Taqman荧光探针。[0686]获取人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒，所述检测试剂盒包括人巨细胞病毒DNA实时荧光定量检测引物及其探针。

[0687]把试剂盒中10^6copies/mL浓度的阳性质控品(非标准浓度)比例稀释，所得浓度：10^6copies/mL、10^5copies/mL、10^4copies/mL、0.5×10^4copies/mL。同时，共制作5个样本浓度，分别为2×10^6copies/mL、10^6copies/mL、10^5copies/mL、10^4copies/mL以及

[0677]

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0.5×10^4copies/mL。其中，所述待测样本的试剂配置比例为：1ul样本(2×10^6copies/mL加入2ul样本)、1ul DNA聚合酶、20ul Buffer，一共为22ul。[0688]将所述样本浓度分别为2×10^6copies/mL、10^6copies/mL、10^5copies/mL、10^4copies/mL以及0.5×10^4copies/mL的样本，分别通过本发明提供的一种数字PCR检测仪、一种QX200数字PCR检测仪以及一种qPCR数字PCR检测仪进行检测，获得表1中通过各个仪器的5个核酸扩增反应液起始拷贝数的检测值与真实值相关系数的对比表。[0689]5个核酸扩增反应液起始拷贝数的检测值与真实值相关系数的对比表

[0690]

仪器类型本仪器QX200数字PCRqPCR数字PCRR20.99930.9980.9923[0691]相关系数R是用以反映变量之间相关关系密切程度的统计指标，用来度量两个变量间的线性关系。从表1中可以看出通过本发明提供的一种数字PCR检测仪检测的5个核酸扩增反应液的起始拷贝数的检测值与真实值的相关系数最大，最接近于1。因此，通过本发明提供的一种数字PCR检测仪检测的5个核酸扩增反应液的起始拷贝数的检测值与真实值的相关系数最大，最接近于1。所以，本发明提供的一种数字PCR检测仪1的检测精度更高，准确度更高。

[0692]所述数字PCR检测仪1将所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、所述荧光信号检测装置30以及所述定量分析装置40集成化，通过控制器50使得所述操作人员可以通过一体式数字PCR检测机1实现自动化操作，提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。

[0693]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0694]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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数字PCR定量检测方法[发明专利]