无菌检验方法适用性试验方案

无菌检验方法适用性试验方案(共

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无菌检验方法适用性试验方案

目 录

1.概述 试验背景

为保证无菌检验结果的准确可靠，当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的适用性试验，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，所采用的方法适合于该产品的无菌检查。按照《中国药典》2015年版四部“通则1101无菌检查法”要求，检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，检查方法应进行重新试验。

根据2015年版药典及药品微生物实验室质量管理指导原则要求，检测环境由原来的为C级背景下局部A级空气单向流，在层流净化工作台下进行无菌检测，变更为在C级背景下，无菌检查ORABS隔离系统中进行无菌检测,且由原来的臭氧消毒，变更为臭氧+过氧化氢灭菌消毒；培养基发生变更：由培养真菌用的改良马丁培养基变更为胰酪大豆胨液体培养基，培养温度由23-28℃变更为20-25℃，现针对XXX注射液进行适用性试验，以证明所采用的方法适合该药品的无菌检查。 方案说明

验证过程中严格按照经批准的方案规定的内容进行，若因特殊原因需要变更时，应填写方案变更申请及批准书，报试验领导小组批准。 2.确认目的

按照《中国药典》2015年版四部“通则1101无菌检查法”规定对小儿氨基酸注射液无菌检查方法进行试验，在现有检验程序、检测条件及培养条件下，对该供试品的适用性试验进行确认，证明所采用的方法适合该药品的无菌检查。

验证过程中应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案变更申请及批准书，报验证领导小组批准。 3.小组人员 4.风险评估 风险等级标准

A.严重程度（S）：测定风险的潜在后果，分为以下四级： 评分 4 严重程度 关键 描述 直接影响产品质量要素或工艺与质量数据的可靠性、完整性2

或可追踪性，可能导致产品不能使用，直接影响GMP原则，危害生产区活动。 直接影响产品质量要素或工艺与质量数据的可靠性、完整性3 高 或可追踪性，可能导致产品召回或退回，未能符合一些GMP原则，可能引起检查或审计中产生偏差。 中（不重要的） 低（可以忽略） 对产品或数据无相关影响，但间接影响产品质量要素或工艺与质量数据的可靠性、完整性或可追踪性，可能造成资源的严重浪费或对企业形象产生较坏影响。 对产品或数据无相关影响，但对产品质量要素或工艺与质量数据的可靠性、完整性或可追踪性仍产生较小影响。 2 1 B.可能性程度(P)：测定风险产生的可能性，为建立统一基线，建立以下四个等级： 评分 4 3 2 1 可能性 极高 高 中 低 描述 极易发生，约一星期一次或者更频繁 偶尔发生，约一个月一次 很少发生，约一年一次 发生可能性极低，三年甚至更长时间都不大可能发生 C.检测能力（D）：在潜在风险造成危害前，检测发现的可能性，设为以下四个等级： 评分 4 3 2 1 检测能力 极低 低 中 高 描述 失败很可能被忽视，因此没有检测到（无检测机制，无人工或视觉校验） 不检测，但可能被发现，如：作为现场检查的审计 定期检测，如：常规的手动控制或分析可检测到错误 始终检测到，如：自动控制装置到位，故障报警或错误后无法下一流程操作 风险分析及评价：根据确定的风险标准对已经识别并分析的风险进行评价，即通过评价风险的严重性和可能性从而确认风险的等级。 质量风险优先级别评价标准如下：

RPN/严重程度 RPN＞16或S=4 8≤RPN≤16 RPN≤7 风险级别 高等风险 中等风险 低等风险 风险处理优先等级 高优先 优 先 忽 略 风险优先系数（RPN）计算：严重程度（S）×可能性程度(P)×检测能力（D）。 风险水平的划分： ① RPN>16 或严重程度=4

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高风险水平：此为不可接受风险。必须尽快采用控制措施，通过提高可检测性及/或降低风 险产生的可能性来降低最终风险水平。验证应首先集中于确认已采用控制措施且持续执行。

由严重程度为4 导致的高风险水平，必须将其降低至RPN 最大=8。 ② 16≥RPN≥8

中等风险水平：此风险要求采用控制措施，通过提高可检测性及/或降低风险产生的可能性 来降低最终风险水平。所采用的措施可以是规程或技术措施，但均应经过验证。 ③ RPN≤7

低风险水平：此风险水平为可接受，无需采用额外的控制措施。 风险的确认 无菌检查结果不成立 风险的分析及评价

依据风险分析及评价结果需实施的确认项目 5.试验前准备 文件确认 序号 1 2 3 4 5 6 文件/资料 编号 存放地点 检查人： 检查日期： 复核人： 复核日期： .仪器确认：

确认检测设备已经检定并在有效期内使用。 确认检测设备运行良好，且满足检测需要。 设备名称 型号 编号 检定有效期至 运行检查 智能集菌仪 培养箱 4

培养箱 检查人： 检查日期： 复核人： 复核日期： 物料、培养基和冲洗液的确认 确认物料、培养基是否在有效期内使用 确认物料、培养基储存条件、性状符合要求。

品名（试验物料） 集菌培养器

品名（已配制培养基） 硫乙醇酸盐流体培养基 胰酪大豆胨液体培养基 沙氏葡萄糖肉汤培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 %无菌氯化钠溶液 %（v/v）聚山梨酯80的无菌氯化钠溶液 胰酪大豆胨琼脂培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 固体批号 厂家 配制日期 批号 有效期 规格 批号 有效期 生产厂家 预培养及灵敏度实验检查

确认培养基已经预培养实验，并预培养合格。 确认培养基已经灵敏度试验检查，并合格。 预培养：胰酪大豆胨液体培养基见【XXXXXX】 硫乙醇酸盐流体培养基见【XXXXXX】 品名 胰酪大豆胨液体培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 批号 培养日期 日 时---- 日 时 日 时---- 日 时 培养条件 操作人 结果判断 灵敏度实验：胰酪大豆胨液体培养基见【XXXXXX】 硫乙醇酸盐流体培养基见【XXXXXX】 品名 胰酪大豆胨液体培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 批号 培养日期 日 时---- 日 时 日 时---- 日 时 培养条件 操作人 结果判断 5

菌种确认：

确认菌种有效期在合格范围内。 名称 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉 6.菌液制备

. 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30〜35°C培养18〜2 4小时；取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌斜面菌苔至3mlXXX注射液中混匀，取1ml至空比浊管与标准比浊管比浊，以至即为10。取10菌液1ml，加入9ml %无菌氯化钠溶液中，做为10稀释液，依次稀释至10。取10~10稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu的稀释级作为试验菌液。

接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30〜35°C培养18〜2 4小时后，取上述培养物1ml，加入9ml %无菌氯化钠溶液中，做为10稀释级，依次稀释至10

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代数 编号 。取10~10稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu的稀释级

作为试验菌液。

接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20〜25°C培养24〜4 8小时，上述培养物用0. 9%无菌氣化钠溶液制成每lm l含菌数小于lOOcfu(菌落形成单位）的菌悬液。取上述培养物1ml，加入9ml %无菌氯化钠溶液中，做为10稀释级，依次稀释至10。取10~10稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu的稀释级作为试验菌液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25°C培养5〜7 天，加人3〜5m l含% (ml/ml)聚山梨酯80的0. 9 %无菌氣化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用管口带有能过滤菌丝的装置（如薄的无菌棉花或纱布的无菌毛细吸管）吸出孢子悬液至无菌试

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管内，用含% (m l/m l)聚山梨醋80的0. 9 % 无菌氯化钠溶液加入%无菌氯化钠溶液中，作为10-1稀释级。依次稀释至10-8。取10-4~10-8稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu/ml的稀释级作为试验菌液。 计数结果

取上述各稀释级各种菌悬液或孢子悬液1ml，分别用融化后45℃左右的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基15ml～20ml注皿，各平行测定两皿。胰酪大豆胨琼脂培养基在30～35℃培养48小时，沙氏葡萄糖琼脂培养基在20～25℃培养72小时，计数l。

表1 平皿计数法，各对照菌菌落计数结果，单位：cfu/ml

菌种 稀释级 计数 平均 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉菌 正式试验 样品信息： 产品名称 包装形式 玻瓶 批号1 批号2 批号3 生产单位 规格 灭菌条件 有效期至1 有效期至2 有效期至3 试验步骤：

产品试验：取同一批次的供试品60瓶，分成六组，每组10瓶。共取三个批次，共计18组。

产品试验：将同一批次的供试品60瓶分六组，每组10瓶。

按薄膜过滤法将一组供试液过滤至一只滤筒内，过滤完毕，加入硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基，然后加入小于100cfu/ml的试验菌。另一管滤加入同等体积同种培养基，再加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培养，培养时间不得超过5 天。各试验菌同法操作。

重复上述操作，做完另五组供试液。 重复三批试验。

每个试验菌每天只需做一次阳性对照。 结果判断：

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与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检验法和检验条件进行供试品的无菌检查。

如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验 试验依据：按无菌检查法（中国药典2015年版四部通则1101）的薄膜过滤法。 培养温度：

细菌培养温度：30~35℃、真菌培养温度：20~25℃ 记录实验结果 7.试验结果与评价：

各工作人员应如实记录各项结果，并及时将数据提交验证小组，验证小组对其分析汇总后，做出相应客观评价。

评价人： 日期： 8.试验过程中的偏差处理

在确认过程中，对于不合格的项目，应进行有针对性的分析，查明原因及时整改，并对该项目重复确认，直至达到方案要求为止。 验证名称： 方案编号： 偏离/不符合 评价： 接收（Yes/No）日期：____________ 评价人： 9.再试验周期：

检验程序或条件、产品组分发生变化时 包装形式及灭菌条件发生变化时 当阳性试验不成立时； 10.批准

由公司确认领导小组负责人根据具体确认结果对小儿氨基酸注射液无菌检验方法的有效性作出批示。

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表1产品试验组、阳性对照组在硫乙醇酸盐培养基中的生长结果

温度：□30~35℃ □20~25℃

硫乙醇酸盐 流体培养基 天数 批号 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌 1 产品试验组 2 3 4 5 1 阳性对照组 2 3 4 5 *每个试验菌株每次只需做一次阳性对照试验

表2产品试验组、阳性对照组在胰酪大豆胨液体培养基的生长结果 温度：□30~35℃ □20~25℃ 胰酪大豆胨液体培养基 天数 批号 白色念珠菌 枯草芽孢杆菌 黑曲霉菌 1 产品试验组 2 3 4 5 1 阳性对照组 2 3 4 5 *每个试验菌株每次只需做一次阳性对照试验

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