中药柴胡的研究进展
摘 要：伞形科柴胡属植物柴胡含有多种化学成分，本文综合讲述了柴胡中主要化学成分及其主要药效成分之一总皂苷的提取、分离和质量评价。
关键字：柴胡 皂苷 提取 质量评价
1. 概 述
柴胡是我国的传统中药和常用中药，《中国药典》规定伞形科多年生草本植物柴胡(北柴胡BupleurumchineseDC)和狭叶柴胡(南柴胡Bupleurumscorzonerifolium Willd)为中药正品的原植物，其同属20余种植物的根也常入药。
柴胡具有驱散退热、舒肝生阳之功效，主治感冒发热、寒热往来、疟疾、胸肋胀痛、月经不调及子宫脱垂等症。现代药理研究证明柴胡具有解热、镇痛、镇静、抗炎、免疫增强、保肝利胆、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等作用，具有极高的药用研究价值。柴胡主要的有效成分是皂苷和挥发油，皂苷为五环三萜类齐墩果烷型衍生物，是最主要的活性成分之一。本篇论文重在讨论柴胡的皂苷类化学成分的提取分离以及质量评价。
2. 化学成分
柴胡根中主要成份为柴胡皂苷，其次含有植物甾醇、侧金盏花醇，以及少量挥发油、多糖;地上部分主要含黄酮类、少量皂苷类、木脂素类、香豆素类等成分。[1]
2.1. 皂苷类
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柴胡中主要含有柴胡皂苷a、c、d;尚含3一0一乙酞基柴胡皂苷a、6一0一乙酞基柴胡皂苷a、柴胡皂苷e、6一0一乙酞柴胡皂苷一a，23一0一乙酞基柴胡皂苷乙一d;6一0一乙基柴胡皂苷一b:，柴胡皂苷一f等。
图1：皂苷结构
皂苷a（C42H68O13）
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化学结构：
物理性质：本品为结晶粉末，易溶于水，稀醇，特别是热水和热醇，在丁醇和戊醇中溶解性大，难溶或不溶于苯，乙醚，氯仿等溶剂。
化学反应：Molish反应阳性，Lieberman-Burchard反应产生紫色。
药理作用[2]：有抗炎作用和降低血清胆固醇和甘油三酯以及镇静、解热作用。
皂苷c（C48H78O17）
化学结构：
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物理性质：易溶于水，稀醇，特别是热水和热醇，在丁醇和戊醇中溶解性大，难溶或不溶于苯，乙醚，氯仿等溶剂。
化学性质：Molish反应阳性，Lieberman-Burchard反应产生紫色。
药理作用：保肝、抗细菌内毒素等作用。
皂苷d（C42H68O13）
化学结构：
物理性质：白色粉末，易溶于热水、稀醇、热甲醇和热乙醇
化学性质：Molish反应阳性，Lieberman-Burchard反应产生紫色。
药理作用：有抗炎作用、降低血清胆固醇和甘油三酯等。
2.2. 挥发油[3]
北柴胡的挥发油中含有2-甲基环戊酮、柠檬烯、月桂烯、桃金娘烯醇、牛儿醇、十六(烷)酸、戊酸甲酯、己酸甲酯、庚酸甲酯、戊酸、己酸、庚酸等80多种成分[4]。
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有关柴胡挥发油的提取条件,已有一些研究报道。李瑞林等通过实验得出一个可以提高柴胡中挥发性成分提取率的新工艺[5]。刘陪建等则以吸光度为指标,采用正交试验,设计出温浸4 h,100 g生药以4 mL/min的蒸馏速度,蒸馏量为原工艺6倍的最佳提取工艺[6]。而药理实验则表明从挥发油中分离得到的低分子醛酮部分、内酯及酚性部分为解热的有效部分,酸性部分为抗炎部分,北柴胡挥发油抗炎作用较南柴胡强,而南柴胡中挥发油主要起解热作用,抗炎作用较弱[7]。
2.3. 黄酮类
柴胡中的黄酮类成分主要为黄酮醇类，又分为山奈酚、槲皮素、异鼠李素三个主要苷元。
2.4. 木脂素类
柴胡中的木脂素类大多为油状物，且多从植物叶中分离得到。目前己从该属植物中分到30个木脂素类化合物，这些化合物有3种结构类型:木脂内酯类、单环氧木脂素及双环氧木脂素。
2.5. 香豆素类
柴胡中分得的香豆素类多为简单香豆素类，它们是脱肠草素、蒿属香豆素、白柠檬素、白蜡树亭、七叶亭等~
2.6. 甾醇类
柴胡的地上部分含有A一菠菜甾醇，柴胡的茎中还含有B一谷甾醇。
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2.7. 多糖
北柴胡多糖基本由阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、半乳糖及鼠李糖组成，南柴胡多糖成分与北柴胡相近，但无鼠李糖而有甘露糖。
3. 总皂苷的提取与分离
3.1 总皂苷的提取与纯化
柴胡皂苷的提取方法最为传统的是溶剂提取法,但随着科学技术的发展和进步,近年来越来越多的新技术如微波辅助萃取法、超声法、半仿生提取法、超临界流体CO2法、大孔吸附树脂提取法等也相继应用于柴胡皂苷的提取,而且取得了显著的效果。
3.1.1. 溶剂提取法
该法是中药中最常用的提取方法[8]。根据柴胡中各种成分在不同溶剂中溶解性不同：
取柴胡细粉50克，置圆底烧瓶中，用含0.5%吡啶的95%乙醇溶液[9]回流提取，提取三次，依次的量为500ml、400ml、300ml，每次1h，合并乙醇提取液，过滤，去除残渣。回收乙醇得浓缩物，加水后用水饱和的正丁醇萃取，将正丁醇回收，加入乙醚使之沉淀，过滤得粗总皂苷。再用热的乙酸乙酯除去油状物后，得精制总皂苷。
该方法适合于在实验室操作，方法原理简单，操作方便，但存在周期长、工序多以及提取率低等问题。
3.1.2. 超临界提取法[10]
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超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extration,简称SFE)技术是近20世纪80年代国际上迅速发展的新一代化工分离技术。
原理：超临界CO2对物料有较好的渗透性和较强的溶解能力。 超临界CO2对溶质的溶解能力随压力和温度的改变在相当宽的范围内变动。提取完成后, 改变体系温度和压力, 使超临界CO2变成普 通气体逸散出去。
SFE-CO2法提取工艺的基本流程：
步骤：将一定量的柴胡干粉投入萃取釜中,对萃取釜、解析釜Ⅰ、解析釜Ⅱ、贮罐分别进行加热或冷却。当达到所选定的温度时,开启CO2气瓶对系统进行加压,当达到所选定的压力时,关闭气瓶,循环萃取,并保持恒温恒压。当达到所选定的萃取时间后,从解析釜Ⅰ、解析釜Ⅱ出料口出料,得柴胡皂苷类成分。
最佳条件是:萃取压力30 MPa,温度65℃;解析釜Ⅰ的压力12 MPa,温度55℃;解析釜Ⅱ的压力6MPa,温度43℃;萃取时间3 h,夹带剂为60%乙醇。
该法可以在接近室温条件下萃取, 适用于热敏性成分的提取,无有机溶剂残留, 产品纯度高, 操作简单, 节能。但SFE-CO2 技术的局限性在于: CO2 因其非极性和分子质量较小的特点, 对许多强极性和相对分子质量较大的物质缺乏足够的溶解性而提取率不高。
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3.1.3. 微波辅助萃取法
20实际90年代开始应用于中药有效成分的提取：是将微波和传统的溶剂提取法相结合的一种萃取方法。利用不同结构的化合物吸收微波能力的差异, 使得细胞内的某些成分被微波选择性加热, 导致细胞结构发生变化, 从而提高有效成分的溶出程度和速度
Wanwipa[11]等对皂苷的提取条件做了研究, 最佳条件为50℃, 料液比(w/v) :l ：150, 微波萃取4 m in。且微波萃取6min能达到的提取率, 有机溶剂提取、索氏提取、热回流提取和超声提取需要2—14 h才能达到。
该法是一种提取时间极短, 设备简单、操作简便、适用范围广、提取效率高, 投资较少的提取中药活性成分的新技术。但这一技术用于中药活性成分的提取尚属起步, 其萃取机理还需进一步研究。
3.1.4. 超声法
基本原理是利用超声波的空化作用加速药物有效成分的浸出提取。
王志花[12]等以溶剂法为基础,利用超声法对柴胡中有效成分进行提取,考察了超声功率、提取温度、提取时间和样品浸渍时间等条件对提取效果的影响, 优选出提取的最佳条件为超声功率50%、提取温度50℃、提取时间20min、样品浸渍时间24h 。
超声提取技术能避免高温高压对有效成分的破坏。但它对容器壁的厚薄及容器放置位置要求较高, 否则会影响药材浸出效果, 而且目前实验研究都是处于很小规模, 要用于大规模生产, 还有待于进一步解决有关工程设备的放大问题。
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3.1.5. 半仿生提取法（SBE法）
在1995年张兆旺[13]等提出了“半仿生提取法”的中药提取新概念。从生物药剂学的角度, 模拟口服给药及药物经胃肠道转运的原理,为经消化道给药的中药制剂设计的一种新的提取工艺:即将药料先用一定pH 的酸水提取, 继以一定pH的碱提取,提取液分别滤过、浓缩,制成制剂。
这种新提取法可以提取和保留更多的有效成分,能缩短生产周期、降低成本，有着广阔的应用前景。
3.1.6. AB- 8大孔吸附树脂纯化柴胡总皂苷[14]
大孔吸附树脂为吸附和筛选原理相结合的分离材料。它的吸附性是由于范德华引力或生成氢键的结果。
树脂预处理: 以95%乙醇浸泡树脂24h,充分溶胀后湿法装柱, 以95%乙醇洗脱至流出液澄清, 流出液与95%乙醇紫外扫描吸收相近为止, 再用蒸馏水洗至无醇味,备用
上柱药液的制备: 取柴胡饮片200g, 取柴胡饮片, 加入10倍量含1.0%无水碳酸钠的80%乙醇, 提取3次, 每次1. 5h。合并滤液, 回收乙醇, 加水稀释250ml，测得柴胡总皂苷的含量。
选用AB- 8大孔吸附树脂,取100m l柴胡提取液，以1BV ml/h的速度上样, 放置2h后, 用去离子水150ml以1BV ml/h的速度洗脱,弃去洗脱液, 再用20%乙醇150ml以1BV ml/h的速度洗脱, 弃去洗脱液, 用70%乙醇150ml以2BV ml/h的速度洗脱, 收集洗脱液,
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减压回收乙醇,干燥,粉碎,得到柴胡总皂苷。
大孔吸附树脂作为一种有机高聚吸附剂, 具有选择性吸附有机化合物的能力, 应用于皂苷类成分的分离有较好的结果。
3.2. 总皂苷的分离－硅胶柱色谱分离[15]
取精制的柴胡总皂苷经硅胶（200～300目）柱层析，用三氯甲烷－苯－乙酸乙酯－甲酸－水（45：2：3：60：40）上行法分离洗脱，分段收集，流份38－48为柴胡皂苷C，流份155－195为柴胡皂苷A，流分235－300为柴胡皂苷D。
4. 柴胡的质量标准
4.1. 理化检识[16]
理化鉴别可以鉴别柴胡皂苷为三萜皂苷类化合物，下面介绍几种简单的理化鉴别方法。
泡沫实验：柴胡皂苷水溶液经强烈振摇能产生持久性泡沫，可为皂苷的鉴别。
显色反应：通过Liebermann-Burchard颜色反应（将样品溶于乙酸酐中，加浓硫酸-乙酸酐数滴，可产生黄红紫蓝的颜色变化，最后褪色）和Molish反应（样品的提取液加5%α-萘酚乙酸1-3滴，摇匀后沿试管壁缓缓加入浓硫酸，在两液面间有紫色环产生，说明样品中有糖或苷类）呈阳性，可推测柴胡皂苷为三萜皂苷类化合物。
溶血实验：柴胡皂苷用生理盐水溶解后，加几滴红细胞悬浮液，溶液由浑浊变澄明，
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发生溶血现象。
4.2. 薄层色谱检识
薄层色谱法是将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定，中国药典收载薄层色谱法用于柴胡总皂苷成分的定性鉴别，此方法快速，简便，准确对仪器要求不高，适宜广泛使用。
药典[17]采用薄层色谱法对柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的进行定性鉴别。以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的甲醇溶液为对照品，在羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上点样，以醋酸乙酯- 乙醇- 水( 8： 2： 1)为展开剂, 喷以2% 对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液, 在60 ℃加热至斑点显色清晰，置日光及紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。
4.3. 含量测定
4.3.1. 紫外可见分光光度法(UV)
浦氏[18]采用紫外可见分光光度法测定柴胡中柴胡总皂苷的含量，以柴胡皂苷d为对照品, 在波长536nm 处对样品中的总皂苷进行含量测定。柴胡总皂苷在194--1940 mg /L有良好的线性关系( r= 0. 9996), 该法的平均加样回收率为97. 35%, RSD为1.02% ( n= 9)。
胡氏等[19]采用紫外可见分光光度法, 以柴胡皂苷d为对照品, 在波长536nm 处对样
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品中的总皂苷进行含量测定。紫外法测定柴胡总皂苷在205--2050mg /L( r= 0. 9997)范围内呈良好的线性关系, 平均加样回收率为98.99%, RSD为1.78%。
此方法准确、简便、快速, 重现性好, 适用于柴胡中总皂苷的含量测定。
4.3.2. 高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。根据色谱柱填充剂的不同常用的有正相色谱系统、反相色谱系统和离子交换色谱系统。最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
闵氏等[20]采用高效液相色谱法(HPLC)，选用伊利特C18柱，以乙腈-水（40∶60）为流动相，检测波长为210 nm，流速为1.0ml/min测定柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。以柴胡皂苷a和d为对照品，并进行方法学考察，线性关系、精密度实验，重现性实验，稳定性试验均良好，可以作为柴胡皂苷类成分的含量测定方法。
柴胡皂苷a, d的HPLC法测定,多采用210 nm左右作为检测波长, 但利用末端吸收进行定量分析, 对流动相纯度要求较高, 而且检测灵敏度低, 基线易发生漂移, 采用蒸发光散射检测器基线平稳, 检测灵敏度显著提高。
麻氏等[21]采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定野生狭叶柴胡根、茎、叶的柴胡皂苷a含量，色谱柱为Symmetry Shield RP C18柱(150mm*39mm，5μm) ，以乙腈-
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水为流动相进行梯度洗脱，检测波长210nm。以柴胡皂苷为对照品，并进行方法学考察，线性关系、精密度实验，重现性实验，稳定性试验均良好，可以作为柴胡皂苷类成分的含量测定方法。
高效液相色谱法有良好的重现性、可操作性, 适用于对成分多样性、复杂性、分离难度大的中药检验。在柴胡皂苷类成分的含量分析中，适合检验单一的柴胡皂苷。
4.3.3. 高效液相指纹图谱
赵氏等[22]研究柴胡总苷的高效液相色谱指纹图谱,测定柴胡总苷中柴胡苷a、d的含量。 利用HPLC-DAD检测、梯度洗脱的方法,在210nm波长的条件下,以乙腈-水为流动相，二元梯度洗脱：30%-40%乙腈（0-20min），40%-50%乙腈（20-35min），50%-60%乙腈（35-45min），流速1.0ml/min。以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d为对照品，建立柴胡总皂苷的指纹图谱，并进行了方法学考察，柴胡总苷HPLC指纹图谱测定方法的精密度、稳定性、重复性均良好,方法简单快速准确,所得图谱能较全面地反映各批柴胡总苷成分的分布特征。该方法可以作为柴胡总苷质量控制的指纹图谱标准。
5.结 语
在对皂苷进行整合总结过程中不难发现，随着科学的发展，对于中药材的研究也从单一的药效到具体每一个成分单体的药理作用；而对于这些有效成分的提取方法也由最传统的溶剂法发展到多样化便捷的提取方法。而在定量鉴别是，高效液相（HPLC）也作为现今最方便实用的方法。相信在现代科技不断的催生下，对于中药的研究和发展必然会日益进步。
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