2008年7月
水生生物学报
ACTAHYDROBIOLOGICASINICA
Vol.32,No.4Jul.,200 8
DOI号:1013724/SP1J1000012008140455
氨氮胁迫下凡纳滨对虾抗病力和副溶血弧菌噬菌体防病效果研究
邱德全 周鲜娇 邱明生
1
2
1
(11广东海洋大学水产学院,湛江 524025;21湛江师范学院生命科学与技术学院,湛江 524048)
摘要:在水体不同氨氮条件下,对对虾抗病力指标和副溶血弧菌噬菌体生物防治效果进行了研究。实验设置
0105mg/L(对照)、0115mg/L低浓度组、0175mg/L低浓度组、1150mg/L中浓度组、3100mg/L高浓度组5个氨氮的
质量浓度作为胁迫组,并在此基础上加入副溶血弧菌设置感染组,加入副溶血弧菌和噬菌体设置噬菌体防治组。在胁迫组,低浓度氨氮使凡纳滨对虾Litopenaeusvannamei血清PO、ACP和SOD活力增强,但是在第14天时所有实验组对虾的THC、血清PO、CAT、ACP、SOD活力均远低于对照组,差异显著(p<0105)。感染组对虾THC、血清PO、
CAT、ACP、SOD活力受到显著影响,各实验组的对虾抗病力指标均低于相对应的胁迫组,差异显著(p<0105)。低
浓度氨氮的噬菌体防治组各项指标与感染组比较差异显著(p<0105),肝胰脏的副溶血弧菌计数的差异显著(p<
0105)。在第14天时,低浓度氨氮防治组指标和感染组差异显著(p<0105),和胁迫组相近。以上结果说明噬菌体
防治弧菌病在水体低浓度氨氮条件下,有更好的效果。关键词:抗病力;副溶血弧菌噬菌体;生物防治;凡纳滨对虾
中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:100023207(2008)0420455207
弧菌病是对虾养殖的主要病害之一。目前,抗生素药物在水产上应用受到限制,病原菌的生物防治日益重要。水体使用噬菌体对对虾体内弧菌有较好的防治效果
[1]
噬菌体,探讨氨氮胁迫对健康对虾和染病对虾的抗病力在噬菌体控制弧菌中的变化,以期为对虾疾病的生物防治提供理论依据。
,但是弧菌病的病原弧菌是一类条
件致病菌,其致病性受宿主的生理状态及水质环境等综合因素的影响较大。因此研究对虾在不同水质条件下体内噬菌体的防治效果和机理,对提高噬菌体生物防治效果有重要意义。
在对虾养殖池中,氨氮是最主要的危害因子之一,它主要以NH3和NH4两种形式存在,其中NH3是主要毒性物质。对虾长期生活在含NH3量较高的水体中,不利于体内氮废物的排泄。若NH3从水体渗入组织液内,就会形成血氨中毒
[2]
+
1 材料与方法
111 实验对虾 体长10—12cm的健康凡纳滨对
虾Litopenaeusvannamei,取自湛江东海岛庵里虾塘,暂养于实验室,养殖海水盐度15,温度28—30℃,pH717—812。
112 菌种 副溶血弧菌由患病凡纳滨对虾体内分
离获得,为本实验室所保存风市场,为本实验室所保存114 实验方法
[6]
。。
113 噬菌体 副溶血弧菌噬菌体分离自湛江市东
[6]
。高浓度的氨
[3]
氮对对虾体内酶的催化作用和细胞膜的稳定性产生严重不良影响,并破坏排泄系统和渗透平衡
。已
[4,5]
11411 实验模型 胁迫实验组设置5个浓度梯度,
有研究表明在高浓度的氨氮长时间作用下,中国对虾的抗病力明显下降,对病原菌的易感性提高
。
有关氨氮胁迫下对对虾抗病力和生物防治关系的影响少见报道,基于此,本实验以凡纳滨对虾Litope2
naeusvannamei为研究对象,利用分离的副溶血弧菌
收稿日期:2007206227;修订日期:2008202217
氨氮的质量浓度分别为0105(对照)、0115、0175、1150、3100mg/L,各梯度用含氮浓度为1g/L的氯化
氨溶液来调节,每天用奈氏试剂法测定氨氮的浓度,及时调整养殖水体中的氨氮浓度,实验期间水温为28—30℃,盐度为15,pH717—812。胁迫实验模型
基金项目:广东省海洋渔业专项资金(粤财农[2004]15号);湛江市科技招标项目(湛财企[2004]4号)资助
作者简介:邱德全(1956—),男,重庆市大足县人;副研究员,博士;主要从事海洋水产病害研究。E2mail:qmsld@163.com通讯作者:周鲜娇,E2mail:zhouxuanjiao@163.com
456 水 生 生 物 学 报32卷
为:每组放置对虾30尾,平均分置于2个海水体积为45L的水箱中,调各实验组的氨氮浓度,分别于第0、第3、第7和第14天时取样。
感染实验组每组放置对虾30尾,平均分置于2个海水体积为45L的水箱中,各组氨氮平均浓度为0105(对照)、0115、0175、1150、3100mg/L,于每个水箱中加入副溶血弧菌,使水体中副溶血弧菌终浓度
7[1,6]
215×10cfu/mL,分别于第0、第3、第7和第14天时取样。
防治实验组每组放置对虾30尾,平均分置于2个海水体积为40—45L的水箱中,各组氨氮平均浓度为0105(对照)、0115、0175、1150、3100mg/L,于每个水箱中加入副溶血弧菌,使水体中副溶血弧菌终
7
浓度215×10cfu/mL,同时在养殖水体中添加噬菌
6[1,6]
体,使其在水体中的终浓度为1×10pfu/mL,分别于第0、第3、第7和第14天时取样。所有实验均做三个平行。
11412 与对虾免疫相关指标的测定 酚氧化酶
[7](PO)活力的测定:以L2多巴为底物,采用王雷等方法进行,以实验条件下每分钟OD490增加01001为一个酶活力单位(U)。血清酸性磷酸酶活力(ACP)测定采用宋善俊[8]化物歧化酶(SOD)活力的测定:采用改进的邻苯三
[9]
酚自氧化法测定;过氧化氢酶(CAT)活性测定:采用钼酸铵比色法测定。11413 对虾血细胞(THC)计数和对虾肝胰脏中副溶血弧菌计数 THC计数:以一次性1mL注射器自头胸甲后插入围心腔取血,按虾血淋巴∶抗凝剂=1∶1之比例,将抗凝剂与血淋巴混合,制成一定稀释倍数的血细胞悬液计数,采用血球计数板计数。
用75%酒精擦试对虾样品表面,然后分离肝胰脏,称重,在灭菌匀浆器中加2mL灭菌PBS匀浆,再用灭菌PBS适当稀释后涂布TCBS琼脂平板计算弧菌数量。115 数据处理 数据均用平均值表示,用多重比较
[9]
法来统计
[10]
。
2 结 果
211 不同实验条件下对虾各体液抗病力指标的测的磷酸苯二钠法进行;血清超氧
定结果氨氮胁迫下的对虾抗病力指标 在第0至第14天,0105mg/L氨氮胁迫组PO、ACP、CAT和SOD的酶活基本保持稳定,可以作为参照。
低浓度氨氮(0115mg/L)条件下PO、CAT和SOD保持不变(图1,图2,图4)。
图1 不同实验条件下血清酚氧化酶活力的变化情况
Fig11 EffectsofdifferentstressesonPOactivitiesintheserumofLitopenaeusvannamei
图2 不同实验条件下血清过氧化氢酶活力的变化情况
Fig12 EffectsofdifferentstressesonCATactivitiesintheserumofLitopenaeusvannamei
4期邱德全等:氨氮胁迫下凡纳滨对虾抗病力和副溶血弧菌噬菌体防病效果研究 457
统计分析表明在第3天和第7天,0175mg/L氨氮使凡纳滨对虾血清PO、ACP和SOD活力增强,分别比对照组高56%、7%和6%;115—310mg/L氨氮对PO酶活明显抑制(图1);310mg/L氨氮对ACP的抑制明显(图3);115mg/L氨氮组的SOD酶活明显升高(图4)。
0175—310mg/L氨氮在实验过程中均表现对CAT的抑制作用(图2)。
(图3)。SOD的变化趋势和ACP类似(图4)。
统计分析表明弧菌和氨氮共同胁迫的感染组对虾血清PO、CAT、ACP、SOD活力受到显著影响,各实验组的对虾抗病力指标均低于相对应的对照组,差异显著(p<0105)。
弧菌和氨氮共同胁迫下噬菌体防治组对虾抗病力指标 统计分析表明噬菌体防治组各实验组在第0至第3天内各项指标和氨氮胁迫组没有显著差异(图124)。噬菌体防治组0105mg/L、0115mg/L和0175mg/L氨氮浓度实验组与感染组比较,在第0至第7天减少了PO、ACP和SOD酶活的增加幅度,在第7至第14天时0175mg/L氨氮实验组各项酶活指标比感染组增加,有显著差异(p<0105)。1150mg/L、3100mg/L氨氮浓度实验组与感染组比较,各项酶活指标差异没有统计学意义。第14天,在氨氮为0105mg/L和0115mg/L时,噬菌体防治组血清CAT、活力比感染组分别高2419%、2414%,ACP活
统计分析表明在第14天时0175—310mg/L氨
氮实验组对虾的THC、血清PO、CAT、ACP、SOD活力均远低于对照组,差异显著(p<0105)。弧菌和氨氮共同胁迫下对虾抗病力指标 在第3天和第7天,在氨氮0105—0175mg/L时,感染组PO的活性增加,高浓度氨氮115—310mg/L明显抑制PO的活性;第14天所有实验组PO的活性受到抑制(图1)。所有感染组CAT的活性迅速下降(图2)。在第3天和第7天,在氨氮0105—115mg/L实验组,ACP均表现为活性增加,310mg/L氨氮实验组明显抑制。在第14天各实验组受到明显抑制力比感染组分别高11714%、19210%,差异显著(p<0105)。图3 不同实验条件下血清酸性磷酸酶活力的变化情况
Fig13 EffectsofdifferentstressesonACPactivitiesintheserumofLitopenaeusvannamei
图4 不同实验条件下血清超氧化物歧化酶活力的变化情况
Fig14 EffectsofdifferentstressesonSODactivitiesintheserumofLitopenaeusvannamei
212 对虾血细胞数和肝胰脏副溶血弧菌的测定结果115mg/L和310mg/L时,对虾THC与氨氮浓度呈负
如图5所示,0105mg/L、0115mg/L氨氮时,胁
迫组对虾THC保持稳定。在氨氮浓度0175mg/L、
相关。统计分析显示在第14天时0175mg/L、115mg/L和310mg/L胁迫组对虾的THC均远低于
458 水 生 生 物 学 报32卷
对照组(0105mg/L氨氮),差异显著(p<0105),提示对虾THC数量受到抑制,即使0175mg/L氨氮,对对虾有显著的长期影响。
在感染组,在第7天时0105、0175、1150、3100mg/L氨氮实验组对虾THC较对照组分别下降了69144%、65124%、65131%、71169%(图5);各感染组的THC指标均远低于相对应的胁迫组,差异显著(p<0105)。
在噬菌体防治组中(图5),第3天和第7天,对虾THC持续下降。在第14天时,除310mg/L氨氮的噬菌体防治组外,各实验组对虾THC比第7天时要高。在310mg/L氨氮的噬菌体防治组,第14天
时THC继续下降。与胁迫组比较,0105mg/L、0115mg/L氨氮的噬菌体防治组的THC下降明显(图5),有显著差异(p<0105),其余实验组没有显
著差异。与感染组比较,除310mg/L氨氮组外其余各噬菌体防治组在各个实验时间内对虾THC数量有显著增加(图5),差异显著(p<0105)。
噬菌体防治组副溶血弧菌数量下降明显(图6),提示噬菌体对对虾体内宿主菌有明显的控制。统计分析表明防治组和感染组比较,除310mg/L氨氮的防治组组外,弧菌计数在其余各实验组有显著差异(p<0105)。
图5 不同实验条件下血细胞数的变化情况Fig15 EffectsofdifferentstressesonTHCofLitopenaeusvannamei
图6 不同实验条件下肝胰脏弧菌数的变化情况
Fig16 EffectsofdifferentstressesonV.parahaemolyticusinthehepatopancreasofLitopenaeusvannamei
3 讨 论
311 氨氮胁迫对虾类抗病酶活指标的影响
相似。即短时期内,亚致死浓度下氨氮突变使凡纳滨对虾血清中的酚氧化酶活力呈升高趋势,而长时间氨氮胁迫均可抑制凡纳滨对虾血清PO活力。以上研究说明氨氮胁迫可能会影响机体的应激反应,使对虾PO活力升高,但长期或高浓度的氨氮胁迫会降低血清PO活力,从而使对虾抗病力降低。
在甲壳动物体内,酸性磷酸酶是吞噬溶酶体的重要组成部分,在血细胞进行吞噬和包囊反应中,会伴有酸性磷酸酶的释放。在本实验中,第3和第7天时0175mg/L组和1150mg/L组对虾血清酸性磷
在虾类体液免疫因子中酚氧化酶在防御外物入侵过程中占有重要的地位。在本文实验中0175mg/L氨氮胁迫组在第3天时对虾血清PO活力为对照组的160%,第7天时为156%,第14天时所有实验组中凡纳滨对虾血清PO活力较对照组均有不同程度的降低。这说明短时期合适浓度的氨氮会增加对虾血清PO活力,使其活力升高,这与孙舰军的研究
[5]
4期邱德全等:氨氮胁迫下凡纳滨对虾抗病力和副溶血弧菌噬菌体防病效果研究 459
酸比0天时略高,但差异不大,第14天时所有实验组ACP活力均比对照组低,且氨氮浓度越高,ACP活力越低。这主要是由于对虾血细胞数减少,其吞噬和包囊作用减弱所致。
过氧化氢酶(CAT)是生物体内保护酶系统中重要的保护酶之一,起着催化H2O2分解,保护生物体组织免受毒害的重要作用。在本实验中,凡纳滨对虾血清CAT活力与取样时间和氨氮浓度均呈负相关,氨氮浓度越高,取样时间越长,CAT活力越低。在氨氮胁迫下CAT活性一直呈下降趋势,其中原因可能是氨氮胁迫造成对虾代谢紊乱。7d以后,对虾体内代谢产生的自由基非常多,以致对虾的抗氧化防御系统不能完全清除体内大量产生的自由基,机体受到氧化损伤,导致对虾体内CAT的合成受阻。
超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内抗氧化防御性功能的酶,它可免除自由基对机体的伤害,它对增强吞噬细胞的防御能力和机体的免疫功能具有重要作用。本实验研究发现在0175mg/L组和1150mg/L组中,对虾血清SOD活力在第3天时较对照组分别高17197%和43138%,第7天时分别较对照组高6110%、37198%,第14天时均较对照组低。3100mg/L组的对虾血清SOD活力在整个实验周期
[11]
数量下降势必降低对虾防御能力。
氨氮胁迫条件下虾类抗病力下降,与此同时会使对虾对病原体的易感性增加,例如氨氮胁迫下中
[5]
国对虾对副溶血弧菌的易感性提高;罗氏沼虾对肠球菌(Enterococcus)的易感性增加,感染肠球菌后
[14]
其死亡率与水体氨氮浓度正相关。当水体中氨氮浓度为5124mg/L时,凡纳滨对虾容易感染溶藻
[4]
弧菌病。在本实验中也证实氨氮浓度升高,使对虾易感染副溶血弧菌,使各种抗病酶活指标和对虾血细胞数量迅速下降。
在本实验中,在低浓度氨氮胁迫下副溶血弧菌感染初期,刺激对虾血清PO、SOD、ACP活力的升高,同时也观察到感染组对虾血细胞数却远低于相对应的胁迫组。这一结果一方面提示该弧菌对对虾血细胞的严重破坏,另一方面也说明机体积极的抗病作用,血细胞吞噬副溶血弧菌,导致血细胞释放PO酶,同时伴随着ACP的释放,SOD的产生。在本
文全部实验过程中,CAT持续下降,是反映细菌感染的明显指标。高浓度氨氮的感染组和在第14天的其他感染组,对虾的各项抗病酶活指标,THC数量远远低于正常情况下健康对虾的免疫指标正常值,直接反应了在高浓度和中低浓度氨氮长期胁迫下,虾类的免疫力降低,对病原菌的易感性增加,病原菌致病性加强。313 氨氮胁迫直接影响噬菌体防治弧菌感染效果
噬菌体又称为细菌病病毒。噬菌体治疗作为细菌病的一种治疗方法受到了医学界的一定重视。在
[15]
水产养殖业中,李太武等用噬菌体对皱纹盘鲍脓
[16]
疱病进行了生物防治研究;Park,etal1喂食含特异性噬菌体的食物能有效地清除造成养殖鱼细菌性腹水病的病原菌Pseudomonasplecoglossicida;Nakai,将鱼口服针对Lactococcusgarvieae的噬菌
体,发现该噬菌体对鱼有保护作用。在虾类使用益
[18]
生芽孢杆菌较多,使用噬菌体对细菌病的防治的文献很少,而从免疫学方面研究噬菌体对细菌病防治的影响未见文献报道。
etal1
[17]
中都呈下降趋势。而中国对虾生活在氨氮浓度215mg/L水体中,20d后,对虾SOD活力下降了
[5]
1511%。在本实验当中,短时期内活性氧自由基的增加导致SOD活力的增高。但长时期氨氮胁迫会抑制对虾SOD酶活力,从而导致对虾代谢紊乱,对虾体内会出现自由基量过多,这样势必会扰乱和破坏对虾体内重要生化过程,使对虾的正常的生理
[12]
功能失调,体内免疫水平下降。因此,本实验研究结果进一步表明:即使凡纳滨对虾在较低浓度氨氮胁迫的环境中长时间生活,其抗病力也会逐渐下降。312 抗病酶活指标和对虾血细胞数目反应了弧菌
感染的进程
甲壳动物血液的总血细胞数可作为衡量对虾免
[13]
疫力高低的指标。孙舰军、丁美丽的研究显示在氨氮浓度为215mg/L时,20d时,中国对虾血细胞数
[5]
目比对照组减少了6614%,LiuCH,etal1研究表明高浓度氨氮时对虾血细胞数均低于氨氮为
[4]
0101mg/L的对照组。在本实验中也证实氨氮浓度的升高能使对虾血细胞数减少,实验时间越长,氨氮浓度越高,血细胞数下降幅度越大。对虾血细胞
本实验的研究结果表明在氨氮和副溶血弧菌双重胁迫下,第7天时各感染组THC数迅速降低,0105、0115、0175、1150和3100mg/L实验组对虾THC较氨氮胁迫组分别下降了69144%、65124%、65131%、71169%。在同样的条件下,水体中添加噬菌体,尽管实验初期对虾血细胞数也下降,但是第7天时0105、0115、0175、1150、3100mg/L氨氮的防治
460 水 生 生 物 学 报32卷
组对虾THC较氨氮胁迫组分别下降了39182%、27107%、34101%、36162%,下降幅度明显减少。总
whiteshrimpLitopenaeusvannameianditssusceptibilitytoVibrio
alginolyticus[J].Fish&ShellfishImmunology,2004,(16):
的说来,和氨氮胁迫下的感染组比较,在加入噬菌体后,噬菌体防治组的副溶血弧菌的致病性受到抑制,在低浓度氨氮条件下,这种效果更明显。我们认为这主要是因为噬菌体有效清除副溶血弧菌,减少了副溶血弧菌对对虾血细胞的伤害。
第14天时0105、0115、0175、1150mg/L防治组对虾THC比第7天时增加了91111%、6178%、19129%,提示对虾逐渐恢复正常。但3100mg/L氨
321—333
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氮防治组在第14天THC继续下降,这正与上面研究氨氮浓度对健康对虾的THC的影响结果相符合,即高浓度的氨氮对对虾影响显著,使凡纳滨对虾血细胞数减少,抗病酶活指标下降,严重影响噬菌体的防治效果。
从本文噬菌体防治组实验中对对虾肝胰脏副溶血弧菌检测看,病原宿主菌得到控制,除氨氮310mg/L实验组,其余的感染组和防治组差异显著。
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这一结果和THC以及酶活指标反应的情况不一致。副溶血弧菌作为条件性致病菌,感染的数量有重要意义,对虾抗病指标反应的身体状态和能够抵抗的病原菌数量是动态的。因此,在胁迫条件加剧时,稍微增加病原菌数量,就可能导致天平的倾斜,以至于发生疾病。
以上结果说明在对虾体内噬菌体预防弧菌病效应和对虾抗病酶活指标体现的对虾状态密切相关,也提示噬菌体防治对虾弧菌病必须在水质条件良好的前提下能够发挥良好作用。反之,在水质条件较恶劣的情况下,噬菌体的生物防治作用受到限制。参考文献:
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STUDYONANTI2DISEASEABILITYOFLITOPENAEUSVANNAMEIANDTHEBIOLOGICALCONTROLOFVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSBACTERIOPHAGEUNDERSTRESSESOF
AMMONIANITROGEN
QIUDe2Quan,ZHOUXian2JiaoandQIUMing2Sheng
1
2
1
(11GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang 524025;21ZhanjiangNormalUniversity,Zhanjiang 524048)
Abstract:Therelationshipsoftheanti2diseaseabilityofLitopenaeusvannameiandtheeffectsofbiologicalcontrolofbacte2riophagetoV1parahaemolyticuswerestudiedunderdifferentammoniaconditions1The0105mg/L,0115mg/L,0175mg/L,1150mg/Land3100mg/Lammonianitrogenconcentrationgradientsweredesignedasammoniastressexperimentgroups1TheV1parahaemolyticuswasaddedintotheammoniastressexperimentgroups,theinfectionexperimentgroupsweregained1TheV1parahaemolyticusbacteriophagewasaddedintotheinfectionexperimentgroups,thebio2controlexperi2mentgroupsweregained1Intheammoniastressexperimentgroups,0105mg/Land0115mg/Lammonianitrogenwereaddedintotheprophenoloxidase(PO),superoxidedismutase(SOD),catalasehosphatase(CAT)andacidphosphatase(ACP)activitiesintheser2umofL1vannamei1Butatthe14,inalltheammoniastressexperimentgroups,thePO,SOD,CATandACPactivitiesintheserumandthetotalhaemocytecount(THC)inthehaemolymphofL1vannameiwerelessthanthoseinthe0105mg/Lammoniaexperimentgroup1Thedifferencewassignificant(p<0105)1
Intheinfectionexperimentgroups,thePO,SODandCAT,ACPactivitiesintheserumandtheTHCinthehaemo2lymphofL1vannameiwerelessthanthoseintheammoniastressexperimentgroups1Thedifferencewassignificant(p<0105)1
Amongthebio2controlexperimentgroups,inthe0105mg/Land0115mg/Lammoniastressexperimentgroups,thePO,SOD,CATandACPactivitiesintheserumandtheTHCinthehaemolymphofL1vannameiwerebetterthanthoseintheinfectionexperimentgroups,thedifferencewassignificant(p<0105),theV1parahaemolyticuscountinthehaemo2lymphwerelessthanthoseintheinfectionexperimentgroups,thedifferencewassignificant(p<0105)1Atthe14,thePO,SOD,CAT,ACPactivitiesandTHCinthesamegroupsweresimilartothoseintheammoniastressexperimentgroup1
TheresultsshowedthatthebacteriophagecouldcontrolV1parahaemolyticuswellunderlowammonianitrogenconcen2trationconditions1
Keywords:Anti2diseaseability;V1parahaemolyticusbacteriophage;Bio2control;Litopenaeusvannamei
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