(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108795844 A(43)申请公布日 2018.11.13
(21)申请号 201810634895.2(22)申请日 2018.06.25
(71)申请人 深圳市嘉祺生物科技有限公司
地址 518053 广东省深圳市南山区沙河街
道侨城坊11号楼第7层(72)发明人 不公告发明人 (51)Int.Cl.
C12N 5/071(2010.01)A61K 35/33(2015.01)A61P 17/02(2006.01)
权利要求书2页 说明书7页 附图2页
(54)发明名称
用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法及其产品(57)摘要
本发明提供一种用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法，其中，所述方法包括从组织中提取成纤维细胞，通过含成纤维生长因子、维生素E、磷酸-3-O-芸香糖苷和L-乳酸培养获得成纤维细胞，制备的成纤维细胞具有良好的生物学活性，修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构，同时抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成；本发明提供的成纤维细胞将对皮肤瘢痕具有很好治疗和美容效果。
CN 108795844 ACN 108795844 A
权 利 要 求 书
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1.一种用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括组织中提取成纤维细胞，通过含成纤维生长因子、维生素E、磷酸-3-O-芸香糖苷和L-乳酸培养获得成纤维细胞。
所述的成纤维细胞经免疫荧光技术检测，其标志物α平滑肌肌动蛋白、I型前胶原蛋白α1和III型前胶原蛋白α1表达90％以上。
所述成纤维细胞具有如下性能：抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成，同时成纤维细胞修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构；且无瘤性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从组织中提取的成纤维细胞，通过1-500ng/ml成纤维生长因子、1-200ng/ml维生素E、0.1-500μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷和1-500μg/ml L-乳酸的无血清培养基条件下培养获得成纤维细胞。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，制备成纤维细胞的培养条件中，优选地，添加0.1-500μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷和1-500μg/ml L-乳酸。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，制备成纤维细胞的培养条件中，更优选地，添加10-200μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷和10-200μg/ml L-乳酸。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述成纤维细胞来源废弃皮肤、血液和头发毛囊；优选地来源于皮肤。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，废弃皮肤经含2倍青链霉素双抗的1×PBS(pH7.4)洗涤三次后使用1∶1的质量体积比为0.1％的II型胶原酶5-20mL，在4℃冰箱箱中消化过夜；消化后取真皮层组织质量体积比为0.25％胰酶在37℃培养箱中消化4小时，消化后1500rpm离心10分钟，吸弃上清后加入生理盐水重悬，用100μm细胞筛过滤；细胞悬液1000rpm离心10分钟，细胞沉淀用生理盐水重悬洗涤2次后加入无血清培养液(含1-500ng/ml成纤维生长因子、1-200ng/ml维生素E、0.1-500μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷、1-500μg/ml L-乳酸和1×无血清添加物)重悬，苔盘兰染色计数后按1-10×106细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的细胞培养板或培养皿中培养，于37℃，5％CO2培养箱中培养24-72小时；
培养24-72小时后用5ml移液管吸弃培养液，加入新鲜无血清培养液进行换液，细胞培养板或培养皿继续放置37℃，5％CO2培养箱中继续培养；
当成纤维细胞生长融合达到80％以上时进行消化扩瓶，将培养液吸除，取pH值为7.4的1×PBS洗涤一次后加入0.5ml 0.25％胰酶到培养瓶中，消化2-3分钟后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入生理盐水，用5mL移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用生理盐水洗涤一次，加入到同一个15mL离心管中，1000转每分钟离心10分钟收集成纤维细胞；离心后用1mL新鲜培养液重悬，计数，用5mL移液管加入10mL新鲜的无血清培养液，加入到1瓶纤连蛋白包被的培养瓶中继续在37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔2天换一次新鲜培养液；待成纤维细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集成纤维细胞，连续传代3代培养，获得109以上的成纤维细胞，用4ml生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得大量成纤维细胞，放置4℃条件下保存备用；
部分成纤维细胞在40％成纤维细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法，其
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特征在于，取传代培养到1代和10代成纤维细胞倒置显微镜下观察的细胞形态，细胞成梭形生长；体外与增生性瘢痕成纤维细胞共培养实验中抑制了增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成，以及α-SMA和I型胶原蛋白表达，促使其凋亡发生。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述治疗皮肤瘢痕的成纤维细胞，在兔瘢痕模型体内实验中，与单独的成纤维细胞移植和生理盐水对照组相比，抑制I型胶原蛋白和TGF-β1基因表达，以及炎症因子的TGF-β1分泌，对皮肤瘢痕具有显著修复；体内
体外实验表明均无瘤性。
9.一种制备如权利要求1-8任一项所述的用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的试剂盒产品，其特征在于，所述试剂盒包括：
1)成纤维细胞无血清培养基；2)II型胶原酶；3)胰酶；
4)成纤维生长因子、维生素E、磷酸-3-O-芸香糖苷、L-乳酸；5)无血清添加物；6)使用说明书；其中，所述使用说明书包括权利要求1-8任一项所述的的方法。10.一种如权利要求1-9任一项所述的成纤维细胞及其应用。
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说 明 书
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用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法及其产品
技术领域
[0001]本发明涉及一种用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的方法以及通过所述方法获得治疗皮肤瘢痕的成纤维细胞，特别地，本发明涉及从组织中通过体外培养获得成纤维细胞，具有修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构；同时抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成，将有望对皮肤瘢痕达到更佳的治疗和美容效果。背景技术
[0002]皮肤瘢痕为各种创伤后所引起的正常皮肤组织的外观形态和组织病理学改变，肉芽组织经改建成熟形成的纤维结缔组织。皮肤损伤后机体组织过度增生、结缔组织轻度增生或结缔组织轻度增生原因造成的瘢痕形成。目前对于程度比较严重的凹陷性瘢痕、萎缩性瘢痕及增生性瘢痕，手术切除是主要手段，但任何手术方式都不能将瘢痕完全去除，只是最大限度的改善或矫正瘢痕造成的危害，且手术后还宜形成新的瘢痕。对于程度较轻的瘢痕患者，激光、冷冻或放射治疗是比较常用的手段，效果比较好，但易出现色素沉着和并发症的问题。
[0003]生物技术的发展也为皮肤瘢痕治疗提供了新的手段，如研究发现胸腺素β4在瘢痕疙瘩组织中表达减少，可以用来作为其的治疗药物；含活性因子的疤痕修复凝胶具有抗纤维母细胞增生、抗炎症和软化、瘢痕组织的作用，以及玛卡祛疤精华胶和含一些活性因子的玛卡祛疤精华素均有着阻止受损皮肤色素产生变异，恢复皮肤的正常肤色和弹性。这些手段均对皮肤瘢痕治疗起着很好的效果。但针对皮肤瘢痕形成的真正原因，抑制胶原蛋白过度表达和皮肤纤维化，是治疗其关键的问题。
[0004]本发明利用成纤维细胞为蛋白表达载体及其本身的功能，对皮肤瘢痕治疗有着很好的效果。成纤维细胞(Fibroblast，FB)已经用于临床治疗领域，在皮肤整形治疗中取得了很好的疗效，已不存在的免疫排斥、伦理学及致瘤性等方面的限制，具有良好的临床应用前景。因而，本发明利用体外培养技术获得成纤维细胞，具有修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构；同时抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成，并无成瘤性，有望对皮肤瘢痕修复和美容产生更好的效果。
发明内容
[0005]本申请人经过研究发现，作为在皮肤瘢痕形成过程中胶原的合成和降解失调，胶原过度沉积的结果；以致胶原蛋白过量表达，创伤皮肤纤维化和瘢痕形成。[0006]本发明利用成纤维细胞增殖分化和“归巢”的特性，自体成纤维细胞可以修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构；同时其分泌细胞因子将抑制胶原蛋白表达和纤维化的生物学作用及其成纤维细胞本身的功能，改善皮肤局部微环境，
[0007]本发明发明人意外发现通过添加了磷酸-3-O-芸香糖苷和L-乳酸培养对成纤维细胞增殖能力具有很好提升，同时也大大抑制转化生长因子 (transforming growth factor-β，TGF-β)的表达，其与瘢痕过度形成关系最密切，从而成纤维细胞在瘢痕组织中进
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说 明 书
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入受损成纤维细胞中，抑制胶原蛋白表达以及瘢痕过度形成，对病理性瘢痕形成的抑制产生了显著的效果。
[0008]本发明提供了一种用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括组织提取的成纤维细胞，通过含成纤维生长因子、维生素E、磷酸-3-O-芸香糖苷和L-乳酸的培养条件下，提高成纤维细胞发挥更佳的抑制胶原蛋白表达过度表达、阻止成纤维细胞纤维化和改善断裂纤维组织修复，能用于治疗皮肤瘢痕。[0009]所述的成纤维细胞经免疫荧光技术检测，其标志物α平滑肌肌动蛋白、 I型前胶原蛋白α1和III型前胶原蛋白α1表达90％以上。[0010]所述FBs具有如下性能：抑制瘢痕组织成纤维细胞胶原蛋白过度表达和纤维化，抑制炎症反应，修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构；且无瘤性。[0011]本发明所述的用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞，可以体外传代培养，即FBs通过无血清培养液(1-500ng/ml成纤维生长因子、1-200ng/ml维生素E、0.1-500μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷、1-500μg/ml L-乳酸和1×无血清添加物)体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶(含0.05％EDTA)消化传代。
[0012]取传代培养到3代和10代FBs倒置显微镜下观察的细胞形态，具有相似的细胞形态。
[0013]所述用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞对外与增生性瘢痕成纤维细胞共培养实验中抑制了增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成，以及α-SMA 和I型胶原蛋白表达，促使其凋亡发生；在兔瘢痕模型体内移植实验中，与单独的成纤维细胞移植和生理盐水对照组相比，抑制I型胶原蛋白和 TGF-β1基因表达，以及炎症因子的TGF-β1分泌，对皮肤瘢痕具有显著修复；体内体外实验表明均无瘤性。
[0014]本发明还提供一种制备的用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的试剂盒产品，其特征在于，所述试剂盒包括：
[0015]1)成纤维细胞无血清培养基；[0016]2)II型胶原酶；[0017]3)胰酶；
[0018]4)成纤维生长因子、维生素E、磷酸-3-O-芸香糖苷、L-乳酸；[0019]5)无血清添加物；[0020]6)使用说明书；
[0021]本发明还提供所述用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的应用，通过保证了体外培养获得足够数量的成纤维细胞，修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构的功能，同时发挥其对皮肤瘢痕组织成纤维细胞胶原蛋白过度表达和纤维化，，有望用于治疗皮肤瘢痕。
附图说明
[0022]图1为实施例1制备的人成纤维细胞免疫荧光检测α-SMA、COLIα1 和COLIIIα1表达水平
[0023]图2为实施例1制备的成纤维细胞对增生性瘢痕成纤维细胞增殖水平图
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图3为实施例1制备的成纤维细胞对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成结果图图4为实施例1方法制备的兔成纤维细胞移植兔耳瘢痕模型血清中 TGF-β1分泌水
平图
具体实施方式
[0026]本发明提供了一种用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法，其特征在于，从组织中提取的成纤维细胞，通过含成纤维生长因子、维生素E、磷酸-3-O-芸香糖苷、L-乳酸培养获得成纤维细胞，其可修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构，同时抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成，能用于治疗皮肤瘢痕。[0027]本发明所述成纤维细胞来源方便，即废弃皮肤、血液和头发毛囊；优选地来源于皮肤。由于成纤维细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从个体化获得能做到个体化应用。[0028]本发明所述成纤维细胞制备方法，即：废弃皮肤经含2倍青链霉素双抗的1×PBS(pH7.4)洗涤三次后使用1∶1的质量体积比为0.1％的II型胶原酶5-20mL，在4℃冰箱箱中消化过夜；消化后取真皮层组织质量体积比为0.25％胰酶在37℃培养箱中消化4小时，消化后1500rpm离心10分钟，吸弃上清后加入生理盐水重悬，用100μm细胞筛过滤；细胞悬液 1000rpm离心10分钟，细胞沉淀用生理盐水重悬洗涤2次后加入完全无血清培养液(含1-500ng/ml成纤维生长因子、1-200ng/ml维生素E、 0.1-500μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷、1-500μg/ml L-乳酸和1×无血清添加物) 重悬，苔盘兰染色计数后按1-10×106细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的细胞培养板或培养皿中培养，于37℃，5％CO2培养箱中培养24-72小时；
[0029]培养24-72小时后用5ml移液管吸弃培养液，加入新鲜无血清培养液进行换液，细胞培养板或培养皿继续放置37℃，5％CO2培养箱中继续培养；
[0030]当成纤维细胞生长融合达到80％以上时进行消化扩瓶，将培养液吸除，取pH值为7.4的1×PBS洗涤一次后加入0.5ml 0.25％胰酶到培养瓶中，消化2-3分钟后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入生理盐水，用5mL 移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用生理盐水洗涤一次，加入到同一个15mL离心管中，1000转每分钟离心10分钟收集成纤维细胞；离心后用1mL新鲜培养液重悬，计数，用5mL移液管加入10mL新鲜的无血清培养液，加入到1瓶纤连蛋白包被的培养瓶中继续在37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔2天换一次新鲜培养液；待成纤维细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集成纤维细胞，连续传代3代培养，获得109以上的成纤维细胞，用4ml生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得大量成纤维细胞，放置4℃条件下保存备用；
[0031]部分成纤维细胞在40％成纤维细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。[0032]成纤维细胞经免疫荧光技术检测，其标志物α平滑肌肌动蛋白、I型前胶原蛋白α1和III型前胶原蛋白α1表达几乎均为100％。
[0033]取传代培养到3代和10代FBs倒置显微镜下观察的细胞形态，成梭形生长。[0034]本发明所述的无血清培养液为商业上可购买到的，包括BIOWIT无血清培养基、OriCellTM无血清培养基、StemXVivo无血清培养基和无血清培养基等，更优选地使用OriCellTM无血清培养基。
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本发明用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞对外与增生性瘢痕成纤维细胞共培养实
验中抑制了增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成，以及α-SMA和I型胶原蛋白表达，促使其凋亡发生。
[0036]本发明用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞在兔瘢痕模型体内移植实验中，与单独的成纤维细胞移植和生理盐水对照组相比，抑制I型胶原蛋白和TGF-β1基因表达，以及炎症因子的TGF-β1分泌，对皮肤瘢痕具有显著修复；体内体外实验表明均无瘤性。。
[0037]本发明还提供一种制备的用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的试剂盒产品，其特征在于，所述试剂盒包括：
[0038]1)500ml成纤维细胞无血清培养基；[0039]2)104IU/mL II型胶原酶；[0040]3)100ml 0.25％胰酶；[0041]4)10mL 50倍活性组合物：50ng-5μg成纤维生长因子、25ng-5μg维生素E、50μg-250mg磷酸-3-O-芸香糖苷、500μg-250mg L-乳酸；[0042]5)10mL 50倍无血清添加物；[0043]6)使用说明书；[0044]其中，所述使用说明书包括上述的方法。
[0045]本发明还提供所述用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的应用，通过保证了体外培养获得足够数量的成纤维细胞，具有修复断裂纤维组织和抑制炎症反应，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构的功能；抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成，有望用于治疗皮肤斑痕。
[0046]以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。[0047]实施例1人成纤维细胞的制备
[0048]废弃皮肤经含2倍青链霉素双抗的1×PBS(pH7.4)洗涤三次后使用1： 1的质量体积比为0.1％的II型胶原酶(美国Sigma公司购买)5-20mL，在4℃冰箱箱中消化过夜；消化后取真皮层组织质量体积比为0.25％胰酶 (含质量体积比0.02％EDTA)(美国Thermo Fisher公司购买)在37℃培养箱中消化4小时，消化后1500rpm离心10分钟，吸弃上清后加入生理盐水重悬，用100μm细胞筛过滤；细胞悬液1000rpm离心10分钟，细胞沉淀用生理盐水重悬洗涤2次后加入成纤维细胞无血清培养液(含 1ng-100ng/ml成纤维生长因子，美国R&D公司购买；0.5ng-100ng/ml维生素E，美国Sigma公司购买；10-200μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷(康龙化成合成和鉴定)；10-200μg/ml L-乳酸，美国Sigma公司购买；1×无血清添加物，美国Thermo Fisher公司购买)重悬，苔盘兰染色计数后按 1-10×106细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的细胞培养板或培养皿中培养，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48-72小时。更换新鲜含细胞因子的成纤维细胞培养基再连续培养，直到细胞贴壁生长出来。[0049]待细胞生长比较密时，使用0.25％(质量体积比)胰酶进行消化，用 10ml含细胞因子的成纤维细胞培养基重悬后转移到新的重组人纤连蛋白包被的75cm2培养瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养直到生长融合达到90％左右，使用0.25％胰酶进行消化传代培养，即1瓶传代2瓶，补充新鲜含细胞因子的成纤维细胞培养基继续培养，培养到第5代时，成纤维细胞使用0.25％胰酶消化，即获得成纤维细胞，可以重悬至含10％二甲基亚砜的胎牛血清中冻存在液氮中。
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CN 108795844 A[0050]
说 明 书
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取苔盼兰染色计数后的1.0×105FBs细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三
遍，每次5分钟；细胞半干时，覆盖以4％冷的多聚甲醛固定 15分钟，避光；吸去多聚甲醛后，用冰1×PBS洗三遍，每次5分钟； 0.5％Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰1×PBS洗三遍，每次5分钟；与二抗相同宿主的进口胎牛血清(Fems bovine serum，FBS)室温封闭30 分钟；配制一抗用FBS稀释200倍，即兔抗人α平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)、I型前胶原蛋白α1(type I Collagen alpha-1， COL1α1)和III型前胶原蛋白α1(type III Collagen alpha-1，COLIIIα1) 的多抗；分别加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4℃避光过夜。取出细胞复温至室温约1h；冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰1×PBS洗一次，5分钟，于摇床；配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L)TRITC，用1×PBS配制，浓度1∶200；加入二抗，室温孵育1小时(避光)。冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰1×PBS洗一次，5分钟，于摇床。DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。冰1‰Tween 洗两次，每次5分钟，于摇床。冰1×PBS洗一次，5分钟，于摇床。加入防荧光淬灭封片剂，避光。细胞用共聚焦荧光显微镜(德国莱卡公司)上机检测。[0051]图1结果显示，人成纤维细胞经上述免疫荧光检测，A为α-SMA在共聚焦荧光显微镜下观察到的橙红色荧光，与明场下对比其荧光信号几乎为 100％，表明成纤维细胞表达α-SMA阳性率几乎为100％；B和C分别为COLIα1和COLIIIα1在共聚焦荧光显微镜下观察到的橙红色荧光和DAPI 染核蓝光合并图片，与明场下对比其荧光信号几乎为100％，表明成纤维细胞表达COLIα1和COLIIIα1阳性率也几乎为100％。
[0052]实施例2制备的用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的试剂盒产品[0053]用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的试剂盒包括：[0054]1)500ml成纤维细胞无血清培养基；[0055]2)104IU/mL II型胶原酶；[0056]3)100ml 0.25％胰酶；[0057]4)10mL 50倍活性组合物：50ng-5μg成纤维生长因子、25ng-5μg维生素E、5mg-100mg磷酸-3-O-芸香糖苷、5mg-100mg L-乳酸；[0058]5)10mL 50倍无血清添加物；[0059]6)使用说明书；[0060]其中，所述使用说明书包括实施例1-3中描述的方法。
[0061]实施例3人成纤维细胞体外共培养抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖实验[0062]取对数生长期的增生性瘢痕成纤维细胞(从美国ScienCell购买)以3 ×105细胞/孔浓度接种于6孔Transwell培养板(0.3μm，美国Corning 公司)，UltraCULTURETM无血清培养，每孔接种1.5mL，小室加入人成纤维细胞，3×105细胞/室，1.5ml，置37℃、5％CO2培养箱共培养，进行分组。空白对照A组：小室中不加入成纤维细胞共培养(Control)，复孔6 个；实施例1制备的成纤维细胞实验B组：小室中加入正常成纤维细胞(FB) 共培养，复孔6个；以及对比例培养的成纤维细胞对照C组(对比例成纤维细胞采用Abdian N等在《细胞组织银行》2015年10月发表的《在添加成纤维生长因子和不添加的培养基中人真皮成纤维细胞生长速率的比较》的方法进行培养制备的，即Abdian N，Ghasemi-Dehkordi P，Hashemzadeh-Chaleshtori M，et al.Comparison of human dermal fibroblasts(HDFs)growth rate in culture media supplemented with or without basic fibroblast growth factor
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说 明 书
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(bFGF).Cell Tissue Bank.2015 Dec；16(4)：487-95.)：小室中加入正常成纤维细胞(FB)共培养，复孔6 个；体外培养1-7天，于倒置显微镜下观察、照相。[0063]空白对照的细胞伸展良好，有方向性、呈放射状。而正常成纤维细胞实验B组和C组均出现增生性瘢痕成纤维细胞数目减少，突起变短，形状变的不规则，排列显混乱，折光性较弱。
[0064]通过美国Bio-Rad细胞计数仪，根据使用说明书分别在第1天、第2 天、第3天、第4天和第5天检测增生性瘢痕成纤维细胞增殖活性。从图 2中可以知道，空白对照A组和实验B组、对比C组相比，增生性瘢痕成纤维细胞增殖速度更快，两者之间并具有显著的差异(**P＝0.011)；而实验B组和对比C组相比，增生性瘢痕成纤维细胞增殖速度明显降低，两者之间并具有显著的差异(*P＝0.028)，表明本发明制备的成纤维细胞抑制了增生性瘢痕成纤维细胞增殖，促使其凋亡发生。
[0065]实施例4人成纤维细胞体外共培养抑制细胞胶原合成实验[0066]实施例3共培养实验中，将各组每孔取共培养第1天的上清液50μL， 100℃烤干，再加入4mol/L NaOH，120℃、10min，依次加入氯铵T、高氯酸溶液，在65-70℃显色约15min，用Beckman DU-600分光光度计比色，测吸光度值，波长为550nm；羟脯氨酸比色法检测各组细胞的上清液中其羟脯氨酸的含量，分析瘢痕成纤维细胞胶原合成。[0067]图3结果显示：实施例1制备的成纤维细胞对瘢痕成纤维细胞胶原合成有抑制作用，FB实验B组与空白对照A组和对比C组相比，胶原合成均显著降低，分别**P＝0.015和*P＝0.041；两组的实验数据经检验，存在统计学意义。[0068]实施例5兔耳皮肤瘢痕模型皮肤体内实验[0069]购自中山大学动物中心的24只成年家兔，雌雄各半，体质量2.0～2.5 kg，家兔耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)，麻醉后同侧耳腹面均手术切除直径为10～15mm的全层皮肤，刮除软骨膜。每耳两处，各创面间隔15mm以上，创面暴露，待创面上皮化后20d，皮肤瘢痕增生形成，制备成兔耳皮肤瘢痕模型。本模型持续不少于3周。[0070]造模成功后，随机分为A、B和C三组，每组6只，A组为采用实施例1方法制备的FBs移植组，B组为采用对比例方法制备的兔FBs移植组 (FB)，于兔耳皮肤瘢痕两处皮肤进行真皮层皮下注射5×105细胞，体积 50μl；C组为生理盐水对照组(Control)，同样注射50μl生理盐水。
[0071]末次给药后对三组家兔造模耳造模部位及正常右耳做肉眼观察，并取病理活检，以10％福尔马林固定，石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(HE)染色，应用购买北京碧云天生产的苏木素-伊红染色试剂盒按照使用说明书进行，光学显微镜下观察组织学改变。[0072]造模前兔耳颜色粉红、菲薄、柔软，病理分析其上可见清晰的毛细血管，毛囊口排列整齐，造模后第30天，皮肤瘢痕动物模型局部皮肤病理变化是模型成功与否的直接证据，模型制备成功后，取模型处皮肤组织，镜检可见局部皮肤成纤维细胞增殖，胶原纤维增多增粗，致密并排列紊乱，期间有少量炎性细胞。具体兔耳瘢痕组织学变化见下表1。[0073]表1
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注：皮肤瘢痕局部皮肤病理变化分级参考标准为“-”：皮肤组织正常，组织结构完
整；“+”：成纤维细胞增殖，胶原纤维增多增粗，致密并排列紊乱，期间有少量炎性细胞；“++”：成纤维细胞明显增殖，胶原纤维明显增多增粗，致密并排列紊乱，期间有炎性细胞；“+++”：成纤维细胞大量增殖，胶原纤维明显增多增粗，十分致密并排列紊乱，期间有较多炎性细胞。
[0077]表1结果中本发明制备的兔FBs移植治疗兔耳瘢痕模型，在移植后第 14天兔耳瘢痕出现很好的修复，即增生性瘢痕成纤维细胞增殖得到很好的抑制，胶原纤维显著减少变细，组织中炎症细胞液明显减少。同时各组动物模型体内均未发现成瘤现象。[0078]兔耳瘢痕模型使用实施例1所述方法制备的兔FBs体内实验，移植7 天、14天、30天和60天后通过耳中央动脉采集兔外周血，通过1000rpm 离心10分钟后获得血清。使用TGF-β1酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测TGF-β1分泌水平(购自美国R&D公司)，根据美国R&D
公司TGF-β1 ELISA试剂盒使用说明进行检测。图4中兔FBs移植实验A组TGF-β1分泌显著低
于FBs对比B组，*P＝0.039；而FBs对比B组分泌的TGF-β1水平也明显低于生理盐水对照C组，**P＝0.009；表明本发明制备的FBs抑制了兔耳瘢痕模型炎症因子的TGF-β1分泌，有助于兔耳瘢痕炎症反应改善和促进了瘢痕修复。
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图1
图2
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图3
图4
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