工程菌株选育 (2)

工程菌株选育 2011-11-26 08:41 | (分类:默认分类) 第一章 绪论

第一节 工业微生物育种在发酵工业中的地位

第二节 工业微生物育种的进展

工业微生物育种是建立在遗传和变异的基础上的，没有变异，生物界将失去进化的素材；没有遗传，变异也无法积累。通过菌种的选育我们可以提高产品的产量和质量。

一、工业微生物育种技术的发展经历了几个阶段

（一）自然选育：对工业微生物育种有很大的影响。例如

1、在酒精发酵中，推广了自然选育的纯系良种，扭转了酒精生产中的不稳定现象。

2、由于自然突变频率低，单纯依赖自然界存在的微生物群体来进行的自然选育无疑有很大的局限性，进而推进了人工诱变育种的发展。

（二）诱变育种

1、发酵工业中的各种优良高产菌株绝大部分都是诱变育种方法获得的菌株。

2、但是，菌株长期使用诱变剂处理后，会产生诱变剂疲劳效应，所以出现了杂交育种。

（三）杂交育种

1、杂交育种也应当建立在诱变育种的基础上。

2、杂交育种的主要目的在于把不同菌株的优良经济性状集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的上述缺陷，同时杂交还是增加产品新品种的手段之一。

（四）代谢控制育种

1、是以20世纪50年代谷氨酸发酵取得成功为起点的

2、代谢控制育种的活力在于以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量生成和积累。

（五）基因工程育种

第二章 工业微生物育种诱变剂

诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质，称为诱变剂。

它们包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三大类。

第一节 物理诱变剂

物理诱变剂是通常使用物理辐射中的各种射线，较广泛的是紫外线、X射线、γ射线

和快中子。物理辐射分为电离辐射和非电离辐射，都是以量子为单位的可以发射能量的射线。电离辐射在穿过物质时能产生离子，非电离辐射在穿过物质时不能产生离子。

电离辐射（X射线、γ射线），非电离辐射（紫外线）

一、物理诱变剂的生物学效应

1、物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一些列复杂的连锁反应过程。

2、其作用通常分为物理，物理-化学，化学和生物学等几个阶段。

3、辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种类不同而有所差异，电离辐射主要引起DNA上的基因突变和染色体的畸变；非离辐射主要导致形成嘧啶二聚体。

二、非电离辐射—紫外线

（一）紫外线

1、紫外线的有效光谱：紫外线的光谱范围在40～390nm，DNA可以吸收的紫外线光谱为260nm。15W紫外灯管放射出来的紫外线大约有80%的波长集中在这个范围内，诱变效应比30W的好。

2、紫外线的辐射剂量：紫外线的诱变剂量可分绝对剂量和相对剂量

三、电离辐射

电离辐射的照射方法

①直接对平皿上生长的菌落进行照射，②或者用直径6-10mm的打孔器把菌落连琼脂一同取出，置于灭菌平皿内进行照射，③也可制成菌悬液。（取1ml置于试管内并浸入冰水中，从上或侧面或向下进行短时间照射，处理完后把装有菌体细胞的试管继续冰裕2-3 h，因为低温可以降低或抑制修复酶的活性，防止突变体因修复酶的修复而还原为正常细胞

第二节 化学诱变剂

化学诱变剂是一类能对DNA起作用、改变其结构、并引起遗传变异的化学物质。

化学诱变剂种类很多，有无机化合物和有机化合物，本节介绍的化学诱变剂包括四大类：碱基类似物、烷化剂、移码突变剂和其他种类。

一、碱基类似物

碱基类似物是一类和天然的嘧啶嘌呤等四种碱基分子结构相似的物质，是一种既能诱发正突变，也能诱发回复突变的诱变剂。

1、碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU和5-FU为例）

①单独处理：⑴将新鲜斜面的细菌移接到前培养的液体培养基中，培养到对数期，离心除去培养液，加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养8-10h，以消耗其体内的储存物质。⑵将5-BU或5-FU加入到以上饥饿培养的培养液中，使终浓度为25-40µg/ml，混合均匀。⑶取0.1-0.2 ml菌悬液加入到琼脂平板上涂布培养，使之在适宜温度下的生长过程中诱变

处理。⑷培养后挑取单菌落进行筛选。如果处理真菌、放线菌孢子，则要提高5-FU的浓度。

②与辐射线复合处理：菌体先用碱基类似物处理，将它们渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变后的效果比单独更好。

二、烷化剂

烷化剂分单功能烷化剂和双功能烷化剂或多功能烷化剂两大类。①前者仅一个烷化集团，对生物毒性小，诱变效应大；②后者具有两个或多个烷化集团，毒性大，致死率高，诱变效应较差。

（一）烷化剂的性质

烷化剂性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解，大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系很大。

1、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（简称亚硝基胍）

①符号NTG或 NG或MNNG

②NTG有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合诱变营养缺陷型突变株；还可使多基因并发突变。

③处理完毕后，马上把接触过的NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡处理。

④NTG的诱变方法：

1）孢子悬液的制备；2）NTG母液制备；3）混合；

4）终止反应，除去药液，得孢子用无菌水稀释后涂皿。

2、甲基磺酸乙酯（简称EMS）

三、脱氨剂（以亚硝酸为例）

（一）诱变机制

亚硝酸可直接作用于正在复制和未复制的DNA分子，脱去碱基中的氨基变成酮基，改变碱基氢键的电位。

（二）处理方法

四、移码诱变剂

（一）诱变机制

与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。主要包括吖啶黄、吖啶橙、原黄素等化合物。

（二）吖啶黄的性质和使用方法

是淡黄色晶体，微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳定，遇光易分解，须避光保存。

五、羟化剂（以羟胺为例）

羟胺简称HA，常以盐酸羟胺形式存在，为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性，容易吸湿，要密封、干燥保存。

六、金属盐类

用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等，氯化锂比较常用。

单独使用没有明显的诱变效果，常与其它诱变配合处理，称为助诱变剂。

第三章 工业微生物产生菌的分离筛选

菌株分离的定义：是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。

菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离和鉴定几个步骤。

第一节 含微生物样品的采集

一、从土壤中采样

土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方，所以土壤

样品往往是首选的采集目标。

二、根据微生物生理特点采样

（一）根据微生物的营养类型

例如：①森林土：有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，还有丰富的纤维素，适合利用纤维素作为碳源的纤维素酶产生菌生长；②肉类加工厂和饭店排水沟：有大量腐肉、豆类、脂肪类存在，能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；③面粉厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂：容易分离到淀粉酶和糖化酶的菌株④果蔬中：分离果胶酶产生菌。

（二）根据微生物的生理特性

①如筛选高温酶产生菌时，通常要到温度较高的南方、或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；②分离低温酶产生菌时到寒冷的地方，如南北极地区，冰窖、深海中采集样品。

第二节 含微生物样品的富集培养

富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离到所需要的菌株。

第三节 好氧微生物的分离

一、稀释涂布和划线分离法

1、稀释涂布分离法：

①土壤样品以十倍级差稀释，涂平板，待长出单个菌落后，挑取需要的菌落一道斜面培养基上培养。②土壤样品的稀释程度，要看样品中的菌含量多少来进行稀释。

2、划线分离法

①用接种环取部分样品，在培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养备用。

二、利用平皿中生化反应进行分离

（一）透明圈法

1、原理：在平板培养基中，加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。

2、应用：在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶等。

（二）变色圈法

1、原理：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能快速鉴别出来。

2、如筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周

围便会出现绛红色水解圈。

3、在分离产生脂肪酶的菌株时，如以土温为底物，尼罗兰作为指示剂，根据变色圈的大小来判断脂肪酶的活性高低。也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明B为指示剂，以荧光圈来测定。

（三）生长圈法

1、适用范围：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。

2、原理：工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检测菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。

（四）抑菌圈法

1、应用：常用于抗生素产生菌的分离筛选。

2、采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，还能筛选某些酶类。

第四节 厌氧微生物的分离

一、厌氧培养中几种除氧方法

1、加还原剂：分离培养基内加入还原剂，操作时以最快的速度划线分离，然后立即置于事先已抽真空密闭的容器内（充 CO2或N2也可），于适温培养。

2、焦性没食子酸法：焦性没食子酸和NaOH反应除去氧气。操作时将焦性没食子酸放在容器中，把含有厌氧菌样品的培养皿架空放入容器内，然后加入NaOH溶液，立即盖上盖子，并用石蜡或凡士林密封，放到室温下培养。要除去100Ml空气中的氧气需要焦性没食子酸1g和10%NaOH溶液10ml。

3、平皿厌气培养法：将无菌培养皿皿盖内倒上分离培养基，凝固后，皿底一侧放焦性没食子酸固体，另一侧放10%的 NaOH溶液，使二者不接触，准备完毕后，在凝固的琼脂平板上迅速把含厌氧菌样品进行划线，然后盖上皿盖并密封，摇动平皿使焦性没食子酸固体和NaOH溶液混合，发生化学反应，除去皿内的氧气，置室温下培养。

二、红螺菌的分离

1、富集培养：取暴露在日光下富含有机物的淤泥。放适量淤泥于50ml的带玻璃塞的磨口瓶中，加满液体培养基，塞好塞子，隔绝空气。置于30℃的照明箱中培养，通常在3d内可看到深处培养基里和淤泥曝光的一侧呈现微红色的生长物。从微红色处取数毫升的富集培养物，接种于第二瓶的富集培养基中，培养2d。

2、分离培养：①培养基成份和配置；②接种：取富集培养物于分离平板上划线或涂布分离，或用摇管法于柱状培养基中分离。

三、反硝化细菌的分离

1、 富集培养：在富集培养液的试管中分别加少量的海泥或池泥、河泥，在20℃或25-30℃下培养5-15d.若培养液变浑浊，有气泡产生，说明有反硝化细菌生长，或检验其有无氨和亚硝酸产生，则可判定是否有反硝化细菌生长。

2、分离培养：将培养液倾入硅酸胶平板上，于50℃下烘烤至表面无水流动，不宜过干，以免破裂。用富集培养物涂布接种于烘烤后的平板培养基上，于适温、厌氧条件下培养至长出足够大的菌落。观察菌落向台，进行革兰氏染色，油镜下观察其反应及菌体形态。挑取菌落于液体培养基上培养，检验其培养液中有无硝酸盐和亚硝酸盐存在，若硝酸根或亚硝酸根消失，可确定所分离细菌属反硝化细菌。

第五节 野生型目的菌株的筛选和菌株鉴定

一、初筛

（一）平板筛选

①对那些在纯化分离阶段没有采用平皿定性法挑选出来的菌落，即随机挑选的菌株，由于数量很大，又不知是否具有目的产物的生产能力，这时只能首先采取较粗放的检测方法

②菌种选育工作者在初筛时经常使用这种平皿快速检测法，将复杂而费时的化学测定改为平皿上肉眼可见的显色或生化反应，能较大幅度地提高筛选效率，减少工作量。

③平皿法是菌种选育工作者经常使用的方法，由于是固体培养，于液体培养的条件差距较大，筛选效果不一定另人满意。因此如果要采用某种平皿测定法，最好事先与摇瓶培养方法作一些比较试验，比较两种方法结果之间的差距。

（二）摇瓶发酵筛选

由于摇瓶振荡培养法更接近于发酵罐培养的条件，效果比较一致，由此筛选到的菌株

易于推广。因此经过平板定性筛选的菌种可以进行摇瓶培养（费时不如平皿法快速）。

二、复筛

琼脂平板活性测定法，其最大优点是简便、快速。因而在筛选工作量大时具有相当的优越性。该法的不足之处是产物活性只能相对比较，难以得到确切的产量水平，只适用于初筛。通过该法可淘汰85-90%不符合要求的微生物，剩下较好的菌株则需进行摇瓶培养复筛。

三、菌株鉴定：经复筛，目的野生菌株获得后，对菌株要进行鉴定。

第六节 极端环境微生物的分离筛选

（一）采集样品

根据微生物的胜利特性，在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样，极端微生物就是一个典型的例子。

采集样品的方法

（二）样品的富集培养

根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速生长。

（三）菌株分离：（以嗜热菌为例）

嗜热菌是一种耐高温的需氧或厌氧菌，在分离嗜热菌时，往往为了防止固体平板水分蒸发过快，使培养基破裂，可以通过增加培养平板的厚度和增加培养基中琼脂的含量来降低水分的蒸发。

第七节 生物可降解塑料（PHA）菌株的分离筛选

一、生物可降解塑料概况

二、获得生物可降解塑料的微生物途径和菌株分离方法

（一）从自然界分离产生PHA的微生物（介绍两种产PHA微生物的分离和筛选方法）

1、第一种分离方法：从麦田、路边土壤、海滩污泥等地采样

2、第二种分离筛选方法：从不同的油井和长期被原油污染的含油废水及油田土壤采样

（二）利用食品工厂活性污泥产生PHA

三、PHA的合成机制和发酵特点

微生物发酵合成可降解塑料是指微生物把某些有机物作为营养来源，由微生物发酵合成PHA时，在碳源过量和某些营养物质缺乏条件下，许多微生物的正常代谢途径被破坏，在其细胞内合成某些结构的PHA，成为碳源和能量的储存物质。

第四章 工业微生物诱变育种

第一节 诱变育种的试验设计和准备工作

一、诱变前对出发菌株的了解

1、区分不同菌落类型：

2、出现不同菌落类型原因：是由遗传因素决定的。遗传因素造成的不同类型的菌落是一种变异现象，是属不同遗传特性的个体，而且可以遗传给下一代。在实际生产中，不少优良菌种发生退化现象，需要经常进行纯化分离。

在实际工作中常常因为培养基组成或培养条件等的改变，引起菌落形态的变化，同样也会出现不同的菌落类型，暂时造成与遗传因素引起的菌落类型难以分辨的状况，不过由这种非遗传因素产生的“变异”是一种假变异，他们是不能遗传的，当菌种离开这种环境，重新移植到原来培养基和培养条件下，其形态又可恢复原状。

二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关系

首先要多方面考察菌种的生活史，了解它们的形态、生理、生化等生物学特性，以及这些特性与代谢产物合成的关系。

三、了解影响菌种生长发育的主要因素

菌种选育过程中，要不断进行移接、培养，如果不了解试验菌株培养过程中影响其生长代谢的主要因素，那么即使是摆在眼前的高产菌株也因某些因素的干扰而掩盖原有的形态和其他生物学特性。

第二节 诱变育种的步骤和方法

一、诱变剂的处理方式

1、两个以上因子同时处理

2、不同诱变剂交替处理

3、同一种诱变剂连续重复使用

4、紫外线光复活交替处理

5、诱变剂处理时间与诱变效应的关系

二、影响突变率的因素

（一）菌种遗传特性不同（二）菌体细胞壁结构（三）环境条件的影响

第三节 突变株的常规分离与筛选

一、诱变育种的基本环节

二、筛选程序

三、分离和筛选

菌种诱变处理后，分离在琼脂平板上，由一个突变的单细胞或孢子发育为菌落而形成一个变异菌株。突变类型很多，归纳起来有两类：第一类为形态突变株，包括菌落形态、菌丝形态、分生孢子形态；另一类是生化突变株，包括抗性突变性、营养缺陷型、条件致死突变型、产量突变型、糖分解突变型等。

诱变后的突变株常用的筛选方法有两大类：

（一）随机筛选

（一）随机筛选

随机筛选也称摇瓶筛选，主要是随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选。

具体做法是：将诱变处理后的菌体分离在琼脂平板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落移入一支斜面，然后一个斜面的菌体接入一只三角瓶，放置在摇瓶机上振荡培养，根据测定产物活性的高低，决定取舍。

（二）平板菌落预筛

在随机的突变群体中，有益突变率极低。因此，在诱变育种中，育种工作者常常能够根据代谢产物的特异性，在琼脂平板上设计须都巧妙的筛选方法和活性粗测方法。

①根据形态筛选突变株

部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性。

②根据平板菌落生化反应筛选变株

通过琼脂平板上的透明圈、呈色圈、抑制圈及浑浊圈等生化反应来筛选水解酶、有机酸及抗生素等有益代谢产物。

③采用冷敏感菌筛选抗生素变株

冷敏菌可根据菌种选育目的进行选择，可选用那些对抗生素产生耐药性的微生物，也可以筛选至今尚无有效抗生素对付的微生物。

④浓度梯度法

一个菌株合成抗生素的水平与其耐自身产物能力大小有关。野生菌或低产菌总是比高产菌株耐自身抗生素能力差。也就是说，菌株产生抗生素水平受到它自身所产抗生素数量的制约，耐受性越高，抗生素产生能力也就越强。

⑤琼脂块大通量筛选变株

是将生长突变株的平板用打孔器打下琼脂块，转移到生物鉴定平板上进行测定，此方法效率高、筛选量大。

⑥应用复印技术快速筛选变株

应用复印技术从平板上可直接筛选产脂野生株和具有髙脂含量的突变株，是产脂微生物的简便检测方法。

四、摇瓶液体培养

平板菌落筛选是经过平板菌落预筛后，弃去大量低产菌株，被挑选的菌落移入试管，然后在进行摇瓶液体培养，才能逐步地筛选到高产菌株。

五、产物活性测定

活性测定是菌种筛选工作的重要组成部分，也是决定筛选效率的主要因素。

（一）琼脂平板活性圈法

（二）纸片法

（三）琼脂薄层纸片法

第四节 营养缺陷型菌株的筛选

在筛选营养缺陷型菌种中，与之有关的培养基有三类：①基本培养基（MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长所需要的培养基，称基本培养基；②完全培养基（CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称完全培养基；③补充培养基（SM，也称选择性培养基）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基，称补充培养基。

一、营养缺陷型菌株的分离和筛选

（一）营养缺陷型的诱发

适合诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍、紫外线、亚硝酸等。

（二）淘汰野生型菌株

1、抗生素法：常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。

2、菌丝过滤法：真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。

（三）营养缺陷型的检出

野生型细胞和营养缺陷型细胞数量比例发生变化，但还是混合体，需要设法把缺陷性从群体中分离出来：

1、点植对照法；2、影印法；3、夹层法

二、营养缺陷型突变株的应用：代谢控制育种中常用

第五节 温敏突变株的筛选

一、温敏突变株的特性

它们在许可的温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别，在非许可的温度条件下不能生长或微弱生长，表型与野生型不同，这种条件致死突变株即温度敏感突变株。

二、温敏突变株的筛选方法

（一）温敏突变株的诱发

要选择易于引起件及置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚硝酸、紫外线等诱变剂。

（二）富集

1、抗生素法： 2、过滤或离心法

（三）分离筛选：菌体经过富集以后，可以制备一定的稀释度，分离于平板。

常规法：经过富集后的菌体细胞分离在完全培养基上，置于许可温度下培养，当长出菌落之后，用平板影印法经菌落分贝复印到一个完全培养基和两个基本培养基平板上，分成两组，其中取基本培养基一皿为一组，置于许可温度下培养，另一组取完全培养基和基本培养基各一皿，置于非许可温度下培养，培养后观察菌落生长情况。

第六节 抗噬菌体菌株的选育

一、烈性噬菌体及其效价的测定

如果在短时间内能连续完成生活史的五个阶段而实现其繁殖和裂解寄主的噬菌体，称为烈性噬菌体。

1、重层琼脂法

该法是检查、分离噬菌体常用的方法。具体方法：分别配置琼脂为1%和2%的宿主培养基，倒入平皿，制成底层，凝固后待用；在取含噬菌体待测样品0.1mm和宿主的培养液混合，制成一定稀释度，吸取其中0.1mm加入到盛有3-4mm1%琼脂培养基的试管中，充分混匀，立即倒入平皿底层的培养基上，制成重层平板，然后置于宿主适宜的温度下培养16-20h.如有噬菌体时，在重层琼脂的上层形成透明的噬菌斑。（图137页）

2、单层平板法

有时为了大概了解样品中是否存在噬菌体而并不要求计数，可以把重层法简化为单层法，即把待测样品、敏感菌与上层培养基混合，直接倒入平皿制成平板，培养后观察。

3、快速测定法

二、温和性噬菌体及溶源菌

如果侵入宿主后，噬菌体的DNA只整合在宿主的核染色体组上，并长期随宿主DNA的复制而复制，在一般情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解，称为温和噬菌体。

三、抗噬菌体菌株的选育

在微生物发酵工业中，除设备和环境中存在大量噬菌体外，生产菌种也常遭受污染而严重退化。抗噬菌体菌株的选育程度具体方法如下：

1、专一性噬菌体获得和纯化

2、高效价噬菌体原液制备

3、菌株诱发突变和分离

4、液体摇瓶振荡培养

5、进一步考察抗性菌株对周围环境中存在的各种噬菌体的抗性

第五章 工业微生物代谢控制育种

第一节 概论

根据微生物在代谢过程中产生的代谢产物在生活机体内的作用不同，又可将代谢分成初级代谢与次级代谢两种类型。

一、初级代谢产物与初级代谢

通常把微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质称为初级代谢产物。而产生这些物质的代谢体系称为初级代谢。

二、次级代谢产物与次级代谢

次级代谢产物是对产生它们的生物体本省不需要的一种产物，也就是说该产物的生成对维持生命、发育和增殖没有特别关系的蛋白质、酶以及这些酶催化生成的物质称次级代谢产物。

三、初级代谢与次级代谢的关系

从菌体生化代谢角度来说，次级代谢产物其基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的。次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的。

第二节 初级代谢的调节控制

一、酶合成的调节

酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制，这是一种在基本水平上的代谢调节。

（一）酶合成调节的类型

1、诱导

2、阻遏

第三节 次级代谢的调节控制

一、次级代谢产物的诱导调节

次级代谢产物的诱导机制按以下两种方式进行：①诱导物---刺激影响初级代谢造成代谢流的改变---大量生成代谢物②诱导物---次生代谢物合成酶的合成---大量生产次生代谢物。

二、次级代谢产物碳源分解调节

20世纪40年代初期就发现，青霉素发酵过程中，虽然葡萄糖被菌体利用最快，但对青霉素合成并不适宜。而乳糖利用虽然较为缓慢，却能提高青霉素的产量。

三、次级代谢产物氮源分解调节

氮源分解调节是类似于碳源分解调节一类的分解阻遏方式。它主要指含氮底物的酶的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。

四、次级代谢反馈调节

抗生素对自身产物的抑制有一定的规律：抑制特定产生菌合成抗生素所需浓度与生产水平具有相关性，一般产生菌产量高，对自身抗生素的耐受力强，反之则越敏感。

五、磷酸盐的调节

在工业生产中，磷酸盐常常被控制在适合菌体生长的浓度下，即所谓的亚适量。

磷酸盐调节抗生素的生物合成有不同的机制。按效应来说，有直接作用（即磷酸盐自身影响抗生素合成）和间接效应（即磷酸盐调节胞内其他效应剂，进而影响抗生素合成）。

六、细胞膜透性的调节

第四节 代谢调节控制育种

一、组成型突变株的选育

二、抗分解调节突变株的选育

微生物的分解代谢阻遏现象：在初级代谢和次级代谢中都存在，其含义是指代谢过程中酶的合成往往受高浓度的易被迅速分解利用的碳源或氮源抑制。

在实际生产中，最常见的是碳源分解调节、氮源分解调节和磷酸盐分解调节。

（一）解除碳源调节突变株的选育

1、循环培养法：将诱变剂处理后的微生物移接到快速利用的碳源和慢速利用的碳源培养基上进行交替培养，然后筛选需要的突变株。

2、鉴别性培养基：假若筛选抗乳糖分解阻遏的菌株，把诱变后的菌体分离在含有葡萄糖的琼脂平板上，长成菌落后，喷上ONPG，抗分解阻遏的菌落呈显黄色，野生型是白色。

（二）解除氮源分解调节突变株的选育

氮源分解调节主要指含氮底物的酶受快速利用的氮源阻遏次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调节作用。

（三）解除磷酸盐调节突变株的选育

磷酸盐在许多抗生素、有机酸、核苷酸的发酵中，是初级代谢中菌体生长的主要制约因子又是不可缺少的营养成分，但磷酸盐过量存在对合成某些产物是不利的，特别是抗生素。

1、磷酸盐对次生产物的调节机制

2、抗磷酸盐突变株的筛选方法：有两种途径分别在初级代谢和次级代谢进行筛选

三、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用

营养缺陷型在微生物遗传学上具有特殊的地位，不仅广泛应用于阐明微生物代谢途径，而且在工业微生物代谢控制育种中，利用营养缺陷型协助解除代谢反馈调控机制。

（一）在初级代谢调节育种中的应用

（二）在次级代谢调节育种中的应用

四、渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用

渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变型。

其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。

五、抗反馈调节突变株的选育

（一）回复突变引起的抗反馈调节突变株

回复突变是一种可逆性突变，微生物细胞从野生型基因经自然突变或人工诱发突变成有益突变型基因，称为正向突变。突变是稳定的，有时又是可逆的。

当具有突变型基因的个体通过再突变又成为野生型表型，此过程称为回复突变。

（二）耐自身产物突变株选育

自身代谢产物，包括初级代谢产物和次级代谢产物。微生物控制初级代谢产物的反馈机制是相当严格的。

（三）抗终产物结构类似物突变株的选育

所谓结构类似物是指那些在结构上和代谢终产物相似的物质。它们和终产物一样能够和变构酶的调节蛋白结合，起共遏物作用，用酶变构引起反馈抑制，所不同的是，终产物与酶结合是可逆的，而类似物由于不真正掺入细胞结构，酶活性不会恢复，因而是“假反馈抑制”。

第六章 工业微生物杂交育种

第一节 微生物杂交

一、杂交的特点

第一：通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗产物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质的基础，扩大变异范围，使两株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。

第二：通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅客服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳”效应。

第三：通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展。

二、微生物杂交育种基本程序

微生物杂交育种一般程序：选择原始亲本---诱变筛选直接亲本---直接亲本之间亲和力鉴定---杂交---分离到基本培养基或选择培养基培养---筛选重组体---重组体分析鉴定。

三、杂交过程中亲本和培养基的选择

（一）亲本菌株的选择

1、原始亲本：原始亲本是微生物杂交育种中具有不同遗传背景的优质出发菌株，主要根据杂交的目的来选择。

2、直接亲本：在杂交育种中具有遗传标记和亲和能力而直接用于杂交配对的菌株，成为直接亲本。

（二）培养基

四、微生物杂交育种的遗传标记

1、营养缺陷型标记

2、抗性标记

3、温度敏感性标记

4、其他性状标记（菌落形态，可溶色素的含量等）

第二节 放线菌杂交育种

一、放线菌细胞结构与繁殖

二、放线菌杂交概况和原理

放线菌杂交过程

1、结合：

放线菌杂交过程中的染色交换有两种情况，一种是供体部分染色体与受体全部染色体结合，一种是供体部分染色体与受体部分染色体结合，形成重组体组。

2、杂合系和重组体杂合系

部分结合子形成后，在繁殖复制过程中，两种不同基因型的染色体进行一次交换，产生了杂合系，交换后的染色体不是封闭的环状结构而是呈线状，并在染色体末端具有串连的重复体。

3、重组体

从产生的菌落中可检出不同类型重组分离子，杂合系是形成重组体所必须的阶段。

三、放线菌的杂合技术：方法有混合培养法、玻璃纸法和平板杂交法等。

放线菌杂交技术中的混合培养法的操作步骤

（一）直接亲本的要求

①要求携带不同的营养缺陷型或抗性作为遗传标记，②配对亲本最好还带有颜色标记或产量标记。

（二）斜面混合接种：

①在杂交前，取两亲株新培养的成熟孢子或菌丝，重接种到完全培养基斜面，在适温下进行培养，②混合培养时要求生长速度的同步性。

（三）单孢子悬液的制备：

①混合接种的斜面培养后长出一层孢子。待孢子成熟后，加入适量的含0.01%月桂酸钠的无菌水，轻轻刮下斜面孢子，倒入盛有玻璃珠的无菌三角瓶内；②然后离心、洗涤除去完全培养基；③沉淀用无菌水配成孢子悬浮液。

（四）重组体的检出：

①原养型重组体的检出，接种在基本培养基上培养后大菌落为原养型重组体

②杂合系菌落的检出，接种在基本培养基上培养后小菌落为杂合系菌落

③异养型重组体的检出，接种在选择性培养基上生长的为异养型重组体

（五）杂合系分析

①得到的重组体采用影印法进行重组体的鉴定，分别鉴定几种类型的重组体。

②进一步进行摇瓶液体培养，测定代谢产物的生产能力。

第三节 酵母菌的杂交育种

一、酵母菌的细胞结构和菌落形态

二、酵母菌的生活史和繁殖方式

三、酵母菌的杂交

（一）标记菌株的选择

（二）酵母杂交方法

1、子囊孢子的制备：

方法：一采用蜗牛酶处理，水解子囊壁，然后剧烈振荡，释放出子囊孢子，接着加入液体石蜡，摇匀后孢子酒聚集于液体石蜡层；二用蒸馏水洗下斜面的子囊，加入1ml液体石蜡和5g硅藻土，在玻璃匀浆器中研磨10min左右，于4500/min离心10min，破壁后被分离的子囊孢子集中到石蜡层。取含有子囊孢子的石蜡0.05ml，加入15%明胶0.05ml，在琼脂平板上涂布培养，可得到单倍体菌落，移入斜面，经单倍体检验后备用。

2、杂交

第七章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合育种

第一节 原生质体育种

以微生物原生质体为材料的常用的育种方法主要有原生质体再生育种，原生质体诱变育种，原生质体转化育种和原生质体融合育种。无论那种原生质体育种方法，我们都要在菌种对数生长期时，进行菌种原生质体的制备。

一、原生质体再生育种

原生质体再生育种是微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中奋力筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正突变菌株。原生质体再生育种不用任何诱变剂处理，而能产生比常规诱变还高的正变率。

二、原生质体诱变育种

它是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。

三、原生质体转化育种

经过多年研究和探索，已发展了整条染色体DNA或片断DNA转化原生质体和质粒DNA转化原生质体的技术，为实现定向育种的目标和原生质体育种技术开拓了领域。

四、原生质体融合育种

是指双亲本原生质体在促融剂作用下相互接触，融合成一个细胞，然后核融合，最终强制性地将双亲基因组融合，DNA交换、重组并产生新性状。

第二节 细菌原生质体融合育种

一、概述

二、细菌原生质体融合育种技术

（一）培养基与溶液

（二）细菌原生质体融合育种得主要的核心技术在以下三个方面

1、提高细菌原生质体制备率和再生率的方法

2、建立最佳融合体系：PEG4 000～6 000，浓度40%～50%

3、重组子分离模型：建立一个高效、简便的筛选模型

（三）操作方法

第三节 霉菌原生质体融合育种

一、霉菌原生质体融合育种程序

包括亲本菌株的选择和遗传标记；亲本原生质体制备和再生；双亲本原生质体融合；融合体再生和分离；融合子分离和遗传分析。

二、培养基及相关溶液

三、霉菌原生质体融合的步骤

（一）霉菌原生质体制备

①取孢子悬浮液，涂布于平板表面的玻璃纸上培养。

②将培养长出菌丝体的玻璃纸转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻抖动使菌丝体散落在酶液中，取出玻璃纸，轻轻振荡酶解。

③酶解后将酶解液用G-2或G-3砂芯漏斗过滤，使原生质体与破碎菌丝体分开，然后洗涤得到纯化的原生质体。

（二）原生质体融合和再生

①化学融合法：

（1）将带有不同遗传标记的亲本菌株原生质体1：1混合在PEG中融合

（2）融合后离心的沉淀物，将沉淀物用NaCl高渗液洗涤除去PEG，然后保存在NaCl高渗液中

②电融合法：用融合仪在融合室中融合，但对原生质的伤害是不可避免的，所以融合的原生质悬浮液浓度和电流强度都需要摸索。

③检出：保存在高渗溶液下的原生质体融合液分离在各种选择性培养基或者完全培养基或基本培养基上进行检出。

（四）融合重组体分析与鉴定

①细胞和菌落形态：菌落的形态、大小和颜色等。

②DNA含量：采用二苯胺法测定亲本和融合体的DNA含量

③产物：产物的产量的比较

④孢子大小和红外光谱

第八章 微生物基因组改组育种

第一节 微生物基因组改组育种意义和原理

一、基因组改组育种概述

二、基因组改组育种技术的基本方法：

①对出发菌株进行人工诱变，建立一个正突变菌株的突变库

②把突变库中的正突变株制备原生质体，然后进行多亲本原生质体的融合，从中筛选出性状优良的重组体，构建重组体库

③如果一轮筛选不理想还可以进行多次递推式原生质体融合，直至筛选到理性目的菌株。

第二节 基因组改组育种技术及应用实例

一、基因组改组育种技术

二、基因组改组育种技术应用实例

第九章 基因工程育种

第一节 概述

与传统育种方法不同的是，基因工程育种能实现真正意义上的远缘杂交。

广义的基因工程育种包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。

狭义基因工程育种仅指那些以微生物本身为出发菌株，利用基因工程方法进行改造而获得的工程菌，或者是将微生物甲的某种基因导入到微生物乙中，使后者具有前者的某些性状或表达前者的基因产物而获得新菌种。

一、基因工程在微生物育种中的应用

（一）通过基因工程方法生产药物

（二）通过基因工程方法提高菌种的生产能力

（三）通过基因工程方法改进传统发酵工艺]

（四）通过基因工程方法提高菌种抗性

二、基因工程的步骤

①目的基因的获得；②载体的选择与准备；③目的基因与载体连接成重组DNA；④重组体的筛选。

第二节 基因工程载体

载体是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制和表达的运载工具。

一、质粒载体

（一）质粒载体的选择标记：常用的标记是抗生素抗性基因

（二）质粒载体的发展：①首先将载体的长度减少至最小，以扩充载体容纳外源DNA片段的能力；②其次是增加质粒载体内有用的限制酶切点的数目，而且使分布更加合理；③最后在质粒中引入多种用途的辅助序列。

（三）常用质粒载体（pBR322）

二、λ噬菌体载体

（一）λ噬菌体载体的特点

λ噬菌体载体是最早使用的克隆载体，在分子克隆中始终起着重要的作用。

λ噬菌体载体接受外源DNA的能力要比细菌质粒大得多，其最大接受容量可达23kb。

（二）常用λ噬菌体载体

1、λgt11；2、Charon系列载体

三、柯斯质粒载体

在实际工作中还会遇到更大的基因，其DNA长度要超过40kb。对于这种长度的基因，细菌质粒和噬菌体载体都不能将其容纳，必须构建具有更大克隆能力的新型载体。

柯斯质粒就是这类专门用来克隆大DNA片段的人工构建的新载体。

第三节 基因工程所用的酶

基因工程的一个重要方面是将DNA分子进行切割和连接，这方面的工作是由酶来完成的。基因工程所用的酶有很多种类，大致可分为以下几个类型：

一、限制性内切核酸酶

限制性内切核酸酶可特异性地结合于一段特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA，可分为I类、II类和III类。

二、DNA聚合酶

基因工程中的许多步骤都涉及到DNA聚合酶。

1、大肠杆菌DNA聚合酶I

DNA聚合酶I由单条多肽链组成，它起具有3种活性，即5’到3’DNA聚合酶活性，5’到3’及3’到5’外切核酸酶活性，同时它还具有RNA酶H活性，这种活性是大肠杆菌细胞存在所必需的，但在分子克隆中并末用到此活性。

2、 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段

由于大肠杆菌DNA聚合酶I的5’到3’外切核酸酶活性在使用时会降解结合在DNA模板上的引物的5’端，人们利用蛋白酶对该酶作有限的消化，从全酶中除去5’到3‘外切核酸酶活性，而聚合酶活性及3’到5’外切核酸酶活性均不受影响。

3、T4噬菌体DNA聚合酶

三、依赖于DNA的RNA聚合酶

四、连接酶、激酶及磷酸酶

T4噬菌体连接酶主要作用于5’端带磷酸基团的DNA底物。

从T4噬菌体中还分离到一种RNA连接酶，该酶能使含5’磷端末端及3’羟基端的单链RNA供价连接起来。

五、核酸酶

第四节 基因工程的主要步骤

一、DNA的制备：制备完整、纯净、高质量的DNA，是基因工程首要和关键环节。

二、目的基因的产生和分离

从菌体中获得染色体DNA后，必须从中克隆出所需的目的基因。方法有很多，包括早期使用的基因文库法、cDNA文库法和后来发展起来的PCR法。

（一）基因文库法

（二）cDNA文库法

（三）PCR法

1、引物：设计很重要

2、PCR反应可以使DNA模板分子通过数小时的扩增后增加到百万倍以上。

三、DNA的连接

获得目的DNA片段和质粒载体DNA后，要把两种连接起来形成重组体。

四、重组体导入大肠杆菌

把重组的DNA引入到受体细胞，使受体菌转化为具有重组DNA的新的遗传特性，从中筛选出重组转化子。

五、含重组质粒的细菌菌落的鉴定

含重组质粒的筛选和鉴定方法有遗传学直接筛选法和分子生物学间接筛选法。

第十章 分子定向进化育种

本文阐述通过基因定点突变技术和体外分子定向进化技术对酶分子进行改造，把酶分子改造后的信息储存在DNA中，经过基因的克隆和表达，就可通过生物合成的方法不断获得具有新的特性和功能的酶，这些方法相对传统的酶工程通过酶的化学修饰和固定化等方法来改造酶蛋白所需的时间短，目的性和方向性更加明确，而且有些酶的结构和功能研究必须利用现代基因工程密切相关的分子酶工程方法来解决。

现代分子酶工程学对酶蛋白的改造方法分为两大类：一是理性设计，二是非理性设计。

第一节 理性设计

在理性蛋白设计中，一般需要知道目标蛋白质的编码序列以及对应的空间结构、功能和机制等详细资料。在依据所推测的催化部位和催化机理，对氨基酸序列中要突变的位点进行精确设计，然后通过取代、插入或缺失核苷酸序列等方法来改变蛋白质分子中特定的

氨基酸，从而获得与酶特性相关的关键残基和结构元件。

一、寡核苷酸引物介导的定点突变

二、PCR介导的定点突变

第二节 非理性设计----蛋白质分子定向进化技术

在不了解酶分子结构信息、结构和功能之间关系的情况下，通过对酶基因的随机突变和基因片段的重组等方法来构建酶的突变库，然后通过高通量筛选来获得有益突变的方法，称非理性设计。

一、蛋白质分子定向进化的发展

二、蛋白质分子定向进化策略

三、定向进化文库的筛选方法

四、酶分子工程的应用和发展前景

第十一章 高通量筛选技术

在工业微生物育种过程中，无论是传统的诱变育种、杂交育种、现代基因工程育种、及近几年出现的定向进化技术育种，建库后，都要对文库进行筛选。而文库的库容量很大，各个样品的质量参差不齐，具有很大的随机性。本章对近几年出现的高通量筛选技术进行介绍。